СПОСОБ ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ ФИБРОЗА ПЕЧЕНИ ПРИ ХРОНИЧЕСКОМ ВИРУСНОМ ГЕПАТИТЕ В И АУТОИММУННЫХ ПОРАЖЕНИЯХ ПЕЧЕНИ

Изобретение относится к медицине, в частности к способам лабораторной диагностики заболеваний печени и может найти применение для уточнения причины фиброза печени в клинико-лабораторных условиях.

Основными причинами развития фиброза печени являются хронический гепатит С и В, хронический алкогольный гепатит, неалкогольный стеатогепатит и аутоиммунные поражения печени. На ранних стадиях развития фиброза печени не отмечается практически никаких клинических проявлений, и лишь морфологическое исследование биоптата печени позволяет обнаружить признаки начинающихся структурных изменений, выражающихся в чрезмерном накоплении внеклеточного матрикса, при этом молекулярный состав измененной соединительной ткани примерно одинаков независимо от этиологии процесса. Накопление коллагена является важной частью развития фиброза, так как коллаген является основным компонентом, формирующим механический каркас. В норме избыточного накопления коллагена не происходит из-за постоянного протеолиза. Повреждающие агенты запускают процесс образования фибрина (являются триггерами фиброгенеза) или чрезмерного синтеза и накопления внеклеточного матрикса. При острых заболеваниях, таких как вирусные гепатиты, фиброгенез контролируется и уравновешивается фибролизом. В случае повторяющихся повреждений процессы фиброгенеза начинают превалировать, и конечным результатом становится фиброз печени [Ивкова А.Н., Никитин И.Г., Сторожаков Г.И. Фиброз печени: от теории к практике, «Лечебное дело» 2003, №1: 60-70].

Аутоиммунные поражения печени (АПП) представляют собой группу заболеваний, основными представителями которой являются аутоиммунный гепатит, первичный билиарный цирроз и первичный, склерозирующий холангит. Распространенность их варьирует по разным данным и может составлять до 50 случаев на 100000 населения, причем в ряде стран отмечен их неуклонный рост [Н. Rautiainen с соавт., 2007, K. Boonstra с соавт., 2012, A. Tanaka с соавт., 2012]. В настоящее время не решен ряд вопросов этиопатогенеза, течения, тактики лечения и прогноза данных заболеваний, не уточнены терминологические аспекты. Аутоиммунные заболевания печени поражают преимущественно лиц трудоспособного возраста, и их быстрое прогрессирование при отсутствии надлежащего лечения, приводящее с инвалидизации и смерти больных, определяет важность проблемы своевременной диагностики. Схожесть клинических, лабораторных и даже морфологических проявлений аутоиммунных заболеваний печени между собой и с другими видами гепатобилиарной патологии обусловливает сложности их дифференциальной диагностики.

Аутоиммунный гепатит (АИГ) - хроническое заболевание печени неизвестной этиологии, характеризующееся перипортальным или более обширным воспалением, и протекающее со значительной гипергаммаглобулинемией и появлением в сыворотке широкого спектра аутоантител. Первичный билиарный цирроз (ПБЦ) - гранулематозный негнойный деструктивный холангит неясной этиологии, поражающий главным образом мелкие внутрипеченочные желчные протоки [Шварц В.Я., Ногаллер A.M., 2013, Christen U., Hintermann E., 2016, Подымова С.Д., 2013].

Вирусные гепатиты - группа инфекционных заболеваний с различными механизмами передачи, характеризующихся преимущественно поражением печени. Относятся к самым распространенным заболеваниям в мире. Вирусные гепатиты вызываются вирусами, относящимися к различным семействам.

Гепатит В - острое инфекционное заболевание, поражающее печень, вызываемое вирусом гепатита В (ВГВ) обладающим высокой тропностью к гепатоцитам и способное переходить в хроническую форму, исходом которого является цирроз печени. Хронизация ГВ происходит у 90% детей, инфицированных при рождении, 25-50% детей, инфицированных в 1-5 лет и 1-5% людей, инфицированных в старшем детском и зрелом возрасте. Более чем у 20% заразившихся в зрелом возрасте больных развивается цирроз или рак печени [Гончикова С.Ч., Убеева И.П., Николаев С.М. Иммунологические аспекты патогенеза вирусных гепатитов, Бюллетень ВСНЦ СО РАМН, 2010, №2 (72): 17-22].

Согласно современным представлениям, при вирусных гепатитах, повреждение печеночной ткани в большей степени является результатом реализации иммунного ответа, а не цитопатического действия вируса. В свою очередь, аутоиммунные заболевания печени напрямую опосредованы деятельностью иммунной системы. Вследствие этого, изучение иммунных механизмов, сопровождающих развитие этих заболеваний, приобретает первостепенное значение. Особую роль в развитии иммунных реакций играют цитокины - регуляторные пептиды иммунной системы. Отдельную группу составляют хемокины - семейство цитокинов, основная функция которых состоит в контроле клеточной миграции. Они участвуют в тканевом гомеостазе, развитии ткани, в частности, в продукции коллагена, ангиогенезе, процессах пролиферации и репарации. При гепатите в печени усиленно продуцируются провоспалительные хемокины, вызывая миграцию лейкоцитов с периферии в печеночную паренхиму, что вызывает активацию иммунных процессов в очаге воспаления [Семенов А.В., с соавт., 2015, Ming-Hui Li, at al, 2017]. Вследствие этого, уровни содержания цитокинов и хемокинов в периферической крови могут служить биомаркерами для различных форм поражений печени.

Согласно современным представлениям, при вирусных гепатитах, повреждение печеночной ткани в большей степени является результатом реализации иммунного ответа, а не цитопатического действия вируса. В свою очередь, аутоиммунные заболевания печени напрямую опосредованы деятельностью иммунной системы. Вследствие этого, изучение иммунных механизмов, сопровождающих развитие этих заболеваний, приобретает первостепенное значение. Особую роль в развитии иммунных реакций играют цитокины - регуляторные пептиды иммунной системы. Отдельную группу составляют хемокины - семейство цитокинов, основная функция которых состоит в контроле клеточной миграции. Они участвуют в тканевом гомеостазе, развитии ткани, в частности, в продукции коллагена, ангиогенезе, процессах пролиферации и репарации. При гепатите в печени усиленно продуцируются провоспалительные хемокины, вызывая миграцию лейкоцитов с периферии в печеночную паренхиму, что вызывает активацию иммунных процессов в очаге воспаления. Вследствие этого, уровни содержания цитокинов и хемокинов в периферической крови могут служить биомаркерами для различных форм поражений печени.

В настоящее время наиболее достоверным методом определения степени фиброза/цирроза печени остается гистологическое исследование материала, получаемого при проведении пункционной биопсии печени [Соринсон С.Н. Вирусные гепатиты в клинической практике. - СПб.: ТЕЗА, 1998. - 331 с.]. Гистологическое исследование позволяет уточнить причину заболевания печени, а также оценить стадию фиброза и индекс гистологической активности, принять решение о тактике ведения больного, оценить естественное течение или эффективность проведенного лечения. Наиболее распространенными и общепринятыми являются полуколичественные способы оценки выраженности индекса фиброза по шкале METAVIR [Poynard Т., Bedossa P., Opolon P. Natural history of liver fibrosis progression in patients with chronic hepatitis C. The OBSVIRC, METAVIR, CLINIVIR and DOSVIRC groups. Lancet. 1997; 349 (9055): 825-832.]. Согласно этой шкале выделяют 5 стадий фиброза (F0-4), где F0 соответствует отсутствию фиброза, a F4 - циррозу печени. К сожалению, биопсия печени, оставаясь «золотым стандартом» определения стадии фиброза, все-таки является инвазивным методом с определенным процентом осложнений, проводится в госпитальных условиях и имеет ряд противопоказаний. Трудности трактовки результатов исследования биоптатов печени связаны с очень небольшим объемом исследуемого материала, не обязательно характеризующим изменения печени в целом, а также с неоднозначными оценками одного и того же препарата, которые дают разные морфологи. Динамическое наблюдение за фиброзом печени с помощью биопсии затруднено ввиду инвазивности метода.

Широко применяют аппаратно-инструментальные методы исследования (УЗИ, МРТ), которые позволяют оценить форму, размеры, структуру органа, наличие или отсутствие объемных образований, провести исследования для косвенной оценки плотности и эластичности ткани печени. Одним из таких методов является ультразвуковая эластография печени. Метод позволяет оценить наличие фиброза печени, генерируя вибрационные импульсы, и по результатам компьютерного анализа судить об изменении эластических свойств печени [Павлов Ч.С., Глушенков Д.В., Ивашкин В.Т. Современные возможности эластометрии, Фибро- и АктиТеста в диагностике фиброза печени, «Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии» 2008; 16 (4): 43-52.]. Однако даже эластография печени, позволяющая с высокой точностью дифференцировать выраженные и тяжелые степени фиброза/цирроза печени, не обладает достаточной чувствительностью при определении и дифференцировании ранних стадий фиброза при ХВГС умеренной и низкой активности, а также не всегда адекватно отражает активизацию процесса. Кроме того, для проведения эластографии требуется специализированное дорогостоящее оборудование.

