Способ выращивания факультативно-анаэробных микроорганизмов

Изобретение относится к области профилактической медицины и может быть использовано для улучшения бактериологических исследований в чиповых микробиологических анализаторах.

Классическим методом изучения при бактериальных инфекциях является выращивание бактерий на питательных средах с последующим изучением их биологических свойств [Современная микробиология. Под ред. Й. Ленгерера, Г. Древса, г. Шлегеля. М. - 2005. - 288 с., Пиневич А.В. Микробиология. Биология прокариотов: Учебник. В 3 т. Том 2. СПб: Изд-во С.-Петерб. Ун-та. - 2007. - 331 с.], в том числе - чувствительность к антибиотикам. При этом посев биологического материала осуществляют на плотные и жидкие питательные среды [Методические указания. М: ФБУЗ ФЦГиЭ Роспотребнадзора. - 2008. - 67 с., 6. Справочник бактериолога. 2-е издание, исправленное и дополненное. Москва - 2015. - 196 с.].

Использование плотных питательных сред, разлитых в чашки Петри, объясняется возможностью получения «чистой культуры» при пересевах изолированных колоний с первичных чашек [Приказ Роспотребнадзора от 17.03.08 №88 «О мерах по совершенствованию мониторинга за возбудителями инфекционных и паразитарных болезней»]. Видимый рост большинства факультативно-анаэробных микроорганизмов наблюдается на первичных чашках через 1-2 суток роста в условиях термостата [Гусев М.В., Минсеева Л.А. Метаболизм бактерий. М. - 1992. - 384 с.].

Использование для этого этапа чиповых технологий позволяет сократить время получения предварительного результата о росте бактерий до 6-8 часов. Однако универсальные питательные среды, используемые для посева биологического материала, имеют низкую прозрачность. При изучении бактерий, выросших в чашках Петри, этот показатель не имеет столь существенного значения, как при выращивании их в лунках пористой мембраны на чипе ростового модуля с последующим изучением формирующихся колоний под микроскопом [Шепелин А.П. Сравнительная оценка качества основных питательных сред отечественного и импортного производства. Астраханский медицинский журнал. - 2013. - №1. - С. 21-24, Шепелин А.П., Дятлов И.А. Роль и место микробиологии в решении вопросов модернизации здравоохранения. Аналитический обзор. - Протвино: А-принт ЗАО. - 2012. - 112 с.]. Более того, для успешного выращивания бактерий в порах мембраны из оксида алюминия в течение 6-8 часов необходимо обеспечить качественное заполнение мембранных пор питательной средой и возможность предотвратить высыхание верхней и нижней поверхностей мембраны, расположенных на чипе для выращивания.

Наиболее близким к заявляемому способу выращивания факультативно-анаэробных микроорганизмов является выращивание в чашках Петри с использованием плотных питательных сред (1,3-1,7% агарозы) [Шепелин И.А., Миронов А.Ю., Шепелин К.А. Питательные среды. МУК 4.2.2316-08 Методы контроля бактериологических питательных сред, NCCLS National consensus standard. Quolity control for commercially prepared microbiological culture media; Approved Standard M 22-A, v., 24, 3-rd ed., 1995. - 318 р.]. При этом результаты роста бактерий оцениваются через 16-24 часа визуальным способом, когда формируются уже зрелые колонии микроорганизмов и прозрачность питательной среды не имеет такого первостепенного значения, как при изучении на малой площади питательной среды ювенильных колоний (через 6-8 часов) при увеличении.

Изобретение направлено на разработку способа выращивания факультативно-анаэробных микроорганизмов с использованием питательных сред повышенной прозрачности, позволяющих получать в элементах чипа четкие результаты уже через 6-8 часов, т.е. сокращается время выращивания бактерий и повышается точность получаемого результата о виде бактерии.

По мнению авторов, существующие проблемы можно решить с помощью следующих шагов:

1) Для выращивания бактерий в мембранных порах питательную среду необходимо сделать прозрачной, чтобы при регистрации в проходящем свете с помощью микроскопа растущих колоний их очертания имели четкий контур, а цвет среды не искажал фон объекта микроскопии.

Содержание агарозы в среде для мембраны должно быть около 0,3±0,1% по агарозе, т.к. более плотная среда не успеет заполнить поры мембраны до ее загустения. Нижний слой агара (под мембраной) должен быть также с пониженным содержанием (около 1%), т.к. более плотная среда имеет меньшие прозрачность и скольжение по ней мембраны с биопробой.

Наилучшие результаты получены при использовании в качестве фильтра смеси порошкового древесного угля (производитель «Silcarbon» с размерами частиц порошкового активированного угля не более 0,18 мм) и животного угля (Производитель «Вектор» ГНЦ вирусологии и биотехнологии (Россия)) в соотношении 1:1 с толщиной слоя 0,4-0,5 см, размещенного на поверхности микрокрепированной крафт-бумаги (Performance white SE 80 g/m², Billerud (Швеция)). При этом, помимо увеличения прозрачности среды, фильтрат освобождается от примеси токсичных для большинства видов бактерий жирных кислот.

2) Во избежание высыхания питательной среды в порах мембраны и для дополнительной подпитки бактерий мембрана с заполненными полужидкой средой (содержание 0,3±0,1% агарозы) порами диаметром 5 или 10 мкм накладывается на чип, покрытый слоем 2 мм питательной среды с содержанием 1±0,1% агарозы. При этом путем скольжения мембраны по поверхности чипа со средой достигается тесный контакт двух поверхностей: среды на чипе и мембраны с заполненными средой порами. После нанесения на верхнюю поверхность мембраны жидкой биологической пробы чип закрывается пластиковой крышкой, что способствует поддержанию влажности в ростовой камере и препятствует высыханию среды в порах мембраны до окончания инкубации в термостате при +37°С в течение 6-8 часов, а также создает условия для микроаэрации ростового блока.

Сущность предложенного изобретения сводится к следующему. Для выращивания факультативно-анаэробных микроорганизмов в термостате при +37°С готовят в двух вариантах питательную среду с содержанием 0,3±0,1% агарозы и с содержанием 1±0,1% агарозы для факультативно-анаэробных микроорганизмов. После приготовления среды фильтруют через слой смеси порошкового древесного и животного угля, размещенного на поверхности микрокрепированной крафт-бумаги. В качестве фильтра смеси используют смесь порошкового древесного угля и животного угля. Компоненты берут в соотношении 1:1 с толщиной слоя 0,4-0,5 см. Поры микропористой мембраны заполняют средой с содержанием 0,3±0,1% агарозы. Среду с содержанием 1±0,1% агарозы наливают на чип, на котором после застывания среды размещают пористую мембрану с диаметром пор 5 или 10 мкм, на поверхность которой наносят взвесь бактерий для проведения исследований.

Сущность изобретения поясняется чертежами, где на фиг. 1 показан мясопептонный агар для выращивания бактерий разной степени прозрачности.

Лунка А1 - питательная среда, приготовленная по способу заявителя;

Лунка А2 - среда типа АГВ производства ГНЦПМБ г. Оболенск;

Лунка A3 - среда АГВ производства ЗАО НИЦФ;

Лунка А4 - среда АГВ производства г. Махачкала;

Лунка А5 - среда АГВ, приготовленная в лаборатории из отдельных ингредиентов по прописи.

Изобретение реализуется следующим образом.

Питательную среду для определения чувствительности к антибиотикам (среда АГВ производства г. Махачкала или среда типа АГВ производства ГНЦПМБ г. Оболенск) готовят в двух вариантах: для достижения плотности 0,3±0,1% и 1±0,1% агарозы. После закипания среды фильтруют через смеси порошкового древесного угля (производитель «Silcarbon» с размерами частиц порошкового активированного угля не более 0,18 мм) и животного угля (Производитель «Вектор» ГНЦ вирусологии и биотехнологии (Россия)) в соотношении 1:1 с толщиной слоя 0,4-0,5 см, размещенного на поверхности микрокрепированной крафт-бумаги (Performance white SE 80 g/m², Billerud (Швеция)). После чего среды автоклавируют согласно инструкции к питательной среде. После остывания сред до 45°С к ним добавляют 10% очищенной сыворотки крупного рогатого скота. Среду с содержанием 1±0,1% агарозы наливают на поверхность чипа площадью 1 см² слоем 2 мм, находящейся в стерильном ростовом модуле или стерильной пустой чашке Петри. Дают среде застыть. Тем временем в полужидкую среду с 0,3±0,1% агарозы в условиях ламинара опускают стерильный фрагмент пористой мембраны квадратной формы со стороной 0,5 см с соблюдением стерильности всех проводимых манипуляций. После заполнения мембранных пор (5-10 секунд) стерильным пинцетом достают мембрану, укладывают ее на поверхность чипа с плотной питательной средой. На поверхность мембраны наносят подготовленный жидкий образец изучаемой биопробы. Излишки жидкости отсасывают, используя стерильный наконечник на автоматическом дозаторе. Ростовой модуль закрывают пластиковой крышкой и помещают в термостат на 6-8 часов при 37°С.

Просмотр формирующихся колоний микроорганизмов осуществляют при открытой крышке ростового модуля под микроскопом при увеличении в 630 раз с использованием объектива для работы с объемным изображением. При этом на прозрачном фоне питательной среды четко видны контуры и внутреннее строение сформированных колоний микроорганизмов, имеющих отличительные особенности для представителей разных родов и семейств.

Примеры, подтверждающие результат от реализации способа, представлены в таблице на Фиг. 2.

Как видно из таблицы, представленной на Фиг. 2, среда №1 более прозрачна, чем среда №2 и №3. Поэтому на ее поверхности отчетливо просматриваются формирующиеся колонии бактерий, в которых можно определить, кроме размеров и формы, ее внутреннюю структуру, вплоть до единичных микроорганизмов. Использование более жидкой среды (0,3±0,13% агарозы) для заполнения пор мембраны позволяет заполнить их до момента остывания питательной среды, что дает возможность выращивать бактерии в образовавшихся лунках. При использовании более плотных сред поры мембран не успевают заполниться питательной средой до момента ее загустения, вследствие чего бактерии не могут расти на ее поверхности без питательных веществ. Комбинация двух сред позволяет выращивать колонии бактерий на плоскости в отдельных лунках в течение 6-8 часов.