Результат интеллектуальной деятельности: Тест-штамм Leptospira interrogans серогруппы Icterohaemorrhagiae серовара copenhageni для детекции антител к L. icterohaemorrhagiae

Изобретение относится к медицинской микробиологии и представляет собой оригинальный штамм возбудителя лептоспироза, обладающий выраженной антигенной и иммуногенной активностью и используемый как тест-штамм для детекции антител к L. icterohaemorrhagiae.

Лептоспироз регистрируется в России повсеместно, при этом наиболее высокие показатели заболеваемости характерны для Южного, Приволжского, Северо-Западного ФО. Лептоспироз, особенно иктерогеморрагический, относится к категории тяжело протекающих зооантропонозных инфекций с высокой частотой летальных исходов (Майорова C.O., Стоянова Н.А., Токаревич Н.К. Клинико-эпидемиологические особенности лептоспирозной инфекции в Санкт-Петербурге // Эпидемиология и инфекционные болезни. - 2007. - №1. - С. 12-15; Ананьина Ю.В. Лептоспирозы людей и животных: тенденции распространения и проблемы профилактики // Эпидемиология и Вакцинопрофилактики. - 2010. - №2. - С. 13-16).

Для лептоспироза характерен полиморфизм клинических проявлений, в связи с чем клиническая диагностика затруднена, особенно на ранних днях болезни, поэтому лабораторные методы исследования имеют решающее значение.

В серологической диагностике реакция микроагглютинации (РМА) остается «золотым стандартом». Для выявления антител в РМА рекомендован диагностический набор лептоспир (Эпидемиология, диагностика и профилактика заболеваний людей лептоспирозами: методические указания МУ 3.1.1128-02. / Москва; Минздрав России, 2002), в котором для определения антител к L. icterohaemorrhagiae рекомендован эталонный штамм М-20, выделенный в Дании от человека в 1938 году. Этот штамм был выбран за прототип. К недостаткам данного штамма можно отнести: во-первых, потерю ряда антигенных свойств в результате длительного (более 70 лет) культивтрования на искусственной питательной среде (Самохвалов А.П. Антигенные и иммуногенные свойства лептоспир в зависимости от сроков выделения // Эпизоотология, эпидемиология, средства диагностики, терапии и специфической профилактики инфекционных болезней, общих для человека и животных: материалы Всесоюз. конф. - Львов, 1988. - С. 211). Во-вторых, возможная гетерогенность антигенных свойств штаммов лептоспир выделенных на отдаленных друг от друга географических территориях,

Изобретение направлено на получение тест-штамма для выявления антител к L. icterohaemorrhagiae.

Разработанный штамм позволит осуществлять выявление антител к L. icterohaemorrhagiae в крови людей и животных, диагностировать лептоспироз, установить серогрупповую принадлежность возбудителя, вызвавшего заболевание, установить источник инфекции в очаге, а также проводить мониторинг за циркуляцией иктерогеморрагических лептоспир на территории России.

Технический результат: обеспечение наиболее эффективного выявления антител к L. icterohaemorrhagiae, циркулирующих на территории России за счет сохранности штаммом выраженных антигенных свойств, что связано с небольшим числом пассажей на искусственной питательной среде, а также за счет выделения штамма на территории России. В связи с этим предлагаемый штамм может быть использован для серологической диагностики лептоспироза.

Полученный штамм Leptospira interrogans серогруппы Icterohaemorrhagiae серовара copenhageni 350 «Абайдулаев» депонирован в Государственной коллекции патогенных микроорганизмов и клеточных культур «ГКПМ - Оболенск» под номером В-7745. Штамм выделен в Санкт-Петербурге из крови больного умершего от лептоспироза в 2013 году.

Морфологические и физиологические характеристики. Грамотрицательные спирохеты с характерной морфологией и подвижностью, спор и капсул не образуют. Относятся к хемоорганотрофам и гидрофилам, культивируются на жидкой питательной среде. Лаг-фаза длится двое суток, экспотенциальная фаза характеризуется продолжительностью в 6 суток, время генерации 20 ч. В стационарной фазе наибольшая концентрация составляет (5,7±0,2)×10⁷ лептоспир в 1 мл. Культивируются на жидкой фосфатно-сывороточной среде Терских, состоящей из 90% дистиллированной воды, 10% фосфатного буфера (рН=7,2) с добавлением 5% сыворотки кролика. Оптимальная температура культивирования - 28°С.

Генетические характеристики. На основании анализа нуклеотидной последовательности гена 16sRNA заявленного штамма, полученной в ходе секвенирования по Сенгеру, путем сравнения с известными нуклеотидными последовательностями, доступными в базе данных GenBank (www.ncbi.nlm.nih.gov), выявлено сходство с идентичностью 99% с нуклеотидной последовательностью гена 16SrRNA геномовида Leptospira interrogans, что позволяет отнести штамм к данному геномовиду.

Антигенные свойства: реакция микроагглютинации с сывороткой к L. icterohaemorrhagiae положительная в разведении 1:51200.

По сравнению со штаммом-аналогом в настоящем изобретении предлагается свежевыделенный штамм L. icterohaemorrhagiae, выделенный на территории России. Известно, что «свежевыделенные штаммы лептоспир обладают наиболее выраженной антигенной активностью нежели штаммы, выделенные 10-30 лет тому назад»

Изобретение реализуется следующим образом.

Пример 1. Способ получения штамма

Штамм получен путем посева крови больного лептоспирозом человека на жидкую питательную фосфатно-сывороточную среду Терских, состоящую из 90% дистиллированной воды, 10% фосфатного буфера (рН=7,2) с добавлением 5% сыворотки кролика. Культивирование штамма осуществлялось при температуре -28°С в течение 10 суток, с последующим определением серологической принадлежности и генотипированием штамма, изучением его биологических свойств.

Пример 2. Способ применения штамма

Для постановки РМА используют живую культуру L. icterohaemorrhagiae, выращенную на среде Терских с добавлением сыворотки кролика, со сроком культивировавния 7-14 суток. Культура должна иметь хорошую подвижность, накопление 5×10⁷клеток на 1 мл, что соответствует 50-100 лептоспирам в поле зрения микроскопа при увеличении ×400.

Исследуемую сыворотку разводят и титруют в физиологическом растворе, начиная с 1:50 с последующим двукратным разведением. Разведенную сыворотку и живую культуру L. icterohaemorrhagiae смешивают в равных объемах по 50 мкл в лунках полистироловых планшет. После экспозиции в течение 30 минут при комнатной температуре производят учет реакции.

Пример использования штаммов М-20 и «Абайдулаев» для выявления антител к L. icterohaemorrhagiae в крови больных лептоспирозом людей в Санкт-Петербурге.

Предлагаемый штамм, по сравнению с прототипом, позволяет выявлять антитела к L. icterohaemorrhagiae в более высоком разведении сывороток (более высокие титры антител).

Таким образом, заявленный штамм пригоден для детекции антител к L. icterohaemorrhagiae, что позволит диагностировать лептоспироз, установить серогрупповую принадлежность возбудителя, вызвавшего заболевание, установить источник инфекции в очаге, а также проводить мониторинг за циркуляцией иктерогеморрагических лептоспир на территории России.