Результат интеллектуальной деятельности: ШТАММ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ ГИБРИДНЫХ КЛЕТОК ЖИВОТНОГО MUS MUSCULUS L. CCHFV Vd-3-ПРОДУЦЕНТ МОНОКЛОНАЛЬНОГО АНТИТЕЛА 3H6/F2 К ВИРУСУ КРЫМ-КОНГО ГЕМОРРАГИЧЕСКОЙ ЛИХОРАДКИ

Изобретение относится к биотехнологии получения гибридом-продуцентов моноклональных антител (МКА) заданной специфичности. Штамм-продуцент моноклональных антител к вирусу Крым-Конго геморрагической лихорадки (ККГЛ) назван CCHFV Vd-3 (3H₆/F₂). Штамм депонирован в Государственную коллекцию патогенных микроорганизмов и клеточных культур «ГКПМ-ОБОЛЕНСК» под номером Н-27.

Изобретение может быть использовано в вирусологических и иммунологических исследованиях при создании наборов реагентов для иммуноферментного выявления антигена вируса ККГЛ - возбудителя особо опасного трансмиссивного природно-очагового заболевания человека, входящего в перечень инфекционных (паразитарных) болезней, требующих проведения мероприятий по санитарной охране территории Российской Федерации [1, 2].

При выполнении работ по обнаружению возбудителя в пробах клинического и полевого материала руководствуются принципами организации исследований материала, подозрительного на зараженность вирусом ККГЛ, в учреждениях Роспотребнадзора, изложенных в «Практических руководствах» [3, 4], а также в МУК 4.2.3007-12 [5]. Согласно этим документам одним из регламентированных иммунодиагностических методов обнаружения вируса ККГЛ является сэндвич-вариант иммуноферментного анализа (ИФА).

Для воспроизведения этого метода на этапах экспресс- и ускоренного анализа проб, поступающих на исследование в практические лаборатории, осуществляющие эпидемиологический надзор за возбудителем Крымской геморрагической лихорадки (КГЛ), в настоящее время доступен только один зарегистрированный в качестве медицинского изделия набор, предназначенный для выявления вируса ККГЛ в биологических жидких пробах (набор для иммуноферментного анализа «ВектоКрым-КГЛ-антиген» производства ЗАО «Вектор Бест», Новосибирск, кат. №D-5056, РУ №ФСР 2010/07327), изготавливаемый на основе поликлональных антител к этому вирусу. Регистрационный номер РК-ИМН-5№007764, дата регистрации 14.12.2010. Ввиду отсутствия стандартных препаратов для контроля качества лабораторной диагностики КГЛ неизвестна относительная чувствительность и специфичность этого набора.

В то же время признано, что реализация современного подхода к созданию диагностических препаратов на основе моноклональных антител, предназначенных для обнаружения возбудителей опасных инфекционных заболеваний, имеет ряд преимуществ, обусловленных возможностью работы с паспортизированным производственным штаммом гибридомы-продуцента целевого продукта (МКА) с подтвержденными полезными свойствами, стабильно сохраняющим антителопродукцию и пролиферативную активность в течение длительного периода времени при условии его хранения в криоконсервированном состоянии. При необходимости начала очередного цикла накопления препаративных количеств конкретного МКА для производственных целей соответствующую гибридому вновь выводят из замороженного состояния, клетки тиражируют и получают необходимые количества сырья для изготовления серийного образца диагностического препарата с заведомо известными свойствами, что является существенным технологическим преимуществом по сравнению с работой с поликлональными антителами.

В последние годы все большее внимание уделяют внедрению в практику современных методов и средств детекции опасных патогенов, в том числе и стандартизированных иммунодиагностических препаратов на основе моноклональных иммуноглобулинов, отвечающих требованиям, предъявляемым к средствам экспресс-обнаружения и идентификации микроорганизмов.

О возможностях получения и использования МКА к вирусу ККГЛ ранее сообщали отечественные и зарубежные авторы [6, 7, 8, 9, 10, 11]. Ими были получены экспериментальные образцы моноклональных препаратов для ИФА, апробированные в лабораторных условиях для научно-исследовательских целей. Данные о внедренных в практику препаратах отсутствуют.

Цель изобретения - получение штамма гибридомы-продуцента высокоспецифичных МКА, пригодных для использования в качестве одного из компонентов набора реагентов для иммуноферментного выявления антигенов вируса ККГЛ.

Получение гибридомы достигается гибридизацией двух типов клеток: спленоцитов инбредной мыши линии BALB/c, иммунизированной антигеном вируса ККГЛ, и клеток мышиной миеломы.

Гибридома-продуцент МКА 3H₆/F₃ получена слиянием спленоцитов иммунной мыши линии BALB/c с клетками мышиной миеломы Sp 2/0 в присутствии конъюгирующего агента - полиэтиленгликоля (ПЭГ-4000), последующего рассева взвеси клеток в лунки 96-луночных культуральных пластин, выращивания в селективных средах в течение трех недель с постепенным переходом на полную среду культивирования гибридных клеток, отбора первичного клона по показателю продукции специфических антител, узнающих гомологичный антиген вируса ККГЛ, его клонирования и реклонирования методом лимитирующих разведений. Штамм назван CCHFV Vd-3 (3H₆/F₂), депонирован в Государственную коллекцию патогенных микроорганизмов и клеточных культур «ГКПМ-ОБОЛЕНСК» под номером Н-27, характеризуется следующими признаками.

Культуральные признаки. Клетки культивируют in vitro при 37°C в атмосфере 5-7% CO₂ и влажности 70-80%. Для культивирования гибридомы используют среду RPMI-1640 с 15% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС), 2 mM L-глютамина, 10 mM Hepes, 4 mM пирувата натрия. Характер роста культуры полусуспензионный. Пересевы делают каждые 3-4 сут, интенсивность роста популяции клеток контролируют ежедневно при просмотре лунок пластин в инвертированном микроскопе. Кратность рассева 1:4-1:8.

Культивирование в организме сингенного животного. Для накопления асцита in vivo клетки гибридомы вводят внутрибрюшинно предварительно праймированным мышам линии BALB/c, по 2·10⁶-4·10⁶ клеток на мышь. Прививаемость гибридных клеток в брюшной полости хорошая. Асцит образуется через 2-4 недели.

Продуктивность штамма. Продукция МКА в среде культивирования составляет 0,51 мкг/мл, в асцитической жидкости - 7-8 мг/мл. Объемы асцитической жидкости в среднем равны 3-4 мл.

Характеристика получаемого продукта. Антитела относятся к классу IgG₁. Они специфически взаимодействуют с антигеном вируса ККГЛ. Специфичность взаимодействия определяют с помощью твердофазного иммуноферментного метода (ТИФМ).

Криоконсервирование. Вне периода экспериментов по накоплению препаративных количеств МКА 3H₆/F₂ клетки гибридомы сохраняют в криоконсервированном состоянии. Для перевода их в такое состояние взвесь клеток гибридомы в количестве 4·10⁶ клеток в 1 мл защитной среды, состоящей из среды RPMI-1640 с 20% ЭТС и 7% диметилсульфоксида, переносят в пластиковые ампулы. Ампулы помещают в аппарат для криоконсервирования биологического материала. Используют режим постепенного программируемого понижения температуры: в течение 20 минут - снижение температуры образца до 0°C, далее со скоростью 1°C в минуту до температуры минус 40°C и со скоростью 5°C в минуту от минус 40°C до минус 70°C. Затем ампулы погружают в биохранилище с жидким азотом и хранят до момента использования. Размораживание производят при 37°C на водяной бане в течение 2-3 минут. Жизнеспособность клеток после размораживания составляет 80% и более.

Пример 1. Получение штамма гибридомы-продуцента. Мышь линии BALB/c иммунизируют инактивированным антигеном вируса ККГЛ. Для стимуляции В-лимфоцитов мыши используют схему дробного введения минимальных доз антигена в течение относительно короткого периода времени (5 недель). Первую инъекцию (0 день) выполняют подкожно в область спины смесью антигена (15 мкг антигена в 0,3 мл физиологического раствора (ФР) с равным объемом неполного адъюванта Фрейнда). Вторую, третью и четвертую инъекции (7, 14 и 21 день) - внутрибрюшинно по 15 мкг антигена в 0,3 мл ФР, пятую бустирующую инъекцию - через 2 недели внутриселезеночно (20 мкг). Суммарная доза антигена не должна превышать 80 мкг белка по Бредфорду. Через 3 сут после этого выполняют гибридизацию 1·10⁸ спленоцитов иммунной мыши с 1·10⁷ клеток мышиной миеломы Sp 2/0 в присутствии 1 мл 50% ПЭГ-4000 в течение 2 мин при комнатной температуре и постоянном перемешивании. Затем к этой смеси при постоянном перемешивании последовательно добавляют 1, 2, 4, 8 мл бессывороточной среды RPMI-1640, каждую порцию в течение 2 мин. После этого клетки центрифугируют при 800-1000 об/мин в течение 10 мин. Осадок ресуспендируют в селективной НАТ-среде с 15% ЭТС, 2 mM L-глютамина, 10 mM Hepes, 4 mM пирувата натрия. Клетки высевают в 96-луночную пластину с фидером, по 2,5·10⁵ - 5·10⁵ клеток в лунку. Смену среды производят каждые 3-4 дня. Через две недели от начала высева клеток в 96-луночную пластину производят замену среды выращивания на HT-среду с вышеназванными добавками. По истечении этого срока и на всех последующих этапах используют среду RPMI-1640 с 15% ЭТС, 2 mM L-глютамина, 10 mM Hepes, 4 mM пирувата натрия. Скрининг антителопродуцирующих гибридных клонов выполняют не ранее 7-10 сут после рассева в 96-луночные пластины. При просмотре лунок регистрируют те из них, в которых имеет место характерный рост групп клеток, затем из последних отбирают не более 50 мкл культуральной среды для исследования в непрямом варианте ТИФМ. Проверку антителопродукции повторяют перед каждой сменой среды. Положительные результаты этого метода скрининга, полученные с пробой из одной и той лунки не менее трех раз, являются основанием для отбора первичного клона-продуцента целевого продукта. Все первичные клоны, отобранные в течение месяца, клонируют и реклонируют методом лимитирующих разведений, производя высевы в лунки предварительно подготовленной 96-луночной пластины с фидером - перитонеальными макрофагами сингенной интактной мыши (по 4-6·10⁴ клеток в каждой лунке). На этом этапе используют среду RPMI-1640 с 15% ЭТС и необходимыми добавками. После второго клонирования каждого из первичных вариантов клонов формируют рабочую коллекцию гибридом-продуцентов МКА заданной специфичности. Среди продуктивных клонов, секретирующих моноклональные иммуноглобулины против антигена вируса ККГЛ, селекционирован клон-продуцент CCHFV Vd-3 (3H₆/F₂).

Пример 2. Накопление МКА в препаративных количествах. Ампулу с клетками гибридомы достают из биохранилища с жидким азотом и быстро размораживают на водяной бане при 37°C. Для отмывания восстановленной суспензии клеток от примесей защитной среды ее переносят в центрифужную пробирку с 10 мл бессывороточной среды RPMI-1640 и осторожно наслаивают на поверхность жидкости. Клетки осаждают центрифугированием при 800-1000 об/мин, удаляют надосадок, а осевшие клетки вновь суспендируют в полной среде для культивирования гибридомы (RPMI-1640 с 15% ЭТС и необходимыми добавками). Выполняют проверку жизнеспособности клеток, затем клетки высевают в 5-6 лунок 12-луночной пластины или в матрас с площадью 25 см². При увеличении колонии до размеров, покрывающих половину площади и более, производят рассевы на большие площади при обязательном контроле антителопродукции. Условия культивирования in vitro, тактика отбора и замены среды культивирования, рассева размножающейся популяции клеток такие же, как описано выше. При корректном выполнении этих условий продукция МКА 3H₆/F₂ восстанавливается до уровня 0,50-0,52 мкг/мл. Все образцы культуральной среды, отбираемой в моменты ее замены равными объемами свежей среды, собирают во флакон для последующего выделения из нее моноклональных иммуноглобулинов.

Тиражирование клеток гибридомы in vivo в брюшной полости сингенного животного - наиболее эффективный способ накопления высоких концентраций МКА. Животным предварительно внутрибрюшинно вводят по 0,4 мл стерильного минерального масла, пристана - 2,6,10,14-тетраметил-пентадекана или неполного адъюванта Фрейнда. Через 5-7 суток мышам внутрибрюшинно вводят по 2·10⁶-4·10⁶ клеток гибридомы. После накопления асцитической жидкости ее собирают. Клетки осаждают центрифугированием, надосадочную жидкость отделяют и используют для выделения антител методом сульфатного трехкратного переосаждения белка при 50% насыщении сульфата аммония. Рыхлый осадок центрифугируют при 12000 об/мин в течение 20 минут, надосадочную жидкость удаляют. Осадок растворяют в 0,01 М фосфатном буфере, диализуют до полного удаления ионов сульфата аммония. Полученный раствор моноклональных иммуноглобулинов стерилизуют методом мембранной фильтрации, ампулируют и хранят при минус 20°C до момента использования. Концентрацию белка в растворе МКА определяют спектрофотометрически при длине волны 280 нм.

Специфическую активность МКА определяют с помощью ТИФМ. За сутки до постановки реакции в лунки полистироловой пластины для иммуноферментного анализа вносят по 100 мкл раствора антигена (с концентрацией 10 мкг/мл по белку) в 0,05 М карбонатно-бикарбонатном буфере, pH 9,5. Пластину в течение ночи выдерживают при 4-8°C, затем трижды отмывают забуференным физраствором с 0,05% твина-20 (ЗФР-Т) и выполняют этап блокирования свободных участков пластика 1% раствором бычьего сывороточного альбумина, внося в каждую лунку по 100 мкл этого раствора. Пластину инкубируют при 37°C в термостате в течение 30 минут и вновь трижды отмывают ЗФР-Т. Следующий этап - внесение в лунки пластины по 100 мкл различных разведений МКА, приготовленных на 0,1 М фосфатном буфере, pH 7,4, с 0,05% твина-20 (ФСБ-Т), последующая инкубация - 1 ч при 37°C, трехкратное отмывание и внесение антивидового конъюгата в рабочем разведении по 100 мкл. Конъюгат представляет собой антитела диагностические против IgG(H+L) белой мыши, меченные пероксидазой (коммерческий препарат). Пластину инкубируют при 37°C в течение 1 ч, трижды отмывают. В заключение в лунки вносят по 100 мкл смеси перекиси водорода с хромогеном. Пластину помещают в защищенное от света место. Реакция фермент-субстрат длится не более 20-25 минут при комнатной температуре. Для ее остановки используют стоп-реагент. Результаты реакции (оптическую плотность (ОП) содержимого лунок) регистрируют на планшетном фотометре при длине волны, соответствующей характеристике применяемого хромогена. МКА 3H₆/F₂, выделяемые из асцитической жидкости, активны в разведениях 1:10⁵-1:10⁶.

Средний объем асцитической жидкости, получаемый от одной мыши при культивировании гибридомы CCHFV Vd-3 (3H₆/F₂) in vivo, - 3-4 мл, концентрация МКА - 7-8 мг/мл.

Пример 3. Проверка заявленных полезных свойств МКА 3H₆/F₂ в ИФА.

Для селективной оценки целесообразности использования полученных МКА 3H₆/F₂ в наборе моноклональных реагентов для выявления антигенов вируса ККГЛ была изучена их специфическая активность в ИФА. В качестве референс-панели антигенов были использованы слабые разведения трех образцов, содержащих антигены вируса ККГЛ и один концентрированный образец, не содержащий их.

Образец 1. Рекомбинантный белок, содержащий аминокислотные последовательности, аналогичные белкам вируса ККГЛ изолят «1-2».

Образец 2. Рекомбинантный белок, содержащий аминокислотные последовательности, аналогичные белкам вируса ККГЛ изолят «3».