Известен лабораторный способ дифференциальной диагностики хронического вирусного гепатита и жирового поражения печени у больных с синдромом дислипидемии по активности фермента глутатионредуктазы [Способ дифференциальной диагностики хронического вирусного гепатита и жировой болезни печени у больных с синдромом дислипидемии (RU 2552299), опубликован 2015]. Способ дифференциальной диагностики заключается в следующем: у больных в сыворотке крови спектрофотометрически определяют активность фермента антиоксидантной системы глутатионредуктазы (ГЛР) методом Manso и Wrob-Leveski на спектрофотометре КФК-3-«ЗОМЗ» (Россия, г. Сергиев-Посад) с целью оценки наличия и степени окислительного стресса. Достижение определенного уровня активности фермента указывает на вирусную природу гепатита, иначе - на жировое поражение печени. Недостатком метода является невозможность его использования в дифференциальной диагностики других невирусных форм гепатита.

Известен лабораторный способ дифференциальной диагностики различных форм аутоиммунных заболеваний печени и хронического гепатита С по экспрессии фактора bcl-2 в ткани печени [Способ дифференциальной диагностики аутоиммунных заболеваний печени (RU 2566723), опубликован 2015 год]. Суть метода заключается в определении процентного содержание bcl-2-позитивных эпителиальных клеток в желчных протоках при различных АИЗП и хроническом гепатите С методами иммуногистохимии. Авторами заявлен диапазон значений, характерный для выбранных заболеваний. К недостаткам метода можно отнести дороговизну методов иммуногистохимии и необходимость проведения пункционной биопсии для пациентов.

Наиболее близким по своей сущности к методу, предлагаемому в данном изобретении, является алгоритм оценки степени фиброза печени при хроническом гепатите С с использованием цитокинов CXCL11/ITAC, TNFα и CCL20/MIP-3α [Способ лабораторной диагностики стадии фиброза печени при хроническом вирусном гепатите С (RU 2583939), опубликован 2016]. Способ основан на определении в сыворотке крови содержания цитокинов CXCL11/ITAC, TNFα и CCL20/MIP-3α с последующим проведением ступенчатого дискриминантного анализа, позволяющего диагностировать степень фиброза печени в соответствии с различными шкалами оценки фиброза печени. Данный метод применим только для уточнения стадии фиброза печени, вызванного хроническим гепатитом С, но не другими формами заболеваний печени.

Задача настоящего изобретения заключается в разработке способа дифференциальной диагностики фиброза печени при ХГБ и АПП, который позволяет отнести пациентов с фиброзом печени в различные группы, исходя из этиологии заболевания, благодаря определению трех цитокинов в плазме крови (CCL8/MCP-2, CXCL10/IP-10, IFN γ). Изобретение позволит расширить арсенал средств, используемых для диагностики причин развития фиброза печени.

Поставленная задача достигается тем, что производится взятие образца периферической крови пациента, центрифугирование пробы с отделением плазмы с последующим диагностированием заболевания по содержанию белковых продуктов в плазме крови. Авторами предложено в качестве определяемых белковых продуктов использовать цитокины CCL8/MCP-2, CXCL10/IP-10, IFN γ. Их концентрацию определяют в плазме крови и по соответствию концентрации маркера пороговым значениям диагностируют развитие фиброза печени вследствие наличия ХГВ либо АПП.

Для оценки диагностической ценности анализируемых биомаркеров был проведен анализ характеристической кривой (receiver-operating-characteristic curve-ROC). Были рассмотрены графические изображения характеристических кривых и определены значения площади под кривой - AUC (Area Under the Curve). Данные анализа показали, что самостоятельно ни один из выделенных показателей не обладает высокой чувствительностью, что исключает возможность их изолированного использования с диагностической целью. В результате был применен метод построения деревьев решений в программе JMP 14.0, на основе полученных результатов которого было установлено, что совместное определение трех маркеров CCL8/MCP-2, CXCL10/IP-10, IFN γ является достаточным для оценки причин развития фиброза печени у больных. Значения AUC для трех цитокинов были более 0,7, что говорит об хорошем качестве выбранной модели.

В результате анализа были получены следующие пороговые значения для дифференциальной диагностики хронического гепатита В и аутоиммунных поражений печени: CCL8/MCP-2 - 22,9 пг/мл, CXCL10/IP-10 - 660,57 пг/мл и 376,4 пг/мл, IFN γ - 7,19 пг/мл. Использование данного алгоритма для диагностики стадий фиброза печени позволяет достигнуть чувствительности метода 57-87%, при достаточной специфичности.

