Результат интеллектуальной деятельности: ШТАММ БАКТЕРИЙ ESCHERICHIA COLI BL21 (DE3) BPSOMP39 - ПРОДУЦЕНТ РЕКОМБИНАНТНОЙ ПЛАЗМИДНОЙ ДНК PBPSOMP39, НЕСУЩЕЙ ПОЛНОРАЗМЕРНУЮ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ ГЕНА ПОВЕРХНОСТНОГО ПРОТЕИНА OMP39 BURKHOLDERIA PSEUDOMALLEI

Изобретение относится к области молекулярной биологии и биотехнологии и касается конструирования рекомбинантных штаммов Escherichia coli, несущих клонированные последовательности генома возбудителя мелиоидоза Burkholderia pseudomallei. Полученный штамм Е. coli BL21 (DE3) BpsOmp39 является продуцентом рекомбинантной плазмидной ДНК pBpsOmp39, несущей полноразмерную последовательность гена поверхностного протеина Omp39 В. pseudomallei. Штамм предназначен для экспрессии клонированного гена мембранного белка Omp39 В. pseudomallei, его накопления, выделения и очистки. Штамм депонирован в Государственной коллекции патогенных бактерий ФКУЗ Российский научно-исследовательского противочумный институт «Микроб» под номером КМ 252.

В. pseudomallei относится к патогенным биологическим агентам II группы патогенности и является возбудителем особо опасной инфекции - мелиоидоза. Мелиоидоз распространен в регионах Юго-Восточной Азии, Северной Австралии, Западной Африки и Латинской Америки. Кроме того, ввиду значительной туристической и трудовой миграции в мире ежегодно регистрируются лабораторно подтвержденные случаи заболевания лиц, посещавших эндемичные по данной инфекции территории.

Лабораторная диагностика мелиоидоза основывается на изучении культурально-морфологических и биохимических свойств микроорганизмов. Но применение классического бактериологического метода не позволяет достаточно быстро установить присутствие возбудителей в пробах. Помимо идентификации изолятов В. pseudomallei и В. mallei, являющихся генетически, биохимически и иммунологически очень схожими, важной задачей является их дифференциация между собой, а также от непатогенных сапрофитных представителей рода, широко распространенных в естественных биоценозах.

Тактика идентификации патогенных микроорганизмов предусматривает применение ряда иммунодиагностических тестов с использованием моноклональных антител (МКА). В практической работе для ускоренного выявления и последующей идентификации возбудителя мелиоидоза чаще всего используют метод флуоресцирующих антител, реакцию непрямой гемагглютинации, твердофазный иммуноферментный анализ, реакцию двойной иммунодиффузии, иммуноблоттинг. Используемые средства иммунодиагностики мелиоидоза на основе МКА к антигенным эпитопам экзополисахарида характеризуются различной степенью перекрестной реактивности в отношении филогенетически близких представителей рода Burkholderia. Поэтому важным направлением исследований является поиск высокоспецифичных антигенов, пригодных для применения в диагностических тест-системах нового поколения.

Современный подход к решению вышеуказанной проблемы основан на технологии направленного выбора потенциальных кандидатных биополимеров бактериальных клеток, клонирования кодирующих последовательностей целевых биомолекул-мишеней и получение рекомбинантных продуктов, удобных для быстрого и безопасного накопления.

Анализ литературных данных показал, что основной порин внешней мембраны В. pseudomallei BpsOmp39, играющий важную роль в процессах транспорта низкомолекулярных метаболитов и формировании множественной антибиотикорезистентности, обладает высокой иммуногенностью и, следовательно, является перспективной мишенью при конструировании иммунодиагностических систем [Siritapeta J. Expression and refolding of Omp38 from Burkholderia pseudomallei and Burkholderia thailandensis, and its function as a diffusion porin / J. Siritapeta, H. Prinz, C. Krittanai, W. Suginta // J. Biochem. - 2004. - Vol. 384 (Pt 3). - P. 609-617].

На сегодняшний день имеется ряд сообщений о клонировании и анализе экспрессии генов В. pseudomallei, которые детерминируют синтез протеинов, обладающих высокой антигенной активностью. Например, в составе плазмиды pGEX4T-2 в Е. coli BL21 клонирован полноразмерный ген флагеллина В. pseudomallei, способного вызывать у мышей образование специфических антител против возбудителя мелиоидоза на ранних стадиях инфекции [Chen Y.S. Recombinant truncated flagellin of Burkholderia pseudomallei as a molecular probe for diagnosis of melioidosis / Y.S. Chen, D. Shiuan, S.C. Chen et al. // Clin. Diagn. Lab. Immunol. - 2003. - Vol. 10, №3. - P. 423-425]. По данным Garcia-Quintanilla, был получен рекомбинантный штамм Е. coli, содержащий в составе экспрессирующего плазмидного вектора pCClFOS-BPF16β_E10 кластер генов, детерминирующих синтез О-полисахарида В. pseudomallei, который обуславливает выработку специфических IgG макроорганизма при мелиоидозе [Garcia-Quintanilla F. Production of a recombinant vaccine candidate against Burkholderia pseudomallei exploiting the bacterial N-glycosylation machinery / F. Garcia-Quintanilla, J.A. Iwashkiw, N.L. Price et al. // Front. Microbiol. - 2014. - 5:381]. Тем не менее, проблема эффективной иммунодиагностики мелиоидоза не теряет актуальности. Перспективы ее дальнейшего совершенствования связывают с получением новых рекомбинантных белков, специфичных для В. pseudomallei, и использованием их в качестве основы разрабатываемых тест-систем.

