Способ идентификации сероваров бактерий рода Leptospira методом MALDI-TOF масс-спектрометрии

Изобретение относится к исследованию бактерий рода Leptospira методом MALDI-TOF масс-спектрометрии для осуществления быстрого типирования их сероваров и может быть использовано в микробиологической практике для типирования сероваров лептоспир, выделенных от больных лептоспирозом людей, инфицированных животных или из окружающей среды.

Серовары являются внутривидовыми таксономическими единицами грамотрицательных бактерий рода Leptospira. Основой серотипирования является О-антиген, входящий в состав липополисахаридов (ЛПС) клеточной стенки грамотрицательных бактерий и отвечающий за их серологическое разнообразие. Типирование сероваров имеет практическое значение, позволяющее определять источник инфекции и осуществлять эпидемиологический контроль над ее распространением.

Известны стандартные способы идентификации сероваров бактерий рода Leptospira, базирующиеся на классических серологических методах, таких как реакция микроскопической агглютинации (РМА) и тест перекрестной агглютинации абсорбции [Эпидемиология, диагностика и профилактика заболеваний лептоспирозами. Методические указания 3.1.1128-02. Минздрав России. Москва 2002, 44 с.].

К недостаткам этого способа следует отнести:

- серотипирование изолятов лептоспир является специализированной процедурой, выполняющейся в референсных центрах;

- большая трудоемкость и большая длительность исследования;

- требует наличия моноспецифических сывороток, получаемых при иммунизации кроликов соответствующими сероварами лептоспир, или мышиных моноклональных антител к О-антигенам;

- к большинству существующих сероваров соответствующие антисыворотки отсутствуют, т.к. патогенные виды Leptospira насчитывают более 250 сероваров, что ограничивает возможности этих методов по типированию эпидемиологически важных штаммов [Cerqueira G.M., Picardeau М.A. Century of Leptospira strain typing. Infect Genet Evol. 2009, 9:760-768].

Альтернативно предприняты попытки применения молекулярно-генетических методов идентификации сероваров, основанных на секвенировании кластера генов в локусе rfb хромосомы, кодирующих ферменты, которые ответственны за синтез и сборку полисахаридных частей ЛПС [Bezerra da Silva, J., Carvalho, E., Hartskeerl, R.A. et al. Evaluation of the Use of Selective PCR Amplification of LPS Biosynthesis Genes for Molecular Typing of Leptospira at the Serovar Level. Current Microbiology 2011, 62: 518-52. doi:10.1007/s00284-010-9738-7].

Однако полученные в настоящее время данные определения полиморфизма генов биосинтеза О-антигенов являются недостаточно убедительными и требуют дальнейшего развития молекулярных методов с целью расшифровки генетической основы антигенного разнообразия ЛПС для идентификации сероваров.

Развитие техники матрично-активированной лазерной десорбции/ионизации времяпролетной (MALDI-TOF) масс-спектрометрии позволило анализировать биологически активные вещества и предложить способы быстрой и точной идентификации микроорганизмов [Holland RD, Wilkes JG, Rafii F, et al. Rapid identification of intact whole bacteria based on spectral patterns using matrix-assisted laser desorption/ionization with time-of-flight mass spectrometry. Rapid Commun Mass Spectrom 1996, 10:1227-32; патенты US 6177266 B1, ЕР 0922295].

Метод основан на мягкой ионизации и десорбции молекул исследуемых образцов микроорганизмов, нанесенных на MALDI пластину с добавлением матрицы, как источника ионов, при воздействии лазерного излучения и с последующим анализом полученных белковых масс-спектров. По сравнению с традиционными или молекулярно-генетическими методами, MALDI-TOF масс-спектрометрия является быстрым, точным и экономически эффективным методом идентификации бактерий и грибов, который стал широко использоваться в рутинных исследованиях клинических микробиологических лабораторий. [Sauer S, Kliem М. Mass spectrometry tools for the classification and identification of bacteria. Nature Rev Microbiol 2010, 8:74-82; Carbonnelle E, Mesquita C, Bille E, Day N, Dauphin B, Beretti J-L, et al. MALDI-TOF mass spectrometry tools for bacterial identification in clinical microbiology laboratory. Clin Biochem. 2011, 44:104-109; Seng P., Drancourt M., Gouriet F. et al. Ongoing revolution in bacteriology: routine identification of bacteria by matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry. Clin Infect Dis. 2009, 49:543-51].

