Результат интеллектуальной деятельности: Набор олигонуклеотидных праймеров для выявления вариантных штаммов Burkholderia thailandensis, содержащих кластер генов биосинтеза капсульного полисахарида, высоко гомологичный Burkholderia pseudomallei

Изобретение относится к области молекулярной биологии и генетики. Предложен набор олигонуклеотидных праймеров для проведения экспресс-оценки методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) наличия у штаммов Burkholderia thailandensis кластера генов биосинтеза капсульного полисахарида, высоко гомологичного ортологичному кластеру генов Burkholderia pseudomallei (Bp-like CPS).

Изобретение может быть использовано в генетике и медицине для выявления вариантных (BTCV) штаммов В. thailandensis при расширенном молекулярно-генетическом исследовании данных микроорганизмов и экспресс-оценке их возможной степени патогенности.

В. thailandensis - аэробная подвижная грамотрицательная неферментирующая палочка, впервые выделенная в Юго-Восточной Азии. Бактерия входит в состав комплекса «Burkholderia pseudomallei», однако, в отличие от возбудителей мелиоидоза и сапа - В. pseudomallei и В. mallei, соответственно, является слабовирулентным микроорганизмом.

Известно, что одним из основных факторов вирулентности В. pseudomallei является кластер генов (BPSL2787-2810) биосинтеза капсульного полисахарида (CPS), который у большинства штаммов В. thailandensis заменен на кластер генов биосинтеза экзополисахаридов (EPS) (ВТН_I1324-1343). Однако в последнее десятилетие было обнаружено существование почвенных вариантных штаммов В. thailandensis, обозначенных BTCV, у которых вместо кластера EPS присутствует область, обладающая высокой гомологией с кластером генов CPS В. pseudomallei, получившая название Bp-like CPS. Кроме того, обнаружено, что BTCV штаммы В. thailandensis могут являться причиной тяжелых инфекций, включая сепсис и летальный исход [Glass et al., 2006; Chang et al., 2017; Gee et al., 2018]. Регулярные сообщения об инфекциях различной степени тяжести, обусловленных В. thailandensis, определяют актуальность разработки набора праймеров, позволяющего провести экспресс-оценку методом ПЦР потенциала вирулентности штаммов В. thailandensis, определяющего прогноз течения инфекции.

ПЦР является прямым методом выявления ДНК и обладает высокой специфичностью и чувствительностью. Полимеразную цепную реакцию можно использовать для выявления специфических генетических последовательностей, например, кластера генов биосинтеза Bp-like CPS.

Для эффективного проведения ПЦР необходимы праймеры - синтетические олигонуклеотиды определенного размера, специфические для искомой генетической мишени и имеющие решающее значение в образовании продуктов амплификации. Кроме того, выбор праймеров играет важнейшую роль в специфичности проведения амплификации.

Наиболее близким аналогом можно считать выявление BTCV штаммов В. thailandensis методом aCGH - сравнительной гибридизации массивов геномных ДНК В. pseudomallei и В. thailandensis (array-based comparative genomic hybridization), с подтверждением результата в ПЦР с праймерами для детекции отдельных генов wcb-оперона В. pseudomallei (последовательности праймеров авторы не приводят) и иммунофлуоресцентным анализом бактериальной культуры с использованием моноклональных антител к капсульному полисахариду возбудителя мелиоидоза [Sim, В. М. Q. Genomic acquisition of a capsular polysaccharide virulence cluster by non-pathogenic Burkholderia isolates/ В. M. Q. Sim, N. Chantratita, W. F. Ooi, T. Nandi et al. // Genome biology. - 2010. - Vol. 11, №. 8. - P. R89]. Кроме того, в опубликованных работах авторы использовали косвенное подтверждение наличия у штаммов В. thailandensis кластера генов биосинтеза Bp-like CPS методом мультилокусного сиквенс-типирования (MLST) [Gee, J. Е. Burkholderia thailandensis isolated from infected wound, Arkansas, USA/ J. E. Gee, M. G. Elrod, C. A. Gulvik, D. T. Haselow et al. // Emerging infectious diseases. - 2018. - Vol. 24, №. 11. - P. 2091] и сочетания положительных тестов на утилизацию арабинозы и латекс-агглютинации с использованием моноклональных антител к капсульному полисахариду возбудителя мелиоидоза [Hantrakun, V. Presence of В. thailandensis and В. thailandensis expressing В. pseudomallei-like capsular polysaccharide in Thailand, and their associations with serological response to B. pseudomallei / V. Hantrakun, J. Thaipadungpanit, P. Rongkard, P. Srilohasin et al. // PLoS neglected tropical diseases. - 2018. - Vol. 12, №. 1. - P. е0006193]. Все приведенные выше методы являются длительными и трудоемкими, а во втором и третьем случаях - косвенными. До настоящего времени набора олигонуклеотидных праймеров для прямой детекции методом ПЦР последовательностей генов Bp-like CPS кластера В. thailandensis предложено не было.

Целью настоящего изобретения является разработка набора олигонуклеотидных праймеров для проведения экспресс-оценки методом полимеразной цепной реакции наличия в геноме штаммов В. thailandensis полного или частично редуцированного Bp-like CPS кластера генов биосинтеза капсульного полисахарида.