Целью изобретения является конструирование штамма Е. coli, несущего стабильно реплицирующуюся рекомбинантную плазмиду с клонированной в составе экспрессирующего вектора полноразмерной последовательностью гена поверхностного протеина Omp39 В. pseudomallei.

В качестве источника хромосомной ДНК был использован штамм В. pseudomallei 56770 SMR2. Хромосомную ДНК выделяли методом протеиназного лизиса [Тетерятникова Н.Н. Молекулярная детекция интегронов класса 1 у Burkholderia pseudomallei / Н.Н. Тетерятникова, И.Б. Захарова, М.В. Подшивалова и др. // Проблемы особо опасных инфекций. -2011. - №2 (108). - С. 46-49] из 24-часовой культуры возбудителя мелиоидоза, выращенной на LB-агаре при 37°C.

Полную нуклеотидную последовательность гена omp39 размером 1100 п.н., кодирующего основной порин внешней мембраны В. pseudomallei BpsOmp39, получали путем амплификации с праймерами, предложенными J. Siritapeta с соавторами [Siritapeta J. Expression and refolding of Omp38 from Burkholderia pseudomallei and Burkholderia thailandensis, and its function as a diffusion porin / J. Siritapeta, H. Prinz, C. Krittanai, W. Suginta // J. Biochem. -2004. - Vol. 384 (Pt 3). - P. 609-617]. Прямой и обратный праймеры были модифицированы авторами добавлением фосфорилированной последовательности на 5'-конце, позволяющей осуществить клонирование амплифицированного фрагмента в дефосфорилированный вектор без предварительной обработки рестриктазами. В ПЦР использовали высокоточную полимеразу.

Клонирование полноразмерной кодирующей последовательности гена поверхностного биополимера возбудителя мелиоидоза omp39 проводили с использованием линейного экспрессионного вектора RIC-Ready - pPAL7, содержащего в своем составе специфическую аффинную метку Profinity eXact tag, которая позволяет накопить и очистить получаемый рекомбинантный белок в системе Profinia™ (Bio-Rad). Специфические ампликоны и вектор лигировали в соотношении 10:1. Для получения компетентных клеток Е. coli использовали метод с применением хлористого кальция [Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Д. Молекулярное клонирование (Текст) / Пер. с англ. - М.: Мир, 1984. - 392 с.]. Полученной лигазной смесью трансформировали штамм Е. coli С-Мах5α для накопления рекомбинантной плазмидной ДНК. Выделение плазмидной ДНК из культуры бактерий Е. coli проводили с помощью набора GeneJET Plasmid Miniprep Kit (Thermo Scientific) согласно инструкции, после чего ими трансформировали штамм Е. coli BL21 (DE3), предназначенный для экспрессии рекомбинантных протеинов с высокой интенсивностью. Для подтверждения присутствия клонированных последовательностей полученные трансформанты исследовали в ПЦР с последующей электрофоретической детекцией в 1.5% агарозном геле.

Рекомбинантный штамм Е. coli BL21(DE3) BpsOmp39, полученный путем трансформации клеток Е. coli BL21(DE3) полноразмерной последовательностью гена отр39 В. pseudomallei 56770 SMR2 в составе вектора pPAL7, несущего ген устойчивости к ампициллину (Amp^R), сохраняет основные культурально-морфологические и биохимические свойства Е. coli BL21(DE3).

Клетки агаровых культур имеют палочковидную форму, грамотрицательны, не образуют спор и капсул. Культуры штамма хорошо растут на простых питательных средах, содержащих и не содержащих ампициллин, при 37°C, оптимум pH 6-7. На агаре Лурия-Бертани с добавлением ампициллина в концентрации 100 мкг/мл формируют гладкие, круглые, слабо выпуклые колонии с ровным краем, на бульоне Лурия-Бертани дают равномерное помутнение.

Биохимическая активность штамма исследована на микробиологическом анализаторе VITEK 2 (bioMerieux): глюкоза (+), мальтоза (+), маннит (+), манноза (+), арабиноза (-), ксилоза (-), сорбит (+), сахароза (-), цитрат (-), малонат (-), галактозидаза (+), уреаза (-), ацетилгалактозаминидаза (-), фосфатаза (-), орнитиндекарбоксилаза (-), лизиндекарбоксилаза (+), гистидин (-), кумарат (+), что подтверждает его видовую принадлежность с вероятностью идентификации 99%.

Штамм Е. coli BL21(DE3) BpsOmp39 является продуцентом рекомбинантной плазмидной ДНК pBpsOmp39 размером 7 т.п.н. Уровень выхода (синтеза) плазмидной ДНК pBpsOmp39 в штамме составляет 0.25 мг/л при плотности культуры OD₆₀₀=0-5. Плазмида pBpsOmp39 несет в своем составе ori репликации и маркер резистентности (Amp^R) вектора pPAL7, промотор Т7lас, расположенный непосредственно перед областью вставки, а также полноразмерную последовательность гена поверхностного протеина Omp39 В. pseudomallei размером 1100 п.н. Продуктом экспрессии клонированного гена является протеин с молекулярной массой 40,6 kDa, который может быть накоплен и очищен.

Примеры конкретного выполнения

Пример 1. ПЦР-детекция клонированного фрагмента

Для детекции клонированного фрагмента геномную ДНК рекомбинантного штамма выделяли методом протеиназного лизиса [Тетерятникова Н.Н. Молекулярная детекция интегронов класса 1 у Burkholderia pseudomallei / Н.Н. Тетерятникова, И.Б. Захарова, М.В. Подшивалова и др. // Проблемы особо опасных инфекций. - 2011. - №2(108). - С. 46-49]. Из 18-часовой культуры рекомбинантного штамма Е. coli BL21(DE3) BpsOmp39 делали взвесь в 150 мкл деионизированной воды, которую смешивали с равным объемом лизирующего буфера (20 мМ трис-HCl, 100 мМ KCl, 5 мМ MgCl₂, 0.2 мг/мл желатина, 0.9% Nonidet Р-40, 0.9% Твин 20, 200 мкг/мл протеиназк К), инкубировали при 60°C 180 мин, прогревали при 97°C 30 мин для инактивации фермента, центрифугировали (10000 об/мин в течение 1 мин) и хранили до использования при -20°C.

Амплификацию полной кодирующей последовательности гена omp39 с использованием специфических праймеров bpsomp39 проводили в монолокусном формате на амплификаторе С1000 (Bio-Rad) при параметрах: плавление 95°C 4 мин, 35 реакционных циклов (денатурация 94°C 40 с, отжиг праймеров 57°C 30 с, удлинение цепи 72°C 120 с), финальная элонгация 72°C в течение 10 мин.

Объем реакционной смеси на одну пробу составлял 15 мкл, концентрация праймеров - 0.100 мкМ. Препарат исследуемой ДНК вносили в реакционную смесь в объеме 1 мкл. Продукты ПЦР анализировали с помощью электрофореза в 1.5% агарозном геле, окрашивали бромистым этидием и визуализировали в системе гель-документирования. Результат электрофореза подтвердил наличие специфического ампликона гена omp39 размером 1100 п.н. в исследованной ДНК рекомбинантного штамма (рис. 1).

Пример 2. Анализ экспрессии целевого белка Omp39.

Для экспрессии поверхностного протеина Omp39 В. pseudomallei в клетках Е. coli BL21(DE3) BpsOmp39 ночную культуру штамма-продуцента пересевали в LB бульон, содержащий ампициллин (100 мкг/мл) и 0,5% глюкозы и выращивали при 37°C и интенсивной аэрации в течение 18-20 часов до достижения оптической плотности раствора OD₆₀₀=0.5-0.7. Затем для индукции синтеза целевого белка в бульон с культурой вносили изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозид (ИПТГ) до конечной концентрации 2 mМ и продолжали культивировать при 37°C в течение 4 часов.

Клетки осаждали центрифугированием и разрушали при помощи ультразвука. Анализ ультразвукового дезинтеграта клеточных суспензий рекомбинантного штамма в SDS-PAGE подтвердил наличие клонированного белка Omp39 с известной молекулярной массой (40,6 kDa), причем концентрация целевого белка в индуцированном варианте значительно превышала таковую без индукции. На рисунке 2 представлена электрофореграмма тотальных лизатов Е. coli BL21(DE3) BpsOmp39, где 1 - лизат клеток, культивируемых в условиях индукции синтеза целевого белка, 2 - лизат неиндуцированных клеток, 3 - белковый маркер молекулярного веса, кДа.

Таким образом, сконструированный штамм бактерий Е. coli BL21 (DE3) BpsOmp39 является продуцентом рекомбинантной плазмидной ДНК pBpsOmp39, несущей полноразмерную последовательность гена поверхностного протеина Omp39 В. pseudomallei, и может быть использован для экспрессии клонированного гена мембранного белка Omp39 В. pseudomallei, его накопления, выделения и очистки.