Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ ОЦЕНКИ ЭФФЕКТИВНОСТИ СЕЛЕКЦИОННОЙ РАБОТЫ НА ОСНОВЕ ПОЛИЛОКУСНОГО ГЕНОТИПИРОВАНИЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ ЖИВОТНЫХ

Изобретение относится к области проведения методов селекции и разведения животных и включает молекулярно-генетический способ оценки селекционных достижений.

Создание синтетических кроссов по методу двух, трех и четырех породного скрещивания является одним из актуальных и перспективных направлений в современном животноводстве, позволяющим искать и находить желательный баланс между продуктивными и адаптивными характеристиками животных. Современные методы оценки эффективности селекционной работы основаны на фенотипических характеристиках, как правило, существенно зависящих от факторов окружающей среды, и их воспроизводства в поколениях, что существенно удлиняет и усложняет селекционный процесс.

Известен метод оценки селекционного уровня показателей продуктивности абердин-ангусского скота с использования генетического маркера тиреоглобулина tg5ct (Заявка: 2016135817, 05.09.2016), включающий совершенствование генофонда маточного поголовья путем отбора коров с учетом применения коэффициента наследственности по генотипу СТ гена TG5. Недостатком прототипа является узконаправленность метода, применяемого исключительно на крупном рогатом скоте с использованием специфичного маркера, который не является информативным и не может быть применим к другим видам сельско-хозяйственных животных.

Из уровня техники известен способ отбора селекционных животных по фенотипу представлен на примере взрослого поголовья овец романовской породы (Заявка: 93020835/15, 1993-04-21. «Способ селекции овец романовской породы»). Для воспроизводства овец романовской породы авторы отбирали животных грубого и крепкого типа конституции и первого типа поведения. Недостатком этого метода является ограниченность данного метода к применению его по отношению к другим видам сельскохозяйственных животных, а так же отсутствие дополнительных исследований по генотипу.

В связи с этим, для более верного суждения о наследственных качествах, генотипических, генетических особенностях и племенной ценности животных, характеристики по их индивидуальным фенотипическим свойствам должны быть дополнены их генетическим «портретом» по высокоинформативным молекулярным генетическим маркерам, позволяющим оценивать консолидированность и генетические взаимоотношения с исходными формами в селекционном процессе.

Целью заявленного изобретения является разработка метода оценки эффективности селекционной работы при создании новых форм животных, позволяющий определить генетическое расхождение и генетическую схожесть полученной конечной формы по отношению к исходным, что упростит и ускорит отбор животных по генетическим дистанциям, наиболее близким к желательной; для выявления уникальных геномных фрагментов, специфичных для конкретной породы, позволяющих получать ДНК маркеры животных с высоким продуктивным и адаптивным потенциалом с целью их дальнейшего племенного разведения.

Техническим результатом является ускорение и повышение точности селекционной работы на основании привлечения к фенотипическим характеристикам генетической оценки высокополиморфных ДНК маркеров с возможностью дальнейшего использования полученной в селекционном процессе новой формы животных в последующем воспроизводстве.

Технический результат достигается тем, что при использовании ISSR-PCR и IRAP-PCR важной частью анализа является правильно проведенная математическая обработка бинарных матриц, полученная по результатам электрофоретического разделения спектров продуктов амплификации. Используя результаты математических расчетов доли полиморфных локусов, полиморфного информационного содержания, индекса Шеннона, показателей EMR и MI, а также расчета генетических дистанций Нея, с дальнейшим подведением итогов методом кластерного анализа, определяются генетические расхождения и генетически близкие формы животных. А именно, производят подбор синтетических олигонуклеотидов, которые являются высокополиморфными по спектрам продуктов амплификации, с последующим электрофоретическим разделением ампликонов, проводят составление бинарной матрицы и ее математическую обработку по следующим формулам: полиморфное информационное содержание, доля полиморфных локусов, индекс Шеннона, генетических дистанций Нея, эффективное мультиплексное отношение и маркерный индекс. На основании их расчета строят дендрограмму по каждому праймеру; путем сравнения показателей полиморфного информационного содержания, эффективного мультиплексного отношения и маркерного индекса выявляют нуклеотидную последовательность, которая дает наивысшие значения представленных показателей, что является высокоинформативными маркерами для последующего генотипирования; на основе полученных дендрограмм, построенных по расчетным показателям генетических дистанций Нея выявляют праймеры, по которым исследуемая группа животных выделяется в отдельную ветвь от остальных, что и является уникальным маркером идентифицирующий необходимую популяцию от других. Проводя подобный анализ ко всем необходимым группам животных можно подобрать олигонуклеотиды надежно характеризующие и идентифицирующие данную популяцию, породу или вид сельскохозяйственных животных.

