СПОСОБ МИКРОКЛОНАЛЬНОГО РАЗМНОЖЕНИЯ И ПОЛУЧЕНИЯ ПОСАДОЧНОГО МАТЕРИАЛА ВЕЙГЕЛЫ ПРИЯТНОЙ (WEIGELA SUAVIS (КОМ.) L.H.BAILEY) И ВЕЙГЕЛЫ ЦВЕТУЩЕЙ "ВАРИЕГАТА" (WEIGELA FLORIDA "VARIEGATA" BUNGE A. DC.)

Изобретение относится к растениеводству, лесному, лесопарковому и сельскому хозяйству, а именно к питомниководству.

Известен способ микроразмножения сирени, включающий выращивание побегов in vitro на искусственных питательных средах, дополненных антибиотиками, что упрощает получение стерильных культур (Патент РФ №2457669, A01G 7/00, опубл. 10.08.2012).

Недостатком данного метода размножения является то, что у растений в процессе размножения в присутствии антибиотиков наблюдаются нарушения роста и развития. Ранее было показано (Землