Результат интеллектуальной деятельности: Способ определения полиморфных маркеров в генах CYP2C19 и CYP2D6 для определения индивидуальной чувствительности к антидепрессантам

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к области фармакогенетики и персонализированной медицины и касается способа определения генетических маркеров, которые обуславливают индивидуальную чувствительность к антидепрессантам (СИОЗС и ТЦА) с использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР) и последующей гибридизацией с олигонуклеотидным биологическим микрочипом (биочипом).

Применение фармакогенетического тестирования с использованием настоящего изобретения позволит индивидуально подбирать антидепрессант и его дозу, снизить риск нежелательных лекарственных реакций и назначения неэффективного препарата.

Уровень техники

В основе современных методов определения полиморфизма генов, как правило, лежит ПЦР с различными вариациями, при этом дизайн реакций и способы детекции результата существенно варьируются и зависят от конкретных задач.

В настоящее время существует ряд методов анализа полиморфных маркеров в генах CYP2C19 и CYP2D6 (различных аллелей этих генов). Спектр анализируемых маркеров несколько варьирует.

Аллель-специфичная ПЦР с последующим гель-электрофорезом - недорогой метод, не требующий высокой квалификации персонала. Существенным недостатком данного метода является постановка большого количества параллельных реакций (для каждого полиморфного локуса как минимум 2 реакции на образец) и разделение их с помощью гель-электрофореза, что существенно снижает ценность метода в рутинной клинической диагностике [Orita М., Iwahana Н., Kanazawa Н., Sekya Т. Detection of polymorphism of human DNA by gel electrophoresis as single cell conformation polymorphism. Proc. Natl. Acad. Sci. 1989. 86: 2766-2770. Gaudet M, Fara AG, Beritognolo I, Sabatti M. Allele-specific PCR in SNP genotyping. Methods Mol Biol. 2009;578:415-24, B1, K, Bachofer J, Steimer W. Optimized strategy for rapid cytochrome P450 2D6 genotyping by real-time long PCR. Clin Chem. 2003 Oct; 49(10): 1624-31].

ПЦР с последующем секвенированием по Сэнгеру в рутинной практике применяется редко, в основном служит для верификации анализов. Метод основан на проведении терминирующих реакций (с добавлением терминирующих 2',3'-дидезоксинуклеозидтрифосфатов) и разделении продуктов этих реакций с помощью капиллярного электрофореза. Метод является точным, информативным, позволяет определять полную нуклеотидную последовательность исследуемого фрагмента, позволяет обнаруживать мутации de novo. Однако он обладает рядом существенных недостатков: требуется постановка отдельной реакции амплификации на каждый анализируемый локус, длительность и сложность выполнения анализа, использование дорогостоящего оборудования и наличие высококвалифицированного персонала [Xiong Y, Wang М, Fang K, Xing Q, Feng G, Shen L, He L, Qin S. A systematic genetic polymorphism analysis of the CYP2C9 gene in four different geographical Han populations in mainland China. Genomics. 2011 May; 97(5):277-81].

В основе аллель-специфичного рестрикционного анализа лежит ПЦР с последующей реакцией рестрикции, в процессе которой с помощью ферментов рестриктаз осуществляется специфическое расщепление ДНК по определенным сайтам. Анализ продуктов рестрикции проводится методом электрофореза. При этом, для анализа каждой мутации требуется постановки отдельной ПЦР с последующей реакцией рестрикции, что делает данный метод трудоемким и повышает вероятность ошибки. Однако данный метод не требует высокой квалификации персонала и дорогостоящего оборудования [Ota М, Fukushima Н, Kulski JK, Inoko Н. Single nucleotide polymorphism detection by polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism. Nat Protoc. 2007; 2(11):2857-64. Yuce-Artun N, Baskak B, Ozel-Kizil ET, Ozdemir H, Uckun Z, Devrimci-Ozguven H, Suzen HS. Influence of CYP2B6 and CYP2C19 polymorphisms on sertraline metabolism in major depression patients. Int J Clin Pharm. 2016 Apr; 38(2):388-94.].

Различные методы, основанные на проведении ПЦР в реальном времени (РТ-ПЦР) широко применяются для анализа генетического полиморфизма. На основе этого подхода разрабатывается большое количество тест-систем. Для постановки РТ-ПЦР используется смесь, содержащая интеркалирующий флуоресцентный краситель SYBRGreen/EVAGreen, который взаимодействует с двухцепочечной ДНК, или аллель-специфичный олигонуклеотид TaqMan, несущий одновременно и флуоресцентную метку, и тушитель [Fudio S, Borobia AM, Pinana E, Ramirez E, Tabares B, Guerra P, Carcas A, Frias J. Evaluation of the influence of sex and CYP2C19 and CYP2D6 polymorphisms in the disposition of citalopram. Eur J Pharmacol. 2010 Jan 25; 626(2-3):200-4.]. Недостатком данного метода является необходимость ставить одну или две ПЦР-реакции на каждый анализируемый локус.

Анализ кривых плавления высокого разрешения (high resolution melting, HRM-анализ) является достаточно простым методом скрининга мутаций. Однако для анализа некоторых последовательностей (в том числе, участков генов с высокой степенью гомологии) данный метод не подходит. Кроме того, HRM-анализ может быть выполнен только на приборе с специальным каналом для HRM и специальным программным обеспечением, что требует оснащения исследовательской лаборатории дорогостоящим оборудованием. [Chang YS, Lee СС, Liu TY, Chen YC, Lu HC, Chang JG. Direct assessment of cytochrome P450 2D6 genotypes by high-resolution melting analysis and DNA sequencing. Environ Toxicol Pharmacol. 2014; 38(3):821-828. Ghasemi Z, Hashemi M, Ejabati M, et al. Development of a high-resolution melting analysis method for CYP2C19*17 genotyping in healthy volunteers. Avicenna J Med Biotechnol. 2016; 8(4):193-199.].

Все вышеперечисленные методы предполагают постановку отдельных реакций для каждого анализируемого локуса. Для решения ряда задач имеет смысл формирование мультиплексных панелей, позволяющих проводить одновременный анализ нескольких полиморфных маркеров. К таким тест-системам относятся различные варианты гибридизации с биочипами. Так, созданная компанией «Roche» на основе технологии микрочипов Affymetrix тест-система «AmpliChip CYP450» была одобрена Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США и применяется для индивидуального подбора психотропных препаратов и их дозировок. Данный тест позволяет выявить до 33 полиморфизмов и мутаций гена CYP2D6 и 3 полиморфизма гена CYP2C19, однако данный метод дорог и требует сложной пробоподготовки [Jain K.K. Applications of AmpliChip CYP450. Mol Diagn. 2005; 9(3):119-27. M.C Rebsamen, J Desmeules, Y Daali, A Chiappe, A Diemand, С Rey, J Chabert, P Dayer, D Hochstrasser and M F Rossier. The AmpliChip CYP450 test: cytochrome P450 2D6 genotype assessment and phenotype prediction. The Pharmacogenomics Journal (2009) 9, 34-41].

Большой объем данных для анализа полиморфных маркеров предоставляют технологии высокопроизводительного секвенирования, которые позволяют получать последовательности генома, либо экзома, либо панелей определенных генов. Однако этот метод дорог, трудоемок, времязатратен и требует верификации результатов. Интерпретация такого объема данных для клинической практики так же представляет трудность. В основном этот подход применяется в исследованиях при поиске новых маркеров [Fabbri С, Tansey KE, Perlis RH, Hauser J, Henigsberg N, Maier W, Mors O, Placentino A, Rietschel M, Souery D, Breen G, Curtis C, Lee SH, Newhouse S, Patel H, O'Donovan M, Lewis G, Jenkins G, Weinshilboum RM, Farmer A, Aitchison KJ, Craig I, McGuffin P, Schruers K, Biernacka JM, Uher R, Lewis CM. Effect of cytochrome CYP2C19 metabolizing activity on antidepressant response and side effects: Meta-analysis of data from genome-wide association studies. Eur Neuropsychopharmacol. 2018 Aug; 28(8):945-954.].

Запатентовано большое количество тест-систем для анализа полиморфных генетических маркеров для определения индивидуальной чувствительности к антидепрессантам, в том числе те, которые позволяют анализировать генетические варианты генов CYP2C19 и CYP2D6.

