Способ отбора материнских растений Betula pendula, продуцирующих семенное потомство с разной стабильностью генетического материала соматических клеток, по уровню флуктуирующей асимметрии листовой пластинки

Изобретение относится к способам выращивания растений, а именно, к способам селекции, и может быть использовано для отбора по уровню флуктуирующей асимметрии листовой пластинки материнских растений Betula pendula, продуцирующих семенное потомство с высокой / низкой стабильностью генетического материала соматических клеток.

В настоящее время существует ряд работ, показывающие, что древесные растения могут продуцировать семенное потомство с разным уровнем цитогенетических нарушений (Артюхов В.Г., Калаев В.Н., Карпова С.С. Цитогенетический полиморфизм семенного потомства деревьев березы повислой (Betula pendula Roth.), произрастающих в различных экологических условиях // Экологическая генетика. - 2009. - Т. 7. - №1. - С. 30-40). Семенное потомство с высоким уровнем цитогенетических нарушений называют мутабильным, с низким - слабомутабильным. Выявлено, что потомство с высоким уровнем цитогенетических нарушений характеризуется худшими ростовыми показателями (по сравнению со слабомутабильным) (Калаев В.Н., Попова А.А. Цитогенетический полиморфизм проростков семян деревьев дуба черешчатого (Quercus robur L.) на территориях с разным уровнем антропогенного загрязнения // Проблемы региональной экологии. 2014. - №2. - С. 176-190). Стоит также отметить, что среди семенного потомства, обладающего низким уровнем цитогенетических нарушений, возможно, будет отмечаться большее фенотипическое разнообразие, что позволяет искать селекционно-ценные формы. Ранее у березы повислой было показано наличие среди семенного потомства форм с высоким и низким уровнем нарушений и дана их цитогенетическая характеристика (Карпова С.С. Влияние антропогенного загрязнения на цитогенетический полиморфизм семенного потомства березы повислой (Betula pendula Roth.) в естественных и искусственных древостоях: дис … канд. биол. наук / С.С. Карпова. - Воронеж, 2011. - 147 с).

Временные рамки одного исследования чаще всего не позволяют осуществить массовый отбор селекционно-ценных древесных на основании анатомо-морфологических особенностей нескольких генераций потомства. Ускорение получения результатов отбора материнских растений, продуцирующих семенное потомство с разным уровнем стабильности генетического материала у Rhododendron ledebourii Pojark., достигалось путем анализа цитогенетических показателей (Патент РФ №2662650, опубл. 2018).

Однако метод световой микроскопии, использующийся для выявления деревьев березы повислой, продуцирующих семенное потомство с разным уровнем стабильности генетического материала, требует значительных материальных и временных затрат на изготовление и анализ микропрепаратов, высоко квалифицированного персонала, дорогостоящей микроскопической техники и химических реактивов.

В связи с этим можно отобрать селекционно-ценные родительские деревья более простым и быстрым способом, чем изготовление и просмотр микропрепаратов, а также дальнейший анализ цитогенетических показателей проростков семян анализируемых растений, например, с помощью исследования флуктуирующей асимметрии. Ранее уровень флуктуирующей асимметрии у березы повислой использовался для оценки состояния окружающей среды. Материнские растения, продуцирующие семенное потомство с разным уровнем цитогенетических нарушений, по уровню флуктуирующей асимметрии не отбирались.

Неоднократно отмечалось повышение коэффициента флуктуирующей асимметрии и, соответственно, снижение стабильности развития у растений и животных в неблагоприятных для организма условиях (Чистякова Е.К. Возможность использования показателей стабильности развития и фотосинтетической активности для исследования состояний природных популяций растений на примере березы повислой / Е.К. Чистякова, Н.Г. Кряжева // Онтогенез. - 2001. - Т. 3, №6. - С. 422-427; Устюжанина О.А. Сравнительный анализ морфологической изменчивости и стабильности развития на популяционном уровне / О.А. Устюжанина, А.Б. Стрельцов // Проблемы региональной экологии. - 2014. - №1. - С. 250-253; Ерофеева Е.А. Флуктуирующая асимметрия листа Betula pendula (Betulacea), в условиях автотранспортного загрязнения (г.Нижний Новгород) // Е.А. Ерофеева / Растительные ресурсы. -2015. -Т. 51.- Вып. 3. - С. 366-383).