Общими признаками этих способов являются следующие характеристики:

- осуществляют спектрометрию целых бактериальных клеток или клеточных экстрактов в линейном положительном режиме MALDI-TOF масс-спектрометра в диапазоне масса/заряд (m/z) от 2000 до 20000 Da;

- в качестве матрицы используется α-циано-4-гидроксикоричная кислота;

- идентификация микроорганизмов происходит путем сопоставления сгенерированного списка масс пиков исследуемого образца с данными библиотеки эталонных спектров в таксономических базах;

- выявляют уникальный для каждого микроорганизма набор клеточных белков в виде спектральных профилей, представленных преимущественно пиками белков рибосомального происхождения;

- дифференциация бактериальных штаммов осуществляется на уровне рода и вида аналогично методам генотипирования [Rettinger A., Krupka I., K. et al. Leptospira spp. strain identification by MALDI TOF MS is an equivalent tool to 16S rRNA gene sequencing and multi locus sequence typing (MLST). BMC Microbiology 2012, 12:185]

Кроме протеомного подхода получения MALDI-TOF масс-спектрометрических профилей бактерий предложен метод идентификации грамотрицательных бактерий, основанный на анализе профилей эндотоксинов бактерий [патент WO/2014/035270], выбранный за прототип. Этот способ имеет следующие характеристики:

- профили эндотоксинов получают масс-спектрометрией клеточных экстрактов или препаратов бактерий, обработанных протеолитическим ферментом в отрицательном режиме MALDI-TOF спектрометра в диапазоне m/z 700-4000 Da;

- в качестве матрицы используется 2,4-дигидроксибензойная кислота;

- результирующие профили эндотоксинов бактерий состоят из спектральных сигналов неоднородных молекул олигосахаридов сердцевины, являющихся одним из компонентов ЛПС. Различие молекул консервативных олигосахаридов сердцевины ЛПС, в соответствии с данным изобретением, обусловлено нестехиометрическим замещением фосфатными группами, фосфоэтаноламином и остатками сахаров;

- идентификация грамотрицательных бактерий осуществляется путем сравнения профиля эндотоксина, полученного от исследуемого бактериального образца, с эталонными профилями эндотоксинов, занесенных в базу данных.

Данный способ позволяет осуществлять дифференциацию R форм (не содержащие О-антиген) и S форм грамотрицательных бактерий по спектральным сигналам, полученным от олигосахаридов сердцевины ЛПС и липоолигосахаридов (ЛОС), а также внутривидовую дифференциация штаммов грамотрицательных бактерий на уровне хемотипов.

Недостатком прототипа является то, что

- режим отрицательной ионизации MALDI-TOF масс-спектрометрометра не позволяет получать профили полисахаридного компонента ЛПС в спектрах грамотрицательных бактерий, а именно повторяющихся олигосахаридных субъединиц О-антигена, ответственного за серологическую специфичность;

- проводить идентификацию бактерий на уровне сероваров.

Настоящее изобретение относится к идентификации микроорганизмов методом MALDI-TOF масс-спектрометрии, а более конкретно к типированию сероваров бактерий рода Leptospira, которое основано на распознавании О-антигенов, представляющих собой боковые полисахаридные цепи ЛПС клеточных стенок бактерий и состоящих из повторяющихся специфических олигосахаридных субъединиц, которые содержат от 3-х до 6-ти сахаров. Применение данного изобретения позволит расширить круг задач решаемых с помощью MALDI-TOF масс-спектрометрии в области микробиологии, а именно быстрого проведения серотипирования штаммов лептоспир, выделенных от больных лептоспирозом людей и инфицированных животных без использования трудоемких классических серологических методов, что в конечном итоге будет способствовать повышению эффективности эпидемиологического мониторинга заболеваемости лептоспирозом.