Во многих патентах представлены способы анализа полиморфизма одного из генов (CYP2C19 или CYP2D6). В китайском патенте CN104946759 А от 2015-09-30 описан метод определения однонуклеотидного полиморфизма гена CYP2C19 -806 C>Т *17 методом SNaPshot ПЦР. В китайском патенте CN 106048076 А от 2016-10-26 описано определение 2 полиморфизмов CYP2C19 (*2 и *3) методом аллель-специфичной ПЦР в реальном времени. В китайском патенте CN 101565749 В от 2012-01-11 описан метод определения полиморфизмов CYP2C19 681 G>A*2, CYP2C19 636 G>A*3 на жидком микрочипе. В американском патенте US20040091909A1 2002-07-05 описан метод определения аллельных вариантов CYP2D6 (*2, *3, *4, *5, *б, *7, *8, *9, *10, *11, *12, *13, *14, *15, *16, *17, *1×2, *2×2, 4×2 и *Nx2). Американский патент US 20050196771 А1 от 2002-04-11 описывает метод детекции 28 нуклеотидных замен и изменение числа копий гена CYP2D6. Французская заявка на патент WO 2011092596 A2 от 2011-08-04 описывает определение аллельных вариантов CYP2D6 *3, *4, *5, *6, *7, *8, * 11, * 12, * 19, *40.

Так же запатентован ряд методов, которые позволяют анализировать полиморфизм генов CYP2C19 и CYP2D6: японский патент JP2004537989A от 2001-06-11 предполагает анализ клеток печени (гепатоцитов), что сопряжено с техническими трудностями, метод, описанный в американском патенте US 20060229824 A1 от 2006-03-03 дорог и требует сложной пробоподготовки.

Гелевые микрочипы низкой плотности в последнее время находят широкое применение для фундаментальных научных исследований, а также в медицинской диагностике, ввиду их невысокой стоимости и возможности создавать актуальные панели под определенные задачи. Метод заключается в амплификации фрагментов ДНК и последующей гибридизации флуоресцентно-меченой ДНК-мишени с аллель-специфичными олигонуклеотидами в трехмерных гелевых ячейках микрочипа. [Gel-based microarrays in clinical diagnostics in Russia. Gryadunov D, Dementieva E, Mikhailovich V, Nasedkina T, Rubina A, Sawateeva E, Fesenko E, Chudinov A, Zimenkov D, Kolchinsky A, Zasedatelev A. Expert Rev Mol Diagn. 2011 Nov; 11 (8):839-53].

Раскрытие сущности изобретения

Задача настоящего изобретения состоит в создании способа определения генетических маркеров, которые обуславливают индивидуальную чувствительность к антидепрессантам (СИОЗС и ТЦА). Панель маркеров включает наиболее информативные и часто встречающиеся генетические маркеры, определение которых позволяет индивидуализировать терапию препаратами групп СИОЗС и ТЦА.

Сущность изобретения заключается в обеспечении способа анализа однонуклеотидного полиморфизма (SNP, Single nucleotide polymorphism) генов CYP2C19 и CYP2D6, продукты которых участвуют в метаболизме СИОЗС и ТЦА. Данный способ позволяет одновременно выявлять следующие полиморфные маркеры в генах: CYP2C19*1/*2/*3/*17 (rs4244285, rs4986893, rs12248560) и CYP2D6*1/*3/*4/*10/*41(rs35742686, rs3892097, rs1065852, rs28371725).

Основными признаками данного изобретения являются мультиплексная одноэтапная ПЦР с последующей гибридизацией продуктов ПЦР на биочипе, содержащем набор иммобилизованных олигонуклеотидных зондов.

Первый важный признак изобретения - набор праймеров для амплификации анализируемых локусов, который используется для получения флуоресцентно-меченых продуктов в необходимом количестве для гибридизации на биочипе. Один праймер из пары праймеров для каждого локуса состоит из части, комплементарной участку гена (на 3'-конце) и универсальной последовательности (на 5'-конце), соответствующей универсальному праймеру. Последовательности праймеров для проведения ПЦР приведены в Перечне последовательностей 1. (SEQ ID NO: 1-15).

Второй важный признак изобретения - биочип, содержащий набор иммобилизованных олигонуклеотидных зондов, последовательности которых приведены в Перечне последовательностей 2. (SEQ ID NO: 16-29). Олигонуклеотидные зонды иммобилизуются в ячейках гидрогелевого микрочипа, как описано в патенте RU 2206575 (дата публикации 2003-06-20) в концентрации 2000 мкМ. Схема расположения зондов в ячейках биочипа приведена на Фиг. 1.

Набор праймеров для ПЦР используется для проведения одноэтапной ПЦР для получения флуоресцентно-меченного продукта в два раунда для гибридизации на биочипе. Далее проводится гибридизация флуоресцентно-меченых фрагментов ДНК, полученных после проведения ПЦР, с иммобилизованными в ячейках биочипа олигонуклеотидными зондами, расположенными на пластиковой подложке. После проведения гибридизации и отмывки биочипа проводится анализ полученной флуоресцентной картины, на основании которого делается отчет о генотипе исследуемого образца. Пример картины гибридизации приведен на Фиг. 2.

Краткое описание таблиц и фигур

Фигура 1. Схема расположения зондов в ячейках биочипа для анализа полиморфных маркеров в генах CYP2C19 и CYP2D6 для определения индивидуальной чувствительности к антидепрессантам, (а) расположение ячеек на биочипе; (б) расшифровка условных обозначений. (М) - ячейки, содержащие флуоресцентный краситель Су5, светящийся перманентно, для ориентировки и контроля интенсивности свечения.

Фигура 2. Гибридизационная картина, полученная с помощью биочипа для анализа полиморфных маркеров в генах CYP2C19 и CYP2D6 для определения индивидуальной чувствительности к антидепрессантам (у пациента №1).

Осуществление изобретения

Для обеспечения оптимальных условий мультиплексной ПЦР необходимо использовать праймеры, обеспечивающие специфичный и эффективный отжиг на мишени при одинаковой температуре (для одного этапа), при этом они не должны образовывать при этой температуре вторичных структур, в том числе, и в условиях мультиплексной ПЦР. Для оптимальной (стабильной и специфичной) наработки необходимого для гибридизации на биочипе количества флуоресцентно-меченого ПЦР-продукта должны быть подобраны такие параметры как концентрации реагентов в реакционной смеси и температурно-временной режим реакций. В результате проведенной работы были подобраны праймеры и условия для проведения ПЦР, которые позволяют осуществлять эффективную наработку исследуемых локусов ДНК в условиях мультиплексной ПЦР.

Для иммобилизации на биочипе подбираются олигонуклеотиды, позволяющие идентифицировать все выбранные для анализа участки генов.

Олигонуклеотидные зонды должны быть подобраны в соответствии со следующими критериями:

1) Олигонуклеотидный зонд должен обладать высокой специфичностью к анализируемому локусу.

2) Предпочтительно расположение вариабельного нуклеотида в серединной области зонда, так как такая конструкция зонда позволяет добиться лучшей дискриминации между совершенными и несовершенными дуплексами.

3) Олигонуклеотидный зонд не должен образовывать стабильных вторичных структур в условиях, при которых проводится гибридизация, так как наличие вторичных структур может приводить к снижению эффективности гибридизации.

На биочипе, для анализа полиморфных маркеров в генах CYP2C19 и CYP2D6 для определения индивидуальной чувствительности к антидепрессантам, было иммобилизовано 14 высокоспецифичных дифференцирующих олигонуклеотидных зондов (Перечне последовательностей 2. (SEQ ID NO: 16-29)), структура которых обеспечивает высокоспецифичное связывание с полностью комплементарными ДНК-мишенями. Яркий флуоресцентный сигнал наблюдается только в ячейках, в которых при гибридизации образовался совершенный дуплекс между олигонуклеотидным зондом и флуоресцентно-меченым ПЦР-продуктом.

Приведем последовательность анализа с использованием данного метода. Амплификация ПЦР-продуктов для последующей гибридизации на биочипе проводится посредством мультиплексной одноэтапной ПЦР, при этом в качестве матрицы для проведения реакции используют образец ДНК, полученный от пациента.

