Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ ОЦЕНКИ ПО ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКИМ ПОКАЗАТЕЛЯМ КАЧЕСТВА СЕМЯН RHODODENDRON LEDEBOURII POJARK

Изобретение относится к способам выращивания растений, а именно, к способам селекции, и может быть использовано для оценки качества семян Rhododendron ledebourii Pojark., в частности, отбора семенного потомства с высоким уровнем стабильности генетического материала, из которого могут быть получены сеянцы с лучшими морфометрическими показателями.

Для изучения исходного материала в селекции, а также выбора или разработки методов селекции, сортоизучения, размножения, сортоиспытания и получения быстрорастущего потомства необходима оценка качества семян. Несмотря на достигнутые успехи использования массового отбора, основные недостатки значительно снижают его эффективность. При массовом отборе на увеличение прироста в случае гетерогенности исходной популяции можно получить относительный, хотя и не очень большой эффект. Больших результатов можно ожидать при отборе на улучшение формы, а также на устойчивость к болезням. В целом, эффективность массового отбора зависит от наследуемости признака, размера популяции и ее гетерогенности (Царев А.П., Погиба С.П., Тренин В.В. Селекция и репродукция лесных древесных пород: Учебник/Под ред. А.П. Царева. - М.: Логос, 2003. - 520 с.). Однако при массовом отборе невозможно выделить конкретный ценный индивид для получения от него быстрорастущего потомства. Использование индивидуального отбора и смешанных методов (индивидуально семейного и семейно-группового) позволяет устранить данный недостаток. Однако, в свою очередь, они достаточно длительны (из-за поэтапной оценки потомства требуются десятки лет), ограничены в количестве отбираемых индивидов и не позволяют провести генетическую оценку качества семян.

Чаще всего оценка качества семян осуществляется на основе исследования фенотипических показателей. Отбор в питомниках и среди семян может включать сортировку растений по величине и по массе семян. В целом, в интересах хозяйства нельзя отказываться от отбора на высокую абсолютную массу семян, потому что растения с энергичным ростом в молодом возрасте быстрее уходят от различных опасностей (сорняки, обкусывание дичью, повреждение заморозками и т.п.). Однако нельзя и преувеличивать значение сортировки семян для достижения положительных результатов (Вересин М.М. Селекционный отбор быстрорастущих форм древесных пород при лесовыращивании // Науч. зап. Воронежского лесохозяйств. ин-та. Т. IX. - Воронеж: Воронежское обл. книгоизд-во, 1946. - С. 74-103; Добринов И. Генетика и селекция на дървесните видове. - София: Земиздат, 1983. - 290 с.). При всех одинаковых условиях выращивания (размещение, масса семян и плодов и др.) сортировкой растений по величине в однолетнем и более старшем возрасте удается незначительно изменить состав наследственной массы в направлении более быстрого роста в молодом возрасте (Царев А.П., Погиба С.П., Тренин В.В. Селекция и репродукция лесных древесных пород: Учебник/Под ред. А.П. Царева. - М: Логос, 2003. - 520 с.). Сортировка семян и отбор их по абсолютной массе также не позволяет исследовать генетические особенности семенного потомства и прогнозировать ростовые способности получаемых из них сеянцев. Цитогенетическая оценка качества семян позволяет производить отбор и одновременно проверку качества семенного потомства на ранних стадиях развития потомства на основании клеточных и субклеточных характеристик.

Применение цитогенетического метода оценки качества семян эффективно, поскольку он достаточно прост и быстр, позволяет адекватно определить стабильность генетического материала материнского растения и его семенного потомства (Вострикова Т.В. Изучение суточной митотической активности у березы повислой / Т.В. Вострикова, А.К. Буторина // Цитология. - 2004. - Т. 46. - №6. - С. 520-524; Вострикова Т.В. Цитогенетические реакции березы повислой на действие стрессовых факторов / Т.В. Вострикова, А.К. Буторина // Известия РАН. Серия биологическая. - 2006. - №2. - С. 232-238; Вострикова Т.В. Нестабильность цитогенетических показателей и нестабильность генома у березы повислой / Т.В. Вострикова // Экология. - 2007. - №2. - С. 88-92).