Представленный ниже способ оценки позволяет уточнять и сокращать время селекционной работы, надежно оценивать популяционно-генетические взаимоотношения между исходными, промежуточными и желательными конечными новыми формами - результатом селекции. Способ позволяет выполнить популяционно-генетическую оценку эффективности проведенной селекционной работы и выявить молекулярные маркеры, сочетание генотипов которых надежно идентифицируют и отличают формы животных, участвующие в селекционном процессе. Для достижения этих целей впервые предлагается использование в качестве геномных «якорей» для геномного сканирования высокополиморфные геномные элементы - фрагменты геномной ДНК, фланкированные инвертированными повторами микросателлитов (ISSR-PCR - Inter Simple Sequence Repeats) и участками длинных концевых повторов эндогенных ретровирусов (IRAP-PCR - Inter-Retrotransposon Amplified Polymorphism). Эффективность такого подхода исследована на основании полилокусного генотипирования (геномного сканирования) исходных форм и трехпородного синтетического кросса кролика «Родник», полученного на основе таких пород, как: белый великан, советская шиншилла и калифорнийская. Все работы выполнялись на базе ФГБНУ НИИПЗК.

Биопробы собирали путем отбора крови в вакуумные пробирки с ЭДТА 3-5 мл из краевой ушной вены в количестве 200 образцов (по 50 образцов крови каждой породы). Экстрагирование ДНК проводили с помощью набора ДНК-М-Сорб («Синтол», Россия) следуя инструкции производителя. Далее выполнялась полимеразная цепная реакция (ПЦР) в амплификаторе Swift Maxi (Esco, Сингапур) с использованием наборов ПЦР-РВ («Синтол», Россия) и синтетических олигонуклеотидов - микросателлитов и участков длинных концевых повторов эндогенных ретровирусов. Фракционирование продуктов амлификации проводили в 1,5% агарозном геле в 1X ТАЕ буфере. Гель анализировали под ультрафиолетовыми лучами и фотографировали в системе фотогельдокументации Quantum-ST4 (Vilber Lourmat, Франция).

На основе полученных спектров ампликонов (95 локусов всего, из которых 66 были полиморфными, а 29 - консервативными) составлены бинарные матрицы по каждому праймеру в отдельности. С помощью программы GenAIEx версии 6.503 выполнен расчет на основании полученных бинарных матриц генетических дистанций М. Нея (Nei, 1972) и индекса Шеннона. Оценки полиморфного информационного содержания (PIC - Polymorphic Information Content), доли полиморфных локусов (ДПЛ), а также параметры EMR (Effective Multiplex Ratio - Эффективное мультиплексное отношение) и MI (Marker Index - Маркерный индекс) выполнялись вручную.

Полиморфное информационное содержание определяет ожидаемую частоту гетерозигот для маркеров с доминантным характером проявления.

Индекс разнообразия Шеннона основан на теории информации, т.е. его значение определяется вероятностью наступления цепи событий. Результат выражается в единицах неопределенности, или информации. Расчеты этого индекса предполагают, что особи попадают в выборку случайно из неопределенно большой генеральной совокупности, причем в выборке представлены все виды генеральной совокупности.