Известен способ экологического испытания листьев березы по В.М. Захарову флуктуирующей асимметрии листьев березы (Захаров В.М. К оценке асимметрии билатеральных признаков как популяционной характеристики / В.М. Захаров, В.В. Зюганов // Экология. 1980. - №1, С. 10-16; Захаров В.М. Онтогенез и популяция (стабильность развития и популяционная изменчивость) / В.М. Захаров // Экология. 2001. - №3. -С. 164-168); Здоровье среды: методика оценки / В.М. Захаров [и др.]. - М.: Центр экологической политики России, 2000. - 68 с; Здоровье среды: практика оценки / В.М. Захаров [и др.]. - М.: Центр экологической политики России, 2000. - 320 с), включающий взятие листьев от учетных деревьев, растущих в одинаковых экологических условиях местопроизрастания, также способ экологического измерения сторон березняка городского сквера по флуктуирующей асимметрии листьев (Патент РФ №2549779, опубл. 2015), способ экологического измерения березняка по флуктуирующей асимметрии листьев (Патент РФ №2556980, опубл. 2015).

Наиболее близким к заявляемому изобретению является способ сравнительной индикации загрязненности воздуха по флуктуирующей асимметрии листьев березы (Патент РФ №2569748, опубл. 2015), в котором для экологической оценки загрязненности воздуха поллютантами принимаются критерии факторного анализа бинарных отношений между факторами измеренных пробных листьев. Однако уровень флуктуирующей асимметрии ранее никогда не применялся в селекционных целях для классификации маточников древесных растений, продуцирующих семенное потомство с разной стабильностью генетического материала соматических клеток.

Известен способ использования коэффициента флуктуирующей асимметрии сельскохозяйственных культур, в частности, картофеля (Устюжанина О.А. Стабильность развития разных сортов картофеля как показателя направленного антропогенного воздействия / О.А. Устюжанина, Л.А. Соколова, А.Б. Стрельцов // Проблемы региональной экологии. - 2012. - №6. - С. 110-113) и пшеницы для оценки стабильности развития в условиях внесения удобрения и без него, а также в зависимости от насыщенности севооборота бобовыми компонентами и выявлены небольшие колебания параметра, свидетельствующие о достаточной стабильности развития (Устюжанина О.А. Коэффициент флуктуирующей асимметрии для пшениц озимой и яровой в севооборотах с насыщенностью элементами питания в разной форме / О.А. Устюжанина, Л.А. Соколова // Проблемы региональной экологии. - 2014. - №6. - С. 59-62). Однако никто ранее не использовал уровень флуктуирующей асимметрии в селекционных целях для отбора маточников древесных растений, продуцирующих семенное потомство с разной стабильностью генетического материала соматических клеток.

В связи с выше изложенным актуально выявление возможности использования морфометрических характеристик для отбора материнских растений и проверка результата отбора изучением цитогенетических признаков семенного потомства. Была установлена связь между цитогенетическими показателями и ростовыми характеристиками, у аборигенного вида - дуба черешчатого (Калаев В.Н., Попова А.А. Цитогенетические характеристики и морфологические показатели семенного потомства деревьев дуба черешчатого (Quercus robur L.), произрастающих на территориях с разным уровнем антропогенного загрязнения // Вестник Воронежского государственного университета. Серия Химия. Биология. Фармация. - 2014. - №4. - С. 63-72), у одного из растений-инродуцентов -рододендрона Ледебура (Патент РФ №2654605, опубл. 2018). Это свидетельствует о том, что цитогенетические параметры могут отражать ростовую активность, а также могут являться критериями проверки по потомству материнских растений и других видов, например, Betula pendula Roth.

Известно о существовании связи между флуктуирующей асимметрией листа материнских деревьев и цитологическими показателями семенного потомства. Например, выявлено совпадение результатов исследований флуктуирующей асимметрии листовой пластинки у березы повислой с ранее полученными данными об экологической загрязненности районов с помощью геоинфомационных технологий и цитогенетических характеристик (Биоиндикация загрязнения районов г. Воронежа по величине флуктуирующей асимметрии листовой пластинки березы повислой / В.Н. Калаев [и др.] // Вестник Воронежского государственного университета. Сер. Химия. Биология. Фармация. - №2. - Воронеж, 2011. - С. 168-175.). Установлено совпадение результатов исследований цитогенетических характеристик (низкая митотическая активность, высокий уровень патологий митоза) с высоким уровнем флуктуирующей асимметрии листовой пластинки у березы повислой в экологически загрязненных районах (Калаев В.Н., Буканова Т.В. О взаимосвязи уровня флуктуирующей асимметрии листовой пластинки материнских деревьев и цитогенетических показателей семенного потомства березы повислой (Betula pendula Roth) в условиях антропогенного загрязнения // Биоразнообразие и устойчивость живых систем: матер. 13 международ, науч.-практич. экологической конференции (6-11 октября 2014 г., г. Белгород). - Белгород: ИД «Белгород» НИУ БелГУ, 2014. - С. 136-137.).

Задача изобретения - разработка способа отбора по уровню флуктуирующей асимметрии листовой пластинки материнских растений Betula pendula, продуцирующих семенное потомство с высокой / низкой стабильностью генетического материала соматических клеток.

Технический результат - выделение по уровню флуктуирующей асимметрии листовой пластинки материнских экземпляров Betula pendula, продуцирующих семенное потомство с высокой или низкой стабильностью генетического материала соматических клеток.

Технический результат достигается тем, что в способе отбора по уровню флуктуирующей асимметрии листовой пластинки материнских растений Betula pendula, продуцирующих семенное потомство с разной стабильностью генетического материала соматических клеток, включающем выделение учетных фенотипически здоровых деревьев березы повислой, достигших генеративного возраста, на каждой исследуемой территории, сбор не менее 50 листьев примерно одинакового размера с максимального количества доступных укороченных побегов нижней части кроны, относительно равномерно вокруг дерева, определение флуктуирующей асимметрии как среднее арифметическое отношение разности к сумме промеров листа слева и справа, отнесенное к числу признаков; анализ флуктуирующей асимметрии по пяти параметрам каждого листа (ширина левой и правой половинок листа, длина жилки второго порядка, второй от основания листа, расстояние между основаниями первой и второй жилок второго порядка, расстояние между концами этих же жилок, угол между главной жилкой и второй от основания листа жилкой второго порядка), согласно изобретению, вычисляют величину флуктуирующей асимметрии листа материнского растения, полученные значения сравнивают со значением 0,020, выше которого материнский экземпляр продуцирует мутабильное семенное потомство, в противном случае - слабомутабильное

Использование в качестве критериев отбора материнских растений Betula pendula уровня флуктуирующей асимметрии листовой пластинки и цитогенетических характеристик их семенного потомства позволяет оценивать стабильность генетического материала проростков, полученных от определенных деревьев, и выделять экземпляры, продуцирующие семенное потомство с высоким уровнем стабильности генетического материала.

Пример

Для анализа флуктуирующей асимметрии использовали фенотипически здоровые деревья березы повислой, достигшие генеративного возраста, с которых собирали по 50 листьев примерно одинакового размера с максимального количества доступных укороченных побегов нижней части кроны, относительно равномерно вокруг дерева. Проводили измерение по пяти параметрам каждого листа (ширина левой и правой половинок листа, длина жилки второго порядка, второй от основания листа, расстояние между основаниями первой и второй жилок второго порядка, расстояние между концами этих же жилок, угол между главной жилкой и второй от основания листа жилкой второго порядка) и расчет флуктуирующей асимметрии по методу В.М. Захарова, описанному ранее (Здоровье среды: методика оценки / В.М. Захаров [и др.]. - М.: Центр экологической политики России, 2000. - 68 с; Здоровье среды: практика оценки / В.М. Захаров [и др.]. - М.: Центр экологической политики России, 2000. - 320 с).

Для цитогенетического исследования семенного потомства Betula pendula используют зрелые семена, собранные от каждого в отдельности фенотипически здорового материнского растения (без визуальных повреждений паразитами). Семена проращивают в чашках Петри при температуре +25°С. По достижении корешками длины 0,5-1 см их фиксируют в 9 часов утра в ацетоалкоголе - смеси 96% этилового спирта и ледяной уксусной кислоты (3:1), после чего материал хранят в холодильнике при температуре +4°С. Из корешков проростков готовят постоянно-давленные микропрепараты с использованием жидкости Гойера по ранее описанной методике (Вострикова Т.В. Изучение суточной митотической активности у березы повислой / Т.В. Вострикова, А.К. Буторина // Цитология. - 2004. - Т. 46. - №6. - С. 520-524.)

Анализируют цитогенетические характеристики нечетного числа проростков семян от каждого экземпляра материнского растения, не менее 9. Препараты изучают с помощью микроскопа LABOVAL-4 (Carl Zeiss, Jena) при общем увеличении 40×1,5×10. В каждом микропрепарате (1 препарат соответствует 1 корешку и одному проростку) анализируют около 500 клеток.

На микропрепаратах подсчитывают общее число клеток, число клеток на стадиях митоза: в профазе, метафазе, анафазе-телофазе; число клеток с нарушениями деления (число делящихся клеток с аберрациями); число клеток с остаточными ядрышками на стадии метафазы-телофазы митоза. Остаточные ядрышки выглядят как отдельные круглые или каплеобразные тельца, соединенные с хромосомами на стадии метафазы-анафазы митоза (Вострикова Т.В. Изучение суточной митотической активности у березы повислой / Т.В. Вострикова, А.К. Буторина // Цитология. - 2004. - Т. 46. - №6. -С. 520-524.).

Вычисляют следующие цитогенетические показатели: митотическую активность, показателем которой является митотический индекс - отношение числа делящихся клеток к общему числу подсчитанных клеток (в %), % клеток в профазе (отношение числа клеток в профазе к числу делящихся клеток), % клеток в метафазе (отношение числа клеток в метафазе к числу делящихся клеток), % клеток в анафазе-телофазе (отношение числа клеток в анафазе-телофазе к числу делящихся клеток), уровень патологий митоза (как отношение числа клеток с нарушениями митоза к общему числу делящихся клеток, в %), уровень клеток с остаточными ядрышками на стадии метафазы-телофазы митоза (как отношение числа клеток с остаточными ядрышками от общего числа клеток на указанных стадиях, в %). Классификацию патологических митозов проводят по И.А. Алову (Алов И.А. Цитофизиология и патология митоза. М.: Медицина, 1972. - 264 с).

Митотический индекс, подсчитанный с учетом стадии профазы, отражает пролиферативную активность меристематической ткани проростка.

Митотический индекс, подсчитанный без учета клеток на стадии профазы, является «репером» задержки клеток на стадиях митоза (Артюхов В.Г., Калаев В.Н. Цитогенетические показатели семенного потомства деревьев дуба черешчатого, подвергшихся воздействию радиоактивности в результате аварии на Чернобыльской АЭС и произрастающих на территориях с разным уровнем антропогенного загрязнения // Радиационная биология. Радиоэкология. 2005. Т. 45. №1. С. 619-628), что, по мнению И.А. Алова, является нарушением нормального протекания процесса митоза.

Увеличение числа клеток в профазе свидетельствует о задержке клеток на данной стадии в связи с хромосомными аберрациями и работой системы checkpoint-контроля целостности генетического материала (Л.И. Лебедева, И.Н. Федорова С.А., Трунова С.А., Омельянчук Л.В. Митоз. Регуляция и организация деления клеточного ядра // Генетика. -2004. - Т. 40. - №12. - С. 1589-1608). Увеличение числа клеток на стадии метафазы, согласно И.А. Алову, можно рассматривать как патологию митоза, связанную с повреждением веретена деления клетки и неспособности клеток перейти на следующую стадию митоза.

Проводили компьютерную статистическую обработку данных с помощью пакета программ "Stadia". Процедура группировки данных и их обработка изложены в работе А.П. Кулаичева Методы и средства комплексного анализа данных (А.П. Кулаичев. - М.: ФОРУМ: ИНФА-М, 2006. - 512 с.) Сравнение выборок по уровню патологий митоза и уровню клеток с остаточными ядрышками проводили с использованием Х-критерия рангов Ван-дер-Вардена, так как данные признаки не подчиняются нормальному распределению. Сравнение выборок по остальным цитогенетическим показателям и по флуктуирующей асимметрии производили по t-критерию Стьюдента. Для определения корреляционной зависимости использовали коэффициент корреляции рангов Спирмена (r_s).

В качестве критериев стабильности генетического материала соматических клеток семенного потомства используется совокупность цитогенетических характеристик (митотическая активность клеток (в %), число клеток на стадиях митоза (в %), уровень клеток с патологиями митоза (в %), уровень клеток с остаточными ядрышками на стадии метафазы-телофазы митоза (в %).

Полученные цитогенетические показатели каждого проростка сравнивают со значениями, представленными в таблице 1, и относят проросток к мутабильной или слабомутабильной группе. Если по некоторым цитогенетическим показателям проросток можно отнести к одной группе, а по другим к другой, то проросток относят к мутабильной или слабомутабильной группе по большинству исследованных цитогенетических характеристик.

На фиг. 1 приведена Таблица 1 критериев отнесения цитогенетических показателей семенного потомства Betula pendula к группам с разной стабильностью генетического материала.

На фиг. 2 и 3 приведены Таблицы 2 и 3 цитогенетических характеристик семенного потомства материнского растения Betula pendula №1 (продуцирующего цитогенетически нестабильное семенное потомство) и материнского растения Betula pendula №2 (продуцирующего цитогенетически стабильное семенное потомство), где № пр. - № препарата; МИ без П - митотический индекс без учета клеток, подсчитанных в стадии профазы, %; МИ, % - митотический индекс, подсчитанный с учетом стадии профазы; ПМ, % - уровень патологий митоза; ОЯ, % - уровень клеток с остаточными ядрышками; П, % - % клеток в стадии профазы; М, % - % клеток в стадии метафазы; А-Т, % - % клеток в стадии анафазы-телофазы; № гр - №группы: 1 - мутабильная, 2 - слабомутабильная.

На фиг. 4 приведена таблица 4 обобщенных цитогенетических характеристик и величины флуктуирующей асимметрии семенного потомства Betula pendula, где ФА, % - величина флуктуирующей асимметрии; * - различия параметров материнского растения 1 и 2 достоверны (Р<0,05).

Обозначения: № др - №дерева; МИ без П - митотический индекс без учета клеток, подсчитанных в стадии профазы, %; МИ, % - митотический индекс, подсчитанный с учетом стадии профазы; ПМ, % - уровень патологий митоза; ОЯ, % - уровень клеток с остаточными ядрышками; П, % - число клеток в стадии профазы; М, % - число клеток в стадии метафазы; А-Т, % -число клеток в стадии анафазы-телофазы; ФА, % - величина флуктуирующей асимметрии; * - различия параметров материнского растения 1 и 2 достоверны (Р<0,05).

Результаты анализа цитогенетических характеристик семенного потомства материнских растений представили в виде таблицы (фиг. 2-3).

В соответствии со значениями цитогенетических показателей, указанными в таблице 1, семенное потомство тестируемых материнских растений было разделено на две группы: мутабильную и слабомутабильную. Однако не во всех случаях цитогенетические показатели проростков строго соответствовали определенной группе. Например, проростки №1, 5, 6, 7, 9 материнского экземпляра №1 (табл. 2) имели высокий митотический индекс и низкий % клеток в стадии профазы, как в слабомутабильной группе (табл. 1). Остальные характеристики данных проростков соответствовали мутабильной группе, поэтому по большинству цитогенетических показателей их относили к мутабильной группе. Хотя проростки №3, 4 (табл. 2) по совокупности цитогенетических характеристик выделили в слабомутабильную группу, большинство проростков материнского растения Betula pendula №1 имели мутабильную группу, поэтому уровень стабильности генетического материала соматических клеток семенного потомства материнского растения №1 оценили как низкий.