Оценка качества семян цитогенетическим методом включает сбор, проращивание семян, изготовление и анализ микропрепаратов. Исследование занимает 1 вегетационный сезон, т.е. значительно сокращается время постановки эксперимента по сравнению с традиционным индивидуальным отбором по морфологическим признакам.

Ранее были проведены работы по оценке качества семян березы повислой, на основании таких показателей как митотическая активность клеток, уровень цитогенетических нарушений группового способа отбора семенного потомства (Вострикова Т.В. Изучение суточной митотической активности у березы повислой / Т.В. Вострикова, А.К. Буторина // Цитология. - 2004. - Т. 46. - №6. - С. 520-524; Вострикова Т.В. Область использования цитогенетического метода в лесной генетике и селекции / Т.В. Вострикова // Лесное хозяйство. - 2006. - №1. - С. 30-32). Предлагаемый нами способ отличается тем, что предусматривает определение цитогенетических показателей семенного потомства, оценку качества семян каждого из материнских растений Rhododendron ledebourii Pojark. и отдельно каждого проростка (индивида), полученных от конкретного материнского экземпляра, т.е. индивидуальный сбор данных.

Известно использование группового способа отбора семян и оценки стабильности генетического материала семенного потомства по 16-18 цитогенетическим показателям (Артюхов В.Г., Калаев В.Н., Карпова С.С. Цитогенетический полиморфизм семенного потомства деревьев березы повислой (Betula pendula Roth.), произрастающих в различных экологических условиях // Экологическая генетика. 2009. Т. 7. №1. С. 30-40; Калаев В.Н., Попова А.А. Цитогенетический полиморфизм проростков семян деревьев дуба черешчатого (Quercus Robur L.) на территориях с разным уровнем антропогенного загрязнения // Проблемы региональной экологии. 2014 а. №2. С. 176-190). Для определения цитогенетических характеристик и морфологических показателей семенного потомства деревьев дуба черешчатого (Quercus robur L.) (Калаев В.Н., Попова А.А. Цитогенетические характеристики и морфологические показатели семенного потомства деревьев дуба черешчатого (Quercus robur L.), произрастающих на территориях с разным уровнем антропогенного загрязнения // Вестник Воронежского государственного университета. Серия Химия. Биология. Фармация. 2014, б. №4. С. 63-72) с каждой территории собирали около 150-200 семян, проращивали их во влажном песке, когда корешки проростков достигали длины 2-3 см, производилась их фиксация в смеси 96% этилового спирта и ледяной уксусной кислоты (3:1) в 22 ч (зимнее время), когда наблюдаются пики митотической активности и патологических митозов. После чего корешки проростков окрашивали ацетогематоксилином, изготавливали давленые препараты, проводили просмотр и на каждом препарате учитывали общее количество просмотренных клеток, количество делящихся клеток, находящихся в той или иной стадии митоза, количество и тип патологических митозов. На основании полученных данных определяли митотический индекс (доля делящихся клеток, %), долю патологических митозов среди общего числа делящихся клеток (%), распределения клеток по стадиям митоза (доля про-, мета-, ана-, телофаз, %), также была вычислена частота встречаемости различных по площади типов ядрышек (%). Была установлена связь между цитогенетическими показателями и ростовыми характеристиками у аборигенного вида - дуба черешчатого, однако для растений-инродуцентов такие данные отсутствуют.

