Результат интеллектуальной деятельности: НАБОР 5'-ФОСФОРИЛИРОВАННЫХ ОЛИГОНУКЛЕОТИДНЫХ ПРАЙМЕРОВ ДЛЯ АМПЛИФИКАЦИИ МЕТОДОМ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ ПОЛНОЙ КОДИРУЮЩЕЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ГЕНА МЕМБРАННОГО ПРОТЕИНА TTSS HRCV BURKHOLDERIA PSEUDOMALLEI

Изобретение относится к области молекулярной биологии и биотехнологии. Предложен набор 5'-фосфорилированных олигонуклеотидных праймеров для амплификации методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) полной кодирующей последовательности гена мембранного протеина системы секреции III типа (TTSS) HrcV возбудителя мелиоидоза. Изобретение может быть использовано в молекулярной биологии и биотехнологии для амплификации полной кодирующей нуклеотидной последовательности гена мембранного протеина TTSS HrcV В. pseudomallei.

Возбудитель особо опасной инфекции - мелиоидоза (Burkholderia pseudomallei) - аэробная грамотрицательная неферментирующая бактерия, принадлежащая к роду Burkholderia подкласса протеобактерий семейства Burkholderiaceae. В настоящее время род Burkholderia включает более 50 видов микроорганизмов и представляет собой довольно гетерогенную таксономическую группу, объединяющую сапрофиты, фитопатогены и патогены теплокровных животных.

Мелиоидоз эндемичен для влажных тропических и субтропических регионов Юго-Восточной Азии, Северной Австралии, Западной Африки и Латинской Америки. В последнее время было отмечено довольно большое число спорадических случаев заболевания для ряда стран умеренного климатического пояса, связанных с заносом из эндемичных регионов.

В. pseudomallei относится к агентам II группы патогенности, все работы с которыми строго регламентированы СП 1.3.3118-13 «Безопасность работы с микроорганизмами I-II групп патогенности (опасности)».

Важной диагностической задачей следует считать точную и быструю индикацию вирулентных штаммов возбудителя мелиоидоза и их дифференциацию от генетически и иммунологически близких непатогенных сапрофитных представителей рода, широко распространенных в естественных биоценозах.

Успешная реализация вышеуказанных задач зависит прежде всего от выбора и детальной технологической проработки стратегии поиска и выявления биополимеров В. pseudomallei, перспективных для использования в качестве специфичных диагностических мишеней при конструировании иммуно- и генодиагностических систем нового поколения.

На основании проведенного нами сравнительного in silico исследования последовательностей геномов В. pseudomallei был осуществлен выбор дифференцирующих групп кодирующих последовательностей поверхностных белков возбудителя мелиоидоза. В результате множественного выравнивания формально транслированных аминокислотных последовательностей были отобраны протеины, формировавшие наиболее гомогенные группы. Для каждого кластера белков исследованы потенциальные антигенные свойства и выделены линейные эпитопы. При этом большой интерес представлял мембранный протеин TTSS HrcV, обладающий высокой потенциальной иммуногенностью. Наличие генов TTSS является одним из известных механизмов, связанных с вирулентностью бактерий. TTSS обеспечивает инвазию, избегание микробами завершенного фагоцитоза, миграцию и размножение внутри фагоцита. Известно, что генный кластер TTSS3 В. pseudomallei или bsa необходим возбудителю для полной вирулентности на модели золотистых хомячков. По составу генов в кластере TTSS у представителей группы «pseudomallei» наблюдаются значительные вариации. Использование приложения BLAST-protein показало, что белок HrcV видоспецифичен для В. pseudomallei. Следовательно, исследуемый протеин и кодирующий его регион могут являться перспективными диагностическими мишенями.

Современной тенденцией в лабораторной диагностике мелиоидоза считают сочетанное применение двух методов: ПЦР и иммуноферментного анализа (ИФА). ИФА на основе моноклональных антител может быть использован для аналитических исследований, связанных с идентификацией видовой принадлежности микроорганизмов и анализом топографии биологически активных и диагностически значимых компонентов бактериальной клетки.

ПЦР является прямым методом выявления ДНК и обладает высокой специфичностью и чувствительностью. В основе метода ПЦР лежит природный процесс репликации ДНК - комплементарное достраивание ДНК матрицы, осуществляемое с помощью фермента ДНК-полимеразы. Процесс амплификации нуклеиновых кислот можно использовать для получения копий фрагментов ДНК, специфичных для конкретных определенных типов генетических последовательностей, например, генов мембранных протеинов микроорганизмов, в число которых входит и ген мембранного протеина TTSS HrcV.

Для эффективного проведения ПЦР необходимы праймеры - синтетические олигонуклеотиды определенного размера, специфические для исследуемой генетической мишени. Праймеры комплементарны последовательностям ДНК на левой и правой границах детектируемого фрагмента и ориентированы таким образом, что достраивание новой цепи ДНК проходит только между ними. В результате ПЦР происходит многократное увеличение числа копий (амплификация) специфического участка гена, катализируемое ферментом ДНК-полимеразой. Выбор ДНК-мишени и подбор праймеров играет важнейшую роль в специфичности проведения амплификации.

Близкими аналогами можно считать олигонуклеотидные затравки, использованные в нескольких работах для амплификации и последующего клонирования гена основного порина внешней мембраны BpsOmp38 (38 кДа) [Siritapetawee J., Prinz Н. et al. Expression and refolding of Omp38 from Burkholderia pseudomallei and Burkholderia thailandensis, and its function as a diffusion porin // J. Biochem. - 2004. - P. 384] и гена цефалоспориназы (blaA_BPS) возбудителя мелиоидоза [Terence K.M. Cheung, P.L. Ho et al. Cloning and Expression of Class A β-Lactamase Gene blaA_BPS in Burkholderia pseudomallei // Antimicrob Agents Chemother. - 2002. - Vol. 46. - P. 1132-1135]. В данных работах были использованы праймеры, фланкирующие полную кодирующую последовательность соответствующих генов, для их клонирования в гетерологичных системах и функциональной характеристики рекомбинантных биополимеров.

Целью настоящего изобретения является разработка олигонуклеотидных праймеров для амплификации методом полимеразной цепной реакции полной кодирующей последовательности гена мембранного протеина TTSS HrcV возбудителя мелиоидоза для последующего клонирования.

Цель достигается конструированием специфичных олигонуклеотидов для амплификации методом полимеразной цепной реакции полной кодирующей последовательности гена мембранного протеина TTSS HrcV В. pseudomallei.

На основе геномных сиквенсов Burkholderia pseudomallei, представленных в общедоступных генетических базах данных (Genbank, EMBL, DDBJ), была подобрана пара праймеров, комплементарных фланкирующим последовательностям гена мембранного протеина TTSS HrcV возбудителя мелиоидоза. Сконструированные олигонуклеотиды, структура которых указана в таблице 1, обладают активностью прямого (bps6155ricF) и обратного (bps6155ricR) праймеров в реакции амплификации. К специфической нуклеотидной последовательности обоих праймеров на 5'-конце добавлена фосфорилированная последовательность, позволяющая осуществить прямое клонирование амплифицированного фрагмента в дефосфорилированный экспрессирующий вектор RIC-ready pPAL7 без предварительной обработки рестриктазами с целью накопления рекомбинантного антигена.

Характеристика генетической мишени для данной пары праймеров и ожидаемый размер амплифицируемого фрагмента ДНК приведены в таблице 2.

Примеры конкретного выполнения.

Пример 1. Методика конструирования олигонуклеотидных праймеров для амплификации полной нуклеотидной последовательности гена, кодирующего высокоиммуногенный мембранный протеин TTSS HrcV возбудителя мелиоидоза, методом ПЦР.

На основе сравнительного анализа in silico последовательностей геномов микроорганизмов рода Burkholderia с использованием ресурса Pathema (http://pathema.jcvi.org/Pathema/) были выбраны дифференцирующие группы кодирующих последовательностей поверхностных белков возбудителя мелиоидоза. Использование приложения BLAST-protein (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) показало, что наиболее перспективной диагностической мишенью является видоспецифичный для В. pseudomallei белок HrcV.

Были выбраны специфические участки ДНК, являющиеся консервативными фрагментами нуклеотидных последовательностей гена мембранного протеина TTSS HrcV В. pseudomallei, к которым с помощью сервиса PrimerBLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast) были подобраны комплементарные олигонуклеотиды, формирующие пару праймеров. К специфической нуклеотидной последовательности прямого и обратного праймеров на 5'-конце добавлена фосфорилированная последовательность, позволяющая повысить эффективность клонирования амплифицированного фрагмента. Расчетная длина фрагмента ДНК, фланкируемого предлагаемыми праймерами, составила 2118 п.н.

Праймеры были проанализированы с помощью компьютерной программы BLASTN (http://www.ncbi.nlm.mh.gov/BLAST/) для установления гомологии между ними и нуклеотидными последовательностями близкородственных буркхольдерий и гетерологичных микроорганизмов, присутствующих в базах данных (EMBL, GenBank, DDBJ). На момент проведения компьютерного анализа гомологии выявлено не было.

Пример 2. Амплификация специфических фрагментов ДНК возбудителя мелиоидоза с помощью разработанных олигонуклеотидных праймеров.

Для выделения ДНК использовался метод протеиназного лизиса [Higuchi R. Rapid, efficient DNA extraction for PCR from cells or blood // Amplifications: A Forum for PCR Users. Perkin-Elmer, Norwalk, CT. - 1989. - Issue 2] с модификациями: 200 мкл свежеприготовленной бактериальной взвеси в стерильной бидистиллированной воде плотностью 2×10⁹ м.к./мл смешивали с равным объемом лизирующего буфера (20 мМ трис-HCl, 100 мМ KCl, 5 мМ MgCl₂, 0.2 мг/мл желатина, 0.9% Nonidet Р-40, 0.9% Твин 20, 150 мкг/мл протеиназы К), инкубировали при 60°С 120 мин, прогревали при 99°С 30 мин для инактивации фермента.

Для постановки ПЦР использовался ДНК-амплификатор С1000 (Bio-Rad, США) с 96-луночным реакционным блоком. Программа амплификации состояла из этапов начального прогрева проб 95°С 3 мин, 40 реакционных циклов (денатурация 95°С 30 с, отжиг праймеров 64.3°С 30 с, удлинение цепи 72°С 2 мин 17 с) и финальной элонгации 72°С 10 мин.

Объем реакционной смеси на 1 пробу составлял 15 мкл. В состав реакционной смеси входили по 50 пМ прямого и обратного праймеров, 1.25 Ед. ДиаТак ДНК-полимеразы и 1×ПЦР-буфер с дНТФ и MgCl₂ (ILS, Россия). Препараты геномной ДНК вносили в реакционную смесь в объеме 3 мкл.

Проводили электрофоретический анализ продуктов ПЦР в 1,5% агарозном геле и визуализировали ампликоны окрашиванием бромистым этидием. Размер ампликона оценивали, сравнивая его подвижность с подвижностью полос маркерных фрагментов ДНК. Электрофоретический анализ реакции амплификации гена мембранного протеина TTSS HrcV возбудителя мелиоидоза, результаты которого приводятся на рисунке 1, показал наличие расчетного ампликона размером 2118 п.н. с праймерами bps6155ricF/bps6155ricR.

Таким образом, сконструированные праймеры позволяют получить в высокой концентрации фрагмент ДНК, несущий полную последовательность гена, кодирующего высокоиммуногенный мембранный протеин TTSS HrcV возбудителя мелиоидоза, что позволит в перспективе осуществить клонирование в составе экспрессирующего вектора с целью накопления рекомбинантного антигена.