Сущность изобретения заключается в получении и анализе спектральных профилей бактерий рода Leptospira, получаемых MALDI-TOF масс-спектрометрией целых бактериальных клеток, нанесенных на MALDI пластину с использованием 2,5-дигидробензойной кислоты в качестве матрицы, в линейном положительном режиме работы спектрометра в диапазоне соотношения масса/заряд 600-6000 Дальтон. Заявляемое изобретение отличается от прототипа тем, что предусматривает определение значений молекулярных масс ионов, повторяющихся О-специфических субъединиц полисахаридных цепей ЛПС, в спектрах референсных штаммов лептоспир в качестве критерия идентификации сероваров. Способ включает в себя приготовление бактериальной пробы для MALDI-TOF масс-спектрометрии, получение спектральных профилей образцов, определение значений молекулярных масс повторяющихся субъединиц в спектральных профилях референсных штаммов лептоспир и идентификацию сероваров изолятов путем сопоставления молекулярных масс субъединиц в их спектральных профилях с таковыми у референсных штаммов. Методика идентификации сероваров бактерий рода Leptospira с помощью MALDI-TOF масс-спектрометрии заключается в следующем:

- образец получают путем прямого нанесения пробы бактериальных клеток исследуемого штамма на MALDI мишень с последующим наслоением поверх пробы 1 мкл ДГБ матрицы, представляющей собой раствор 2,5-дигидробензойной кислоты концентрацией 20 мг/мл 50% ацетонитрила и 2,5% трифторуксусной кислоты в воде;

- образец подвергают спектрометрии в линейном положительном режиме работы MALDI-TOF масс-спектрометра, оснащенного ультрафиолетовым азотным лазером, в диапазоне соотношения масса/заряд 600-6000, соответствующем сигналам получаемых от ионов олигосахаридных субъединиц полисахаридов бактериальной клеточной поверхности;

- получают спектральный профиль образца, представляющий собой сумму ионов, полученных от 500-1000 лазерных вспышек, выполненных в разных местах одной и той же лунки MALDI мишени;

- анализируют полученный спектральный профиль и вычисляют значения молекулярных масс ионов повторяющихся О-специфических субъединиц для каждого образца. Величина молекулярной массы ионов повторяющихся О-специфических субъединиц (М), полученная от референсного штамма лептоспир, считается специфическим маркером серовара, к которому относится референсный штамм;

- идентификацию сероваров лептоспир, выделенных от больных людей, инфицированных животных и из окружающей среды, производят путем сопоставления и нахождения совпадающих значений молекулярных масс ионов повторяющихся О-специфических субъединиц в спектральном профиле исследуемого образца с величинами специфических маркеров сероваров М±1%, полученных от референсных штаммов.

Сущность изобретения поясняется чертежами, где на Фиг. 1 представлены профили масс-спектров четырех референсных штаммов Leptospira spp., относящихся к сероварам pomona (A), mozdoc (Б), castellon (В) и copenhageni (Г), с указанием расположения повторяющихся О-специфических олигосахаридных субъединиц и значений их молекулярных масс ионов для каждого серовара.

Фиг. 2 демонстрирует сравнение спектральных профилей повторяющихся субъединиц полисахаридных цепей О-антигенов у референсного штамма, относящегося к серовару grippotyphosa (А), и штамма, выделенного от больного (Б).

Фиг. 3 демонстрирует сравнение спектральных профилей повторяющихся субъединиц полисахаридных цепей О-антигенов у референсного штамма, относящегося к серовару canicola (А), и штамма, выделенного от собаки (Б).

Примеры вариантов осуществления заявляемого способа:

Пример 1. Определение величин молекулярной массы повторяющихся О-специфических олигосахаридных субъединиц в масс-спектрах референсных штаммов Leptospira spp., относящихся к сероварам pomona, mozdoc, castellon и copenhageni.