Таким образом, определение уровня нарушений генетического материала, митотической активности клеток, числа клеток на стадиях митоза, ядрышковых характеристик (уровень клеток с остаточными ядрышками на стадии метафазы-телофазы митоза, площадь поверхности одиночных ядрышек), прямо или косвенно свидетельствующих о цитогенетической стабильности материнских растений и их семенного потомства, позволяет отбирать материнские экземпляры, продуцирующие сеянцы с лучшими морфометрическими показателями.

Задача изобретения - оценка по цитогенетическим показателям качества семян Rhododendron ledebourii Pojark. для получения сеянцев с лучшими морфометрическими показателями.

Технический результат заключается в разработке относительно быстрого и простого способа оценки качества семян Rhododendron ledebourii Pojark. по цитогенетическим характеристикам для отбора семенного потомства с высоким уровнем стабильности генетического материала и получения сеянцев с лучшими морфометрическими показателями.

Технический результат достигается тем, что в способе оценки по цитогенетическим показателям качества семян Rhododendron ledebourii Pojark. для получения сеянцев с лучшими морфометрическими показателями, включающем сбор и проращивание семян фенотипически здоровых материнских растений Rhododendron ledebourii Pojark., приготовление постоянно-давленного микропрепарата из корешка каждого проростка длиной 0,5-1 см, анализ цитогенетических показателей каждого микропрепарата, таких как «митотическая активность» как отношение числа делящихся клеток к общему числу подсчитанных клеток (%), «доля клеток на стадии профазы митоза» (%) как отношение числа клеток в профазе к числу делящихся клеток, «доля клеток на стадии метафазы митоза» (%) как отношение числа клеток в метафазе к числу делящихся клеток, «доля клеток на стадии анафазы-телофазы митоза» (%) как отношение числа клеток в анафазе-телофазе к числу делящихся клеток, «уровень патологий митоза» как отношение числа клеток с нарушениями митоза к общему числу делящихся клеток (%), ядрышковые характеристики «уровень клеток с остаточными ядрышками на стадии метафазы-телофазы митоза» как отношение числа клеток с остаточными ядрышками к общему числу клеток на указанных стадиях (%) и «средняя площадь поверхности одиночных ядрышек» (мкм²), согласно изобретению, сбор семян производят от каждого материнского растения в отдельности, проводят анализ не менее 19 микропрепаратов и не менее 500 клеток каждого микропрепарата, «средняя площадь поверхности одиночных ядрышек» определяется по 200 клеткам на каждом микропрепарате, полученные значения цитогенетических показателей сравнивают со значениями для мутабильной или слабомутабильной групп, причем показатель «митотическая активность» относится к мутабильной группе при значении не более 8%, «доля клеток на стадии профазы митоза» - при значении свыше 45%, «доля клеток на стадии метафазы митоза» - при значении свыше 25%, «доля клеток на стадии анафазы-телофазы митоза» - при значении не более 30%, «уровень клеток с остаточными ядрышками на стадии метафазы-телофазы митоза» - при значении свыше 8%, «средняя площадь поверхности одиночных ядрышек» - при значении от 76 мкм² и более, в противном случае показатели относятся к слабомутабильной группе; если более 3 показателей оказались в мутабильной группе, то и проросток относят к мутабильной группе, а если 3 и менее - то к слабомутабильной; если не менее половины проростков оказались в слабомутабильной группе, качество семян материнского растения оценивается как высокое, если менее половины - то как низкое.

В предлагаемом нами способе исследуется семенное потомство от индивидуального материнского растения и число исследуемых цитогенетических показателей, по которым адекватно оценивают уровень стабильности генетического материала проростков, уменьшено до 7, что значительно упрощает и ускоряет получение научных данных и позволяет внедрить результаты анализа в производство.

Использование в качестве критериев оценки качества семян и отбора быстрорастущего семенного потомства Rhododendron ledebourii Pojark. цитогенетических характеристик позволяет оценивать стабильность генетического материала проростков и выделять материнские растения, продуцирующие сеянцы с лучшими морфометрическими показателями.

В таблице 1 приведены критерии отнесения цитогенетических показателей семенного потомства Rhododendron ledebourii Pojark. к группам с разной стабильностью генетического материала.

Также приведены таблицы 2 и 3 цитогенетических характеристик семенного потомства материнского растения Rhododendron ledebourii Pojark. №1 (продуцирующего цитогенетически стабильное семенное потомство) и материнского растения Rhododendron ledebourii Pojark. №2 (продуцирующего цитогенетически нестабильное семенное потомство), где № пр. - № препарата; МИ, % - митотический индекс; П, % - % клеток в стадии профазы; М, % - % клеток в стадии метафазы; А-Т, % - % клеток в стадии анафазы-телофазы; ПМ, % - уровень патологий митоза; ОЯ, % - уровень клеток с остаточными ядрышками; площадь - средняя площадь поверхности одиночных ядрышек, мкм²; № гр - № группы: 1 - мутабильная, 2 - слабомутабильная.

Приведена таблица 4 обобщенных цитогенетических характеристики семенного потомства Rhododendron ledebourii Pojark., где различия цитогенетических характеристик материнского растения 1 и 2 достоверны: ** Р<0,01; *** Р<0,001.

Приведена таблица 5 морфометрических показателей сеянцев материнских растений Rhododendron ledebourii Pojark., продуцирующих цитогенетически стабильное (экземпляр 1) и цитогенетически нестабильное (экземпляр 2) семенное потомство, причем 1-й замер производили в марте, через 2 месяца после посева, 2-й замер - в сентябре (через полгода после посева), 3-й замер - в сентябре следующего года (через полтора года после посева), а различия показателей сеянцев материнского растения 1 и 2 достоверны: * Р<0,05; ** Р<0,01.

Способ реализуется следующим образом.

Для цитогенетического исследования семенного потомства Rhododendron ledebourii Pojark. используют зрелые семена, собранные от каждого в отдельности фенотипически здорового материнского растения (без визуальных повреждений паразитами). Семена проращивают в чашках Петри при температуре +25°С. По достижении корешками длины 0,5-1 см их фиксируют в 9 часов утра в ацетоалкоголе - смеси 96% этилового спирта и ледяной уксусной кислоты (3:1), после чего материал хранят в холодильнике при температуре +4°С. Из корешков проростков готовят постоянно-давленные микропрепараты с использованием жидкости Гойера, описанный ранее (Вострикова Т.В. Изучение суточной митотической активности у березы повислой / Т.В. Вострикова, А.К. Буторина // Цитология. - 2004. - Т. 46. - №6. - С. 520-524).

Корешки проростков подвергают мацерации в 18% растворе НСl при 60°С в течение 1-2 минут. Затем промывают в растворе 45% уксусной кислоты 15 минут. Корешки окрашивают ацетогематоксилином в течение 1-1,5 часов, ополаскивают дистиллированной водой и готовят давленные микропрепараты с использованием жидкости Гойера по методике: 1) отделить кончик корешка проростка (1-3 мм) препаровальной иглой; 2) поместить его на предметное стекло в каплю жидкости Гойера; 3) накрыть покровным стеклом и слегка подогреть над пламенем спиртовки (для лучшего распределения клеток); 4) придавить кончик корешка, постукивая легкими ударами ручкой препаровальной иглы.

Анализируют цитогенетические характеристики нечетного числа проростков семян от каждого экземпляра материнского растения, не менее 19. Препараты изучают с помощью микроскопа LABOVAL-4 (Carl Zeiss, Jena) при общем увеличении 40×1,5×10. В каждом микропрепарате (1 препарат соответствует 1 корешку и одному проростку) анализируют около 500-700 клеток.

На микропрепаратах подсчитывают общее число клеток, число клеток на стадиях митоза: в профазе, метафазе, анафазе-телофазе; число клеток с нарушениями деления (число делящихся клеток с аберрациями); число клеток с остаточными ядрышками на стадии метафазы-телофазы митоза. Остаточные ядрышки выглядят как отдельные круглые или каплеобразные тельца, соединенные с хромосомами на стадии метафазы-анафазы митоза.