ПЦР может быть проведена с использованием любого вида термостабильной полимеразы (Taq-полимераза, Taq-полимераза с горячим стартом, Tth-полимераза, Tfl-полимераза, Pfu-полимераза, Vent-полимераза, DeepVent-полимераза и другие коммерчески доступные ферменты, выделенные из термофилов), работающей в соответствующем буфере. Для построения новой цепи в буфер добавляется смесь дНТФ (дАТФ, дГТФ, дЦТФ, дТТФ). Для проведения ПЦР могут быть использованы и готовые коммерчески доступные наборы, содержащие все необходимые компоненты за исключением праймеров.

В ходе мультиплексной одноэтапной ПЦР осуществляется наработка преимущественно одноцепочечных продуктов (за счет добавления избытка универсального праймера), и с его флуоресцентным маркированием с использованием дУТФ-Су5, который способен включаться в растущую цепь ДНК. В качестве флуоресцентной метки также может быть использован любой флуорохром без ограничения (например, FITC, Texas red, Су-3 и т.д.), а также биотин.

Синтез праймеров и олигонуклеотидных зондов осуществляется с помощью таких химических подходов как фосфодиэфирный метод, гидрофосфорильный метод и т.д. Для синтеза праймеров используются автоматические ДНК/РНК синтезаторы, например, производства фирмы «Applied Biosystems» (США). Для иммобилизации в гидрогелевых ячейках биочипа, к 5'- или 3'-концу олигонуклеотидных зондов добавляется активная группа (например, на 3'-конец может быть введена свободная аминогруппа с помощью 3'-Amino-Modifier С7 CPG 500, «Glen Research)), США).

Для проведения ПЦР используют праймеры SEQ ID NO: 1-14 в концентрации 1 пикомоль/мкл, и универсальный праймер- SEQ ID NO: 15 в концентрации 50 пикомоль/мкл. Последовательности праймеров приведены в Перечне последовательностей 1.

Далее проводится гибридизация флуоресцентно-меченых фрагментов ДНК, полученных в результате ПЦР, с иммобилизованными в ячейках геля олигонуклеотидными зондами, последовательности которых представляют собой участки, комплементарные последовательностям мажорного или минорного аллеля по исследуемым локусам.

Гибридизация ПЦР-продукта с олигонуклеотидными зондами на биочипе может быть проведена в любом гибридизационном буфере, например, в SSPE-буфере с формамидом или с гуанидином. Перед постановкой гибридизации ПЦР-продукт прогревают при 95°С в течение 5 минут, затем охлаждают на льду в течение 2 минут, после чего наносят гибридизационную смесь на биочип. Гибридизация проводится в течение 12-14 ч при 37°С. Последующая отмывка биочипа может быть проведена в любом известном в данной области техники буфере с добавлением соли (SSC, SSPE и т.п.) или в дистиллированной воде.

Анализируемый фрагмент ДНК в условиях (состав реакции, температура и время гибридизации), при которых осуществляется гибридизация, образует совершенные дуплексы только с полностью комплементарными ему олигонуклеотидными зондами. Сигнал флуоресценции детектируется только в тех ячейках, в которых образовался совершенный дуплекс.В случае если дуплекс несовершенный (присутствует хотя бы один не спаренный нуклеотид), то сигнал флуоресценции отсутствует. Визуализацию сигнала флуоресценции проводят, например, с помощью портативного анализатора биочипов, снабженного ПЗС-камерой и специальным программным обеспечением (ООО «БИОЧИП-ИМБ», Москва, Россия).

Изготовление биочипов осуществляется посредством последовательного нанесения на поверхность подложки из стекла ячеек акриламидного геля, активации ячеек и иммобилизации в ячейках модифицированных олигонуклеотидов [Analysis of SNPs and other senomic variations using gel-based chips / A. Kolchinsky, A. Mirzabekov //Hum Mutat. - 2002. - Vol. 19. - P. 343-360. Review]. В качестве подложки кроме стекла могут быть использованы металлы, гибкие мембраны и пластик (Патент RU 2309959, опубликован 2007-11-10). Биочипы также могут быть изготовлены любыми другими известными способами [Arrays of immobilized oligonucleotides-contributions to nucleic acids technology / H. Seliger, M. Hinz, E. Happ // Curr Pharm Biotechnol. - 2003. - Vol. 4. - P. 379-395].