Образец 3. Природный неочищенный вирус ККГЛ, депонированный в коллекции микроорганизмов ФБУН ГНЦ ВБ "Вектор" под № VK 28848.

Образец 4. Отрицательный контроль - смесь лизатных белков перевиваемой линии клеток аденокарциномы надпочечников человека SV-13 и E.coli (вероятные примеси образцов №№1-3).

Диагностическая конструкция была построена по схеме прямого твердофазного трехстадийного ИФА разновидности двойной сэндвич. Реакция выполнялась согласно следующей схеме. Первый этап - подготовка планшета-иммуносорбента с иммобилизованным на поверхности лунок МКА 3H₆/F₂, выполняющим функцию «захвата» антигена вируса ККГЛ. Второй этап - внесение в лунки планшета образцов антигенов и формирование иммунного комплекса. Третий этап - внесение в лунки планшета конъюгата МКА-биотин, выявляющего образованные иммунные комплексы антител иммуносорбента с антигенами вируса ККГЛ. Для повышения чувствительности реакции последовательно применили два конъюгата: МКА-биотин и образующий крепкую связь с ним стрептавидин-полипероксидаза хрена (СПХ, «STD GmbH», Германия). Последний состоит из одной молекулы стрептавидина и 800 молекул пероксидазы, его применение повышает чувствительность ИФА в 200-300 раз относительно классического конъюгата белок-фермент.

Визуализация результатов анализа осуществляется добавлением к образовавшимся иммунным комплексам раствора хромогена 3,3',5,5'-тетраметиленбензидина («Moss Inc», США) с последующей фиксацией окраски раствором серной кислоты и регистрацией на планшетном фотометре в единицах ОП.

Для активации иммуносорбента (96-луночный планшет из модифицированного полистирола, международная классификация «Maxisorp») был подобран состав сорбционного раствора. Для уменьшения фона в результатах анализа, а также придания иммуносорбенту стабильности при хранении наиболее эффективным оказалось использование карбонатного буферного раствора с последующей блокировкой свободных участков пластика раствором казеина и сахарозы.

Полезные свойства заявляемого МКА 3H₆/F₂ были изучены применительно к активации им иммуносорбента. Для подбора оптимальной концентрации МКА в иммуносорбенте с целью выявления специфичного сигнала при низких концентрациях антигена вируса ККГЛ для МКА 3H₆/F₂ было приготовлено четыре 10-кратных разведения, начиная с 0,15 мкг в лунку. Оптимальная концентрация устанавливалась в ИФА.

Для получения конъюгата МКА-биотин была использована рутинная процедура биотинилирования: добавление к диализованным против гидрокарбонатного раствора МКА сульфо-NHS-биотина с последующей очисткой конъюгата от несвязавшегося биотина гель-фильтрацией на колонке с сефадексом G-25. Было получено четыре различных по специфичности МКА образца конъюгата МКА-биотин, из которых выбран наиболее эффективный в применении на основе МКА 4G₄/B₆ в рабочей концентрации 1,5 мкг/мл.

На первой стадии ИФА исходные образцы референс-панели разводили в 100 раз раствором трис-ЭДТА с добавлением тритона Х-100 и инкубировали в лунках иммуносорбента на основе различных концентраций МКА 3H₆/F₂ 1 ч при 37°C. После пятикратной отмывки ФСБ-Т в лунки планшета вносили конъюгат МКА 4G₄/В₆ - биотин и инкубировали 1 ч при 37°C. Затем после аналогичной отмывки в лунки планшета вносили раствор СПХ и инкубировали 1 ч при 37°C. На стадии визуализации иммунных комплексов в лунки планшета внесли раствор хромогена и инкубировали 15 мин при 37°C. Результаты учитывали при длине волны поглощения 450 нм. Для каждого значения ОП в реакциях с тремя различными образцами антигенов вируса ККГЛ (№1, №2 и №3) определяли коэффициент позитивности (Кпоз) как отношение ОП образца, содержащего антигены вируса ККГЛ, к ОП отрицательного контроля №4 в каждой точке разведения МКА.