Вычисляют следующие цитогенетические показатели: митотическую активность, показателем которой является митотический индекс - отношение числа делящихся клеток к общему числу подсчитанных клеток (в %), % клеток в профазе (отношение числа клеток в профазе к числу делящихся клеток), % клеток в метафазе (отношение числа клеток в метафазе к числу делящихся клеток), % клеток в анафазе-телофазе (отношение числа клеток в анафазе-телофазе к числу делящихся клеток), уровень патологий митоза (как отношение числа клеток с нарушениями митоза к общему числу делящихся клеток, в %), уровень клеток с остаточными ядрышками на стадии метафазы-телофазы митоза (как отношение числа клеток с остаточными ядрышками от общего числа клеток на указанных стадиях, в %). Классификацию патологических митозов проводят по И.А. Алову (Алов И.А. Цитофизиология и патология митоза. М.: Медицина, 1972. 264 с.). Для изучения ядрышковых характеристик в клетках корневой меристемы семенного потомства Rhododendron ledebourii Pojark. производят измерение диаметра одиночных ядрышек с помощью окулярмикрометра (анализируют по 200 клеток на каждом препарате) и высчитывают среднюю площадь поверхности одиночных ядрышек (в мкм²).

Увеличение числа клеток в профазе свидетельствует о задержке клеток на данной стадии в связи с нарушениями митотического аппарата и работой системы checkpoint-контроля целостности генетического материала (Л.И. Лебедева, И.Н. Федорова С.А., Трунова С.А., Омелъянчук Л.В. Митоз. Регуляция и организация деления клеточного ядра // Генетика. - 2004. - т. 40. - №12. - С. 1589-1608). Однако иногда повышается число клеток на стадии метафазы. Увеличение числа клеток на стадии профазы и метафазы, согласно И.А. Алову, можно рассматривать как патологию митоза, связанную с хромосомными аберрациями, что говорит о повреждениях генетического материала и неспособности клеток перейти на следующую стадию митоза.

В качестве критериев оценки качества семян используется совокупность цитогенетических характеристик (митотическая активность клеток (в %), число клеток на стадиях митоза (в %), уровень клеток с патологиями митоза (в %), уровень клеток с остаточными ядрышками на стадии метафазы-телофазы митоза (в %), площадь поверхности одиночных ядрышек (мкм²)) семенного потомства.

Полученные цитогенетические показатели каждого проростка сравнивают со значениями, представленными в таблице 1, и относят проросток к мутабильной или слабомутабильной группе. Если по некоторым цитогенетическим показателям проросток можно отнести к одной группе, а по другим к другой, то проросток относят к мутабильной или слабомутабильной группе по большинству исследованных цитогенетических характеристик.

Качество семян материнских растений оценивается по количеству мутабильных и слабомутабильных экземпляров у семенного потомства. При преобладании слабомутабильных проростков материнское растение относится к экземплярам, продуцирующим слабомутабильное потомство и проростки с лучшими морфометрическими показателями. Если большинство проростков относится к мутабильной группе, то материнский экземпляр можно считать продуцирующим мутабильное потомство и проростки с худшими морфометрическими показателями.

Пример

Использовали зрелые семена Rhododendron ledebourii Pojark., собранные от каждого в отдельности фенотипически здорового материнского растения (без визуальных повреждений паразитами). Семена разделили на две части. Для цитогенетического исследования в чашках Петри при температуре +25°С проращивали одну часть семян. По достижении корешками длины 0,5-1 см их фиксировали в 9 часов утра в ацетоалкоголе - смеси 96% этилового спирта и ледяной уксусной кислоты (3:1), после чего материал хранили в холодильнике при температуре +4°С. Из корешков проростков готовили постоянно-давленные микропрепараты с использованием жидкости Гойера.