Для изготовления биочипа в настоящем изобретении используется набор олигонуклеотидов SEQ ID NO: 16-29, приведенный в Перечне последовательностей 2. Расположение конкретных олигонуклеотидных зондов на биочипе может варьироваться в зависимости от удобства интерпретации результатов.

Далее приведены примеры, иллюстрирующие возможности применения способа анализа полиморфных маркеров в генах CYP2C19 и CYP2D6 для определения индивидуальной чувствительности к антидепрессантам. Варианты и модификации осуществления изобретения, которые могут быть осуществлены, не отходя от общей концепции настоящего изобретения и без привлечения собственной изобретательской деятельности, также будут входить в объем притязаний настоящего изобретения.

Пример 1. Амплификация участков генов CYP2C19 и CYP2D6 с целью получения флуоресцентно меченного ПЦР-продукта в необходимом количестве.

Из крови пациента больного выделяли ДНК с помощью набора QIAamp DNA Blood Mini Kit (Qiagen, США).

Наработку участков анализируемых генов проводили методом одноэтапной мультиплексной ПЦР. ПЦР проводилась в одной реакции для каждого образца. ПЦР-смесь общим объемом 25 мкл включала в себя: 0.5 ед. акт. Taq-полимеразы («СибЭнзим», Россия), ПЦР-буфер (70 мМ Трис-HCl (рН 8.3), 16.6 мМ (NH₄)SO₄, 2.5 мМ MgCl₂, 200 мкМ каждого из дНТФ («СибЭнзим», Россия), 10 нг ДНК, по 1 пмоль каждого праймера SEQ ID NO: 1-14, 50 пмоль универсального праймера SEQ ID NO: 15, 8 мкМ флуоресцентно меченного дУТФ-Су5, Амплификацию проводили по следующей схеме: 40 циклов (94°С 30 с, 65°С 30 с, 67°С 30 с, 69°С 30 с, 72°С 20 с), далее 40 циклов (94°С 30 с, 56°С 10с, 72°С 30 с), на приборе Т100 («Bio-Rad», США).

Пример 2. Олигонуклеотидный биочип для анализа полиморфных маркеров в генах CYP2C19 и CYP2D6.

Олигонуклеотидные зонды для иммобилизации на микрочипе синтезировали на автоматическом синтезаторе 394 DNA/RNA Synthesizer («Applied Biosystems», США) с использованием стандартной фосфоамидитной процедуры. В 3'- конце олигонуклеотидного зонда находится спейсер со свободной аминогруппой, которую вводили в состав олигонуклеотида используя метод 3'-Amino-Modifier С7 CPG 500 («Glen Research)), США).

Биочип изготовливали методом сополимеризации олигонуклеотида в акриламидном геле (патент RU 2309959, опубликованный 2007-11-10 и RU 2175972, опубликованный 2001-11-20). Биочип содержит 14 иммобилизованных олигонуклеотидных зондов (SEQ ID NO: 16-29), список которых представлен в Перечне последовательностей 2. Ячейки наносят согласно схеме на Фиг. 1. Пример 3. Гибридизация меченного продукта на биочипе

Реакционную смесь, полученную после проведения второго этапа ПЦР, описанного в Примере 1, использовали для гибридизации на биочипе: 10 мкл формамида ("Serva", США), 10 мкл 20×SSPE ("Promega", США) и по 10 мкл амплификата. Гибридизационную смесь денатурировали при 95°С 5 минут, охлаждали во льду 2 минуты и наносили на биочип, после чего оставляли на 12 часов при 37°С. После проведения гибридизации биочип отмывали в 1 × SSPE в течение 10 минут при комнатной температуре.

Пример 4. Регистрация и интерпретация результатов гибридизации

Регистрацию гибридизационной картины производили с помощью портативного анализатора биочипов, снабженного ПЗС-камерой, производимого ООО «Биочип-ИМБ».

Генотип исследуемого образца определяли по гибридизационной картине, представленной на Фиг. 2.

Генотип образца:

CYP2C19_*2_G/A

CYP2C19_*3_G/G

CYP2C19_*17_C/C

CYP2D6*3_A/A

CYP2D6*4_G/G

CYP2D6*10_G/G

CYP2D6*41_C/T

Перечень последовательностей 1. Последовательности праймеров для ПЦР

Перечень последовательностей 2. Последовательности олигонуклеотидных зондов