Клетки четырех референсных штаммов Leptospira spp. из коллекции Санкт-Петербургского НИИЭМ им. Пастера, используемых в РМА, выращенные в жидкой питательной среде с добавлением 5% сыворотки кролика при 28°С в течение не менее 14 суток, дважды отмывали от среды фосфатно-солевым буфером и деионизированной водой. Образцы клеток из осадков каждой культуры наносили на поверхность лунок 96-местной стальной MALDI мишени (Bruker Daltonik, Германия). После высыхания на образцы наслаивали по 1 мкл ДГБ матрицы. Масс-спектры образцов были получены в режиме положительных ионов спектрометра "Microflex LRF" (Bruker Daltonik, Германия) в диапазоне m/z от 600 до 6000 Да с помощью программного обеспечения "FlexControl" 3.3 (Bruker Daltonik, Германия). Анализ повторяющихся олигосахаридных субъединиц в полученных спектральных профилях и вычисление величин специфических маркеров сероваров осуществляли с помощью программного обеспечения "FlexAnalysis" 3.3. (Bruker Daltonik, Германия). В представленных спектрах (Фиг. 1) в диапазоне m/z от 600 до 6000 Да присутствовали ионы повторяющихся олигосахаридных субъединиц, происходящих от молекул полисахаридных О-антигенов, значения молекулярных масс которых различаются в зависимости от типа серовара. Так, величина специфического маркера серовара pomona (А) составила М=711 Да, что соответствует тетрасахаридной субъединице, для серовара mozdoc (Б) молекулярная масс олигосахаридной единицы составила М=567 Да, что соответствует молекуле трисахарида, а для сероваров castellon (В) и copenhageni (Г) величины М=1015 Да и М=1036 Да соответствуют гексасахарным субъединицам О-специфических полисахаридов.

Пример 2. Идентификация серовара штамма Leptospira spp., выделенного от больного лептоспирозом человека, методом MALDI-TOF масс-спектрометрии.

Спектральные профили образцов бактериальных клеток штамма, выделенного от больного, и референсного штамма, относящегося к серовару grippotyphosa, относительно которого предварительно был серотипирован изолят методом перекрестной агглютинации абсорбции, получали способом, описанным выше в Примере 1. На Фиг. 2 продемонстрировано сравнение спектральных профилей референсного штамма (А) и исследуемого штамма изолята (Б). На представленных спектрах видно, что молекулярная масса олигосахаридной единицы в спектре штамма изолята М=750,5 Да совпадает с величиной М=750±3,7 Да специфического маркера серовара grippotyphosa референсного штамма. Полученное значение молекулярных масс ионов соответствует тетрасахаридной структуре олигосахаридных субъединиц у серовара grippotyphosa.

Пример 3. Идентификация серовара штамма Leptospira spp., выделенного от инфицированной собаки, методом MALDI-TOF масс-спектрометрии.

Спектральные профили образцов бактериальных клеток штамма, выделенного от собаки, и референсного штамма, относящегося к серовару canicola, на уровне которого предварительно был серотипирован изолят методом перекрестной агглютинации абсорбции, получали способом, описанным выше в Примере 1. На Фиг. 3 продемонстрировано сравнение спектральных профилей референсного штамма (А) и исследуемого штамма изолята (Б). На представленных спектрах видно, что молекулярная масса олигосахаридной единицы в спектре штамма изолята М=926 Да совпадает с величиной М=929±4,6 Да специфического маркера серовара canicola референсного штамма. Полученное значение молекулярных масс ионов соответствует пентасахаридной структуре олигосахаридных субъединиц серовара canicola.

Сравнение измеренных значений молекулярных масс ионов повторяющихся субъединиц в масс-спектрах исследуемых образцов с величинами специфических маркеров сероваров референсных штаммов, которые служат в качестве эталонов (таблица 1), позволяет идентифицировать штаммы изолятов на уровне сероваров.