Цель достигается конструированием специфичных олигонуклеотидов для амплификации методом полимеразной цепной реакции гомологов генов wcbO, wcbJ, wcbI, wcbH, wcbF и wcbD В. pseudomallei, входящих в состав Bp-like CPS кластера генов биосинтеза капсульного полисахарида В. thailandensis.

Сконструированные олигонуклеотиды обладают в реакции амплификации активностью прямого и обратного праймеров и имеют следующую структуру:

SEQ ID NO: 1 ctaccagcctccgtccaaaa

SEQ ID NO: 2 tgcagctcaattccgactcc

SEQ ID NO: 3 ttctcgaaacgcgcagaact

SEQ ID NO: 4 tcggctttcctacgtgttctc

SEQ ID NO: 5 aaaccactcgaactgctcca

SEQ ID NO: 6 gtgaaaacgacggtgggaag

SEQ ID NO: 7 tttccgacgccaacttctcc

SEQ ID NO: 8 ctggacggtttcgttcacca

SEQ ID NO: 9 cgcacaagcggagtagtcaa

SEQ ID NO: 10 gtccttggacgttggacagg

SEQ ID NO: 11 tcagtgcagaggcaagaagc

SEQ ID NO: 12 ggtgcggaagccaaggtaaa

Характеристика генетических мишеней для данных пар праймеров и ожидаемые размеры амплифицируемых фрагментов ДНК приведены в Таблице 1.

Примеры конкретного выполнения.

Пример 1. Алгоритм конструирования набора праймеров.

Поиск генетических мишеней для детекции Bp-like CPS кластера генов биосинтеза капсульного полисахарида В. thailandensis был проведен на основании результатов сравнительного анализа трех первично аннотированных полных геномов (Genbank ас.СР113360.1, СР008914.2, NZ_CP013409.1) и трех шотган полногеномных сиквенсов (NZ_AECN00000000, PHRD00000000, NZ_LNNG00000000) BTCV штаммов В. thailandensis и последовательностей референтных штаммов В. pseudomallei K96243 и В. thailandensis Е264.

С использованием алгоритма BLASTN была оценена гомология ортологичных областей перечисленных геномов, кодирующих биосинтез капсульного полисахарида. В качестве потенциальной генетической мишени были использованы генетические последовательности штамма В. thailandensis 2003015869 (Genbank ас.CP013360.1), присутствующие у штаммов В. pseudomallei, BTCV В. thailandensis и отсутствующие у В. thailandensis.

С помощью программы PrimerBLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast) было сгенерировано 18 пар олигонуклеотидных праймеров. После оценки специфичности которых в этой же программе, окончательно было выбрано 6 пар олигонуклеотидов, комплементарных гомологам генов wcbO, wcbJ, wcbI, wcbH, wcbF и wcbD В. pseudomallei, входящих в состав Bp-like CPS кластера генов биосинтеза капсульного полисахарида В. thailandensis.

Пример 2. Экспериментальная оценка специфичности сконструированных праймеров была проведена на образцах геномной ДНК штаммов В. thailandensis Е264, В. pseudomallei ВКМ900, и BTCV В. thailandensis 2.1, для которого известно присутствие Bp-like, CPS кластера генов биосинтеза капсульного полисахарида, из коллекции ФКУЗ Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора.

Выделение ДНК осуществляли методом мембранных технологий на основе диоксида кремния в виде колонок, используя коммерческий набор реагентов для выделения геномной ДНК «GeneJET», «Thermo Scientific» в соответствии с инструкцией к указанному набору.

Для постановки ПЦР использовались ДНК - амплификатор С1000 (Bio -Rad, США) с 96-луночным реакционным блоком. Программа амплификации для всех пар праймеров состояла из этапов начального прогрева проб 98°С 30 с, 39 реакционных циклов (денатурация 98°С 5 с, отжиг праймеров N°С 5 с, удлинение цепи 72°С 30 с) и финальной элонгации 72°С 1 мин. Температура отжига праймеров для каждой пары праймеров приведена в Таблице 2.

Объем реакционной смеси на 1 пробу составлял 15 мкл. В состав реакционной смеси входили по 1 мкМ прямого и обратного праймеров, 0.3 мкл Phire Hot start II ДНК-полимеразы (Thermo Fisher Scientific, Литва) и 7.5 мкл 2×ПЦР-master mix с дНТФ. Препараты геномной ДНК вносили в реакционную смесь в количестве ~ 1нг.

Электрофоретический анализ продуктов ПЦР проводили в 1,5% агарозном геле и визуализировали окрашиванием бромистым этидием. Размер ампликона оценивали, сравнивая его подвижность с подвижностью полос маркерных фрагментов ДНК.

Результаты тестирования в ПЦР разработанного набора праймеров показали наличие ампликонов ожидаемых размеров у штаммов буркхольдерий с известным присутствием тестируемых мишеней (В. pseudomallei ВКМ900 и BTCV В. thailandensis 2.1 - дорожки 2 и 3, соответственно) и их отсутствие у В. thailandensis Е264 (дорожки 1), у которой ортологичная область представлена отличающимся кластером генов биосинтеза экзополисахаридов (EPS) (Рисунок 1).

Полученные in silico и подтвержденные in vitro данные свидетельствуют о пригодности набора праймеров для детекции генов, входящих в состав Bp-like CPS кластера генов биосинтеза капсульного полисахарида В. thailandensis и проведения экспресс-оценки методом ПЦР наличия у штаммов В. thailandensis Bp-like CPS кластера генов биосинтеза капсульного полисахарида.