Другую часть семян, собранных с каждого экземпляра анализируемых материнских растений, высевали в ящики с торфом в условиях закрытого грунта в трех повторностях по 100 штук (Доспехов Б.А. Методика полевого опыта (с основами статистической обработки результатов исследований). - М.: Колос, 1979. - 416 с.) Морфометрические показатели сеянцев Rhododendron ledebourii Pojark. определяли в каждой повторности: 1-й замер производили в марте, через 2 месяца после посева, 2-й замер - в сентябре (через полгода после посева), 3-й замер - в сентябре следующего года (через полтора года после посева). Длину корня, высоту побега измеряли с помощью линейки. Число листьев считается наиболее объективным признаком степени развития растения, поэтому этот показатель учитывается как основной морфометрический критерий оценки ростовой активности сеянцев.

Проводили компьютерную статистическую обработку данных с помощью пакета программ "Stadia". Процедура группировки данных и их обработка изложены в работе А.П. Кулаичева, Методы и средства комплексного анализа данных (А.П. Кулаичев. - М.: ФОРУМ: ИНФА-М, 2006. - 512 с.). Сравнение выборок по уровню патологий митоза и уровню клеток с остаточными ядрышками проводили с использованием Х-критерия рангов Ван-дер-Вардена, так как данный признак не подчиняется нормальному распределению. Сравнение выборок по остальным цитогенетическим и по каждому морфометрическому показателю производили по t-критерию Стьюдента.

Результаты анализа цитогенетических характеристик семенного потомства материнских растений представили в виде таблицы (табл. 2-3).

В соответствии со значениями цитогенетических показателей, указанными в таблице 1, семенное потомство тестируемых материнских растений было разделено на две группы: мутабильную и слабомутабильную. Однако не во всех случаях цитогенетические показатели проростков строго соответствовали определенной группе. Например, проростки №2, 3, 7, 8, 11, 12, 13 материнского экземпляра №1 имели низкий митотический индекс и высокий % клеток в стадии профазы, как в мутабильной группе (табл. 1). Остальные характеристики данных проростков соответствовали слабомутабильной группе, поэтому по большинству цитогенетических показателей их относили к слабомутабильной группе.

Все проростки материнского экземпляра 1 соответствовали слабомутабильной группе, проростки материнского экземпляра 2 относились к мутабильной группе.

Анализируя результаты исследования цитогенетических характеристик Rh. ledebourii, авторами установлено, что многие из них различались у семенного потомства материнских растений (табл. 4). Анализ цитогенетических характеристик семенного потомства материнского растения 1 показал, что оно обладает более высоким уровнем стабильности генетического материала: высоким митотическим индексом, меньшим числом клеток в профазе, большим числом клеток в анафазе-телофазе, низким уровнем патологий митоза и уровнем клеток с остаточными ядрышками на стадии метафазы-телофазы митоза, меньшей площадью поверхности одиночных ядрышек.

Таким образом, на основании исследования цитогенетических характеристик семенного потомства Rh. ledebourii можно отметить, что более материнское растение (экземпляр 1) продуцирует семенное потомство с высокой стабильностью генетического материала. Материнское растение (экземпляр 2) продуцирует семенное потомство с низкой стабильностью генетического материала.

Все морфометрические характеристики сеянцев от материнского растения (экземпляр 1), продуцирующего цитогенетически стабильное семенное потомство, были выше, чем у сеянцев, выращенных из семян материнского растения (экземпляр 2), продуцирующего цитогенетически нестабильное семенное потомство (различия достоверны, Р<0,05; Р<0,01; табл. 5).

Таким образом, применение цитогенетического метода оценки качества семян позволяет выявлять материнские растения, продуцирующие семенное потомство с лучшими морфометрическими показателями. Оценку качества семян по цитогенетическим показателям рекомендуется использовать в селекции древесных растений.