Метод М. Нея позволяет анализировать эволюционные изменения между разошедшимися генофондами за большой промежуток времени, когда важное значение имеет кумулятивный эффект мутаций. В литературе имеются данные, свидетельствующие о том, что D (генетическая дистанция М. Нея) варьирует в пределах 0.00-0.05 между географическими популяциями и породами; 0.02-0.20 между подвидами; 0.1-2.0 между видами, а генетическое расстояние между родами превышает 1. Очевидно, что представленные значения могут варьировать в зависимости от таксономической принадлежности исследуемых животных, а также от используемых для расчета генетических расстояний генотипируемых геномных элементов.

Параметры EMR и MI широко используются в многочисленных исследованиях с целью выявления информативного потенциала молекулярных маркеров. Данная система позволяет просчитать соотношение между уровнем обнаруженного полиморфизма и общей характеристикой эффективности маркерной системы по выявлению множественных полиморфизмов.

Выполнен сравнительный анализ генетических структур трех пород кроликов и синтетического кросса на основании оценок полиморфизма суммарно 95 фрагментов ДНК различной длинны, полученных в спектрах продуктов амплификации с использованием в PCR в качестве праймеров фрагментов длинный концевых повторов эндогенных ретровирусов (Sabrina 111, Sabrina 1336, Bare 123A), ДНК-транспозона (Helitron), а так же фрагменты ДНК фланкированные инвертированными повторами микросателлитов ((AGC)₆T, (TGC)₆G, (АСС)₆С, (GTC)₆С, (GCT)₆С, (АСС)₆Т, (GAG)₆C, (ACC)₆G, (СТС)₆С).

Из расчетов доли полиморфных локусов установлены наиболее полиморфные молекулярные генетические маркеры, так, маркерами для породы калифорнийская в связи с высоким полиморфизмом могут быть Bare 123А (ДПЛ=75), Sabrina 1336 (ДПЛ=71,42) и (GTC)₆C (ДПЛ=71,42); для породы советская шиншилла - (СТС)₆С (ДПЛ=71,42) и Bare 123А (ДПЛ=75); для породы кроликов белый великан наивысший показатель полиморфизма выявлен по праймеру Bare 123А (ДПЛ=75) и (СТС)₆С (ДПЛ=71,4), исследование спектров продуктов амплификации синтетического трехпородного кросса «Родник» наивысшие показатели ДПЛ наблюдали по праймерам Sabrina 11 и Bare 123А (ДПЛ=62,5 и 75 соответственно).

Полиморфное информационное содержание по «якорным» маркерам при геномном сканировании варьировало в широких пределах от 0.19 до 0,50 (на примере PIC у породы белый великан), рекомендуется использовать для каждой породы именно ту совокупность геномных «якорей», которая формировала наиболее породоспецифичный комплексный генотип для дальнейшего полилокусного генотипирования для получения наивысших показателей генетических расстояний между группами контролируемых животных.

Пример 1. По проведенным подсчетам генетического расстояния Нея (D, Nei, 1972 г.), с использованием программы GenAlEx 6.503, самая большая дистанция среди исследованных молекулярных генетических маркеров у синтетического кросса была с Калифорнийской породой по праймерам (GCT)₆C - 0,3777; (АСС)₆С - 0,1519 и транспозоном Sabrina 1336 - 0,1299. Самое малое же расстояние синтетического кросса по отношениям к исходным породам было обнаружено у породы белый великан по праймерам (AGC)₆T - 0,0091, (TGC)₆G - 0,0009, Sabrina 1336 - 0,0044.

Пример 2. По 4-м праймерам ((АСС)6С, (АСС)6Т (фиг. 1), (ACC)6G и Sabrina111) синтетический кросс выделяется в автономное положение от исходных пород. Данные типы молекулярных маркеров непосредственно вовлекаются в искусственный отбор, создаваемый селекционерами, и отражают комплекс геномных фрагментов, фланкированных инвертированными повторами микросателлитов и транспозонов, которые могут быть использованы для оценок генетической дифференциации синтетического кросса от исходных родительских форм кроликов.

Фигура 1 - Дендрограмма генетических дистанций между исследованными группами кроликов, рассчитанных на основании спектров фрагментов геномной ДНК, фланкированных (АСС)₆С и (АСС)₆Т, с использованием программы TreeCon.