Сущность изобретения поясняется чертежом, где на фигуре 1 представлено дерево решений для разделения групп больных с фиброзом печени различной этиологии: ХГБ и АПП.

Изобретение реализуется следующим способом.

Пример 1. Выбор порогового значения содержания цитокинов.

Для расчетов пороговых значений использовали значения содержания цитокинов CCL8/MCP-2, CXCL10/IP-10, IFN γ в группах больных с хроническим гепатитом В и аутоиммунными поражениями печени. Образцы периферической крови забирали в вакуумную пробирку с антикоагулянтом К2 ЭДТА, центрифугировали при 1500 об/мин в течение 10 мин для отделения плазмы, которую отбирали в пробирки типа «Эппендорф», замораживали и хранили при -80°С до проведения эксперимента. Для определения содержания цитокинов в плазме крови использовали технологию мультиплексного иммуноферментного анализа по стандартным методикам согласно инструкциям производителя (Millipore, США). Статистическую обработку проводили с применением программ GRAPH Pad Prism 6.02 и GMP 14.0. Для оценки диагностической ценности анализируемых цитокинов был применен метод построения деревьев решений, на основе полученных результатов которого было установлено, что совместное определение трех маркеров CCL8/MCP-2, CXCL10/IP-10, IFN γ является достаточным для оценки заболевания, вызвавшего развитие фиброза печени у больных.

Оценку проводят по следующему алгоритму: на первой стадии оценивают концентрацию CCL8/MCP-2, при значениях которого ≥22,9 пг/мл пациента необходимо отнести к первой подгруппе с преимуществом ХГВ, при значениях <22,9 пг/мл - ко второй подгруппе, с преимуществом АПП, затем оценивают CXCL10/IP-10, при его значении <660,57 пг/мл для первой подгруппы диагностируют ХГВ, ≥660,57 пг/мл - диагностируют АПП, для второй подгруппы, если значение CXCL10/IP-10<376,4 пг/мл диагностируют ХГВ, при значении ≥376,4 проводят дополнительный анализ IFN γ, если значение IFN γ≥7,19 пг/мл диагностируют ХГВ, а если <7,19 - АПП.

Пример 2. Диагностика причины фиброза печени на основе предлагаемого метода.

Больной М., 56 лет.

Диагноз: хронический вирусный гепатит В (HbsAg(+), HbcorAB(+), HBsAb<10, HbeAb(+), HbeAg (-)), с минимальной степенью морфологической активности. Противовирусную терапию не получал. В апреле 2015 года произведена эластография печени, выявлен фиброз печени первой стадии (F1) по шкале METAVIR. В ходе проведения исследований были получены следующие концентрации биомаркеров: CCL8/MCP-2 - 25,8 пг/мл, IFN γ - 1,8 пг/мл, CXCL10/IP-10 - 357,4. Таким образом, у больного значение CCL8/MCP-2≥22,9 пг/мл, а значение CXCL10/IP-10<660,6 пг/мл, что соответствует фиброзу печени при ХГВ и совпадает с данными серологического исследования.

Больной Н., 38 лет

Диагноз: хронический вирусный гепатит В (HbsAg(+), HbcorAB(+), HBsAb<10, HbeAb(+)), с минимальной степенью морфологической активности. Противовирусную терапию не получал. В сентябре 2015 года произведена эластография печени, выявлено отсутствие фиброза печени (F0) по шкале METAVIR. В ходе проведения исследований были получены следующие концентрации биомаркеров: CCL8/MCP-2 - 14,4 пг/мл, IFN γ - 17,7 пг/мл, CXCL10/IP-10 - 673,0. Таким образом, у больного значение CCL8/MCP-2 <22,9 пг/мл, значение CXCL10/IP-10>376,4 пг/мл, а значение IFN γ>7,19 пг/мл, что соответствует фиброзу печени при ХГВ и совпадает с данными серологического исследования.

Больная П., 54 года.

Диагноз: аутоиммунный гепатит 1 типа. Иммуносупрессивную терапию не получала. В мае 2015 года произведена биопсия печени, выявлен фиброз печени третьей стадии (F3) по шкале METAVIR. В ходе проведения исследований были получены следующие концентрации биомаркеров: CCL8/MCP-2 - 8,3 пг/мл, IFN γ - 4,2 пг/мл, CXCL10/IP-10 - 1833,3. Таким образом, у больной значение CCL8/MCP-2<22,9 пг/мл, значение CXCL10/IP-10>376,4 пг/мл, а значение IFN γ<7,19 пг/мл, что соответствует фиброзу печени при АПП и совпадает с данными серологического исследования.