Проростки № 1, 2, 4, 7, 11 материнского экземпляра №2 имели низкий митотический индекс, проростки № 4, 5 - высокий % клеток в стадии профазы, проростки № 5, 6 - высокий % клеток в стадии метафазы, проросток № 5 - высокий % клеток в стадии анафазы-телофазы, № 4, 11 - высокий уровень клеток с остаточными ядрышками на стадии метафазы-телофазы митоза (табл. 3), как в мутабильной группе (табл. 1). Однако по большинству цитогенетических характеристик все проростки материнского растения Betula pendula № 2 отнесли к слабомутабильной группе (табл. 3). В соответствии таблицей 1, уровень стабильности генетического материала соматических клеток семенного потомства материнского растения №2 оценивается как высокий.

Флуктуирующую асимметрию листовой пластинки материнских деревьев Betula pendula определяли в соответствии со шкалой В.М. Захарова (Здоровье среды: методика оценки / В.М. Захаров [и др.]. - М.: Центр экологической политики России, 2000. - 68 с; Здоровье среды: практика оценки / В.М. Захаров [и др.]. - М.: Центр экологической политики России, 2000. - 320 с). Уровень флуктуирующей асимметрии листьев материнских растений Betula pendula №1 и № 2 был в пределах нормального, поэтому качество среды (или местопроизрастания) деревьев можно оценить как нормальное. Согласно изобретению, вычисленную величину флуктуирующей асимметрии листа материнского растения сравнивали со значением 0,020. У экземпляра № 1 - 0,026, следовательно данное дерево продуцирует мутабильное семенное потомство. Экземпляр №2 имеет значение флуктуирующей асимметрии листа 0,020, что указывает на продуцирование слабомутабильного семенного потомства.

Сравнительный анализ цитогенетических характеристик семенного потомства и величины флуктуирующей асимметрии листьев материнских деревьев выявил различия между параметрами экземпляров №1 и №2 (табл. 4). Величина флуктуирующей асимметрии коррелировала с уровнем клеток с остаточными ядрышками: r_s=0,87 (Р<0,05) и уровнем патологий митоза: r_s=0,98 (Р<0,05). Таким образом, у материнского растения Betula pendula №1 (мутабильного), семенное потомство которого характеризуется низким митотическим индексом, большим числом клеток в профазе и метафазе, меньшим числом клеток в анафазе-телофазе, высоким уровнем патологий митоза и уровнем клеток с остаточными ядрышками на стадии метафазы-телофазы митоза, обнаружено увеличение флуктуирующей асимметрии листа. Семенное потомство материнского растения Betula pendula №2 (слабомутабильного) показало высокий митотический индекс, меньшее число клеток в профазе и метафазе, больше числом клеток в анафазе-телофазе, низкий уровень патологий митоза и клеток с остаточными ядрышками на стадии метафазы-телофазы митоза. Данное дерево с низким уровнем флуктуирующей асимметрии листовой пластинки можно определить как экземпляр с высокой стабильностью генетического материала соматических клеток семенного потомства.

Таким образом, способ отбора материнских растений Betula pendula с разной стабильностью генетического материала соматических клеток семенного потомства по уровню флуктуирующей асимметрии листовой пластинки, включающий диагностику морфометрических показателей листьев, обеспечивает экологическую оценку местопроизрастания и возможность выявления генетически стабильных экземпляров. Определение цитогенетических показателей проростков семян и выявление их корреляций с уровнем флуктуирующей асимметрии листа материнских растений позволяет провести проверку потомства. Исследование занимает 1 вегетационный сезон, т.е. значительно сокращается время постановки эксперимента по сравнению с традиционным индивидуальным отбором по морфологическим признакам.