Проведенный кластерный анализ с построением дендрограмм выделил 5 генетических маркеров ((GCT)6C, (AGC)6T, (TGC)6G, Bare 123А и Sabrina 1336), по которым синтетической кросс выделяется в отдельный кластер вместе с породой белый великан. Это может объясняется не только тем, что белый великан использовался в создании синтетической формы кролика, но и участием белого великана в формировании породы советская шиншилла (фиг. 2), которая также входила в исходные породы при создании кросса. На фигуре 2 представлена дендрограмма генетических дистанций между исследованными группами кроликов, рассчитанных на основании спектров фрагментов геномной ДНК, фланкированных Sabrina 1336, с использованием программы TreeCon

Пример 3. Генетическая схожесть, основанная на дистанциях Нея (M. Nei, 1972), выявленная между породами белый великан и советская шиншилла по генетическим маркерам (АСС)6С - 0,942; (TGC)6G - 0.990; Bare 123А - 0,996 и Sabrina 111 - 0.997 совпадает с известной схемой происхождения родительских форм кроликов. Это объясняется тем, что при создании породы советская шиншилла селекционеры применяли отбор, подбор и направленное выращивание гибридов, полученных от скрещивания кроликов породы шиншилла из Франции и кроликов породы белый великан.

Микросателлитные последовательности (GCT)₆A, (СТС)₆С и (GAG)₆C являются уникальными, так как предоставляют отличные от общего количества маркеров результаты кластерного анализа. В спектрах продуктов амплификации, полученных с использованием праймера (GCT)₆A, наблюдается общая кластеризация синтетического кросса с родительской формой породой калифорнийская, от которых в отдельную ветвь выделяется белый великан. По спектрам праймера (СТС)₆С обнаруживается сходная картина с вышеуказанным маркером. По микросателлиту (GAG)₆C наблюдается два кластера, разбитых на подкластеры следующим образом: советская шиншилла вместе с белым великаном в одной группе и калифорнийская с синтетическим кроссом в другой.

Дендрограммы спектров продуктов амплификации пород кроликов свидетельствует об отсутствии прямой вовлеченности фрагментов геномной ДНК, фланкированных инвертированными повторами микросателлитов (GAG)₆C и (СТС)₆С, в формирование нового синтетического кросса, что может быть связано с принадлежностью этих микросателлитов к пурин/пиримидиновым трекам, предрасположенных к формированию таких структур ДНК, как триплексы, выполняющих существенную роль в формировании вторичных структур ДНК, влияющих на процессы репликации, транскрипции, частоту мутационных событий и формирование G4 квадруплексов.

Проведенный анализ сходства пород советская шиншилла и калифорнийская соответствует их происхождению и историческим взаимосвязям. Так, между этими группами животных схожесть генетического спектра была наивысшей по праймеру (TGC)6G - 0,997 (индекс сходства). Высокие показатели индекса сходства были так же среди спектров праймеров (АСС)6С - 0,953; (AGC)6T - 0,981; (GCT)6C - 0,961.

Обнаружено сходство показателей EMR и MI между белым великаном и новым синтетическим трехпородным кроссом по спектрам праймеров Sabrina 111 (EMR=3,2 и MI=1,2 у обеих пород) и (ACC)₆G (EMR=3,6 у породы белый великан и 3,2 у кросса «Родник»; MI=0,9 у обеих пород), но при этом используя кластерный анализ по дистанциям Нея (M. Nei, 1972) по этим молекулярным маркерам синтетической кросс выделяется в автономную ветку, а не в общую группу с родительской формой. Сопоставив наивысшие значения эффективного мультиплексного отношения и маркерного индекса с полученными дендрограммами по микросателлиту (ACC)₆G и транспозону Sabrina 111, можно выделить спектры этих праймеров как наиболее близкие истории формирования исследуемых пород кроликов, поскольку они совпадают со схемой их происхождения. Следует отметить, что при создании породы советская шиншилла селекционеры применяли белого великана, как основную породу для скрещиваний, чем можно объяснить их совместную общую кластеризацию, наблюдаемую на фигуре 3, где обозначен кластерный анализ значений генетических дистанций между исследованными группами кроликов, рассчитанных на основании спектров фрагментов геномной ДНК, фланкированных (ACC)₆G, с использованием программы TreeCon.

Пример 4. Представленный способ апробирован на представителях семейства куньих - американской норке различных цветовых окрасов (сканбраун, сканблек и сапфир). Выполнен сравнительный анализ спектров продуктов амплификации фланкированных инвертированными повторами микросателлитов ISSR-PCR ((GT)9C; (AGC)6C; (AGC)6T; (TGC)6G) и транспозонов IRAP-PCR (Gossy-R, Sabrina, Sabrina 111, LTR OR2, Gossy-L, InTol, Trna2L). На основании оценок полиморфизма суммарно 60 локусов, 26 из которых являются консервативными, а 34 полиморфными.

Анализ фореграмм выполнен на основе расчета доли полиморфных локусов, полиморфного информационного содержания (PIC-polymorphism information content), эффективного мультиплексного отношения (EMR-effective multiplex ratio) и маркерного индекса (MI-marker index). PIC рассчитывался по формуле: PIC=2f (1-f), где f - частота одного из двух аллелей, рассчитанная как f=√R, где R - частота вариантов, у которых отсутствовал фрагмент ДНК соответствующей длины. EMR=np(np/n), где np - число полиморфных локусов, n - общее число локусов. Расчет маркерного индекса проводился по формуле MI=PIC×EMR.

Самое высокое содержание доли полиморфных локусов наблюдалась у праймеров (AGC)6C (80%), LTR OR2 и InTol (по 85.71%), Gossy-R (62.5%), минимальное же содержание было у (AGC)6T и Sabrina - по 40%, (GT)9C - 33% и Sabrina 111 - 16%. Наивысшие показатели полиморфного информационного содержания были по (AGC)6C, Gossy-R, LTR OR2 и InTol и равнялись 0,323; 0,322; 0,367 и 0,3949 соответственно.

По проведенным расчетам можно сделать вывод, что имеется прямая корреляционная зависимость между эффективным мультиплексным отношением и маркерным индексом, показывающий эффективность молекулярного маркера, используемого при генотипоровании животных. Так, (AGC)6C, Gossy-R, LTR OR2 и InTol имеют самые высокие показатели представленных индексов (EMR=3,2; 3,1; 5,14; 5,14 соответственно и MI-1,006-2,03), исходя из чего их рекомендуется использовать при генотипировании норок, так как являются наиболее информативными молекулярно-генетическими маркерами в геноме норки. На основе результатов статистического анализа по праймерам, которые являются наиболее информативными можно выявить те, которые позволяют идентифицировать животных по окрасу, не основываясь на фенотипическом методе селекции. Так выявлено, что норки окраса сканбраун выделяются в отдельный кластер по денрограммам с праймером InTol, сканблек - (AGC)6C и LTR OR2, а сапфировый окрас - Gossy-R. Учитывая, что основные последовательности идентифицирующие цветовой окрас меха относятся к нуклеотидным последовательностям остаточных эндогенных ретровирусов (транспозоны), можно предположить, что характер мутации, который привел к созданию такой цветовой характеристики меха норки несет четкий наследственный характер, на флангах которого располагаются последовательности мобильных генетических элементов. Продолжив исследования в этом направлении можно выявить нуклеотидную последовательность, которая четко закреплена на конкретным цветовым окрасом, что позволит выявлять плохо проведенную, ошибочную селекцию или случайную мутацию в селекционных группах и позволит не допускать таких животных в разведение, так как они могут привезти к расщеплению и изменению окраса у приплода, что ведет к экономическим убыткам, так как такой мех не является ценным.

Заявленный способ оценки позволяет восстановить генеалогическое дерево происхождения пород животных и оценить схожесть и генетическое расхождение синтетических особей относительно родительских форм, оценить эффективность селекционной работы методом полилокусного генотипирования (геномного сканирования) на основе ISSR-PCR (Inter Simple Sequence Repeats), фланкированных инвертированными повторами микросателлитов и IRAP-PCR (Inter-Retrotransposon Amplified Polymorphism) фланкированных инвертированными повторами терминальных участков транспозонов.