Данные по определению оптимальной концентрации МКА 3H₆/F₂, включенных в состав иммуносорбента, обеспечивающих эффективный захват антигенов, суммированы в таблице 1.

Эффективность выявления антигенов оценивали по максимальному показателю Кпоз.

Установлена оптимальная концентрация МКА 3H₆/F₂, сорбируемых на планшете, равная 1,5 мкг/мл (см. таблицу 1).

Данные, представленные в таблице 1, свидетельствуют о том, что при использовании в тест-системе МКА 3H₆/F₂ в качестве антитела первого порядка, а МКА 4G₄/В₆ - антитела второго порядка достигается максимально эффективное выявление антигенов вируса ККГЛ во всех образцах референтной панели (№1, №2 и №3).

Таким образом, перечисленные выше свойства гибридомы-продуцента МКА позволили сделать следующее заключение. Штамм культивируемых гибридных клеток животного Mus musculus L. (авторское название клеточной линии CCHFV Vd-3) предназначен для получения моноклонального антитела 3H₆/F₂ к вирусу Крым-Конго геморрагической лихорадки, относящегося к классу IgG₁. Концентрация иммуноглобулинов в культуральной среде составляет 0,51 мкг/мл. Штамм является продуцентом сырья для изготовления одного из компонентов набора реагентов для иммуноферментного выявления вируса Крым-Конго геморрагической лихорадки в пробах биологического материала.

Источники информации

1. Международные медико-санитарные правила (2005 г.). - 2-изд. - ВОЗ, 2008. - 90 с.

2. Санитарно-эпидемиологические правила СП 3.4.2318-08 «Санитарная охрана территории Российской Федерации».

3. Специфическая индикация патогенных биологических агентов. Практическое руководство / Под ред. Г.Г. Онищенко. - М., 2006. - 288 с.

4. Лабораторная диагностика опасных инфекционных болезней. Практическое руководство / Под ред. Г.Г. Онищенко, В.В. Кутырева. - М.: ОАО "Издательство "Медицина", издательство "Шико", 2009. - 472 с.

5. МУК 4.2.3007-12 «Порядок организации и проведения лабораторной диагностики Крымской геморрагической лихорадки для лабораторий территориального, регионального и федерального уровней».

6. Gaidamovich S.Ia., Mel'nikova E.E., Shutkova T.M., Novokhatskil A.S., Turchinskaia A.L. Characteristics of the monoclonal antibodies induced by the Crimean hemorrhagic fever virus // Virusol. - 1989. - V.34, N 2. - P.201-204.

7. Shutkova T.M., Mel'nikova E.E., Gaidamovich S.Ia., Novokharskii A.S., Turchinskaia A.L. Hybridomas producing monoclonal antibodies to Crimean hemorrhagic fever virus // Zh. Mikrobiol. Epidemiol. Immunobiol. - 1989. - N6. - P.102-107.

8. Вышемирский О.И., Костиков М.А., Гордеева З.Е., Мельникова Е.Э., Свешникова Н.А., Гайдамович С.Я. Выделение и идентификация шести штаммов вируса Крымской геморрагической лихорадки от больных в Таджикистане // ВИНИТИ, т.27. Вирусология, М., 1992, с.53-57.

9. Вышемирский О.И. Анализ антигенной структуры штаммов вируса крымской-Конго геморрагической лихорадки с помощью моноклональных антител // Автореферат диссертации на соискание ученой степени к.м.н. - М., 1993.

10. Blackburn N.K., Besselaar T.G., Shepherd A.J., Swanepoel R. Preparation and use of monoclonal antibodies for identifying Crimean-Congo hemorrhagic fever virus// Am. J. Trop. Med. Hyg. - 1987. - V.37, №2. - P.392-397.

11. Antigen-capture enzyme-linked immunosorbent assay for the diagnosis of crimean-congo hemorrhagic fever using a novel monoclonal antibody /Saijo М., Tang Q., Shimayi В., Han L., Zhang Y., Asiguma М., Tianshu D., Maeda A., Kurane I., Morikawa S.// J. Med. Virol. - 2005. - V.77, №1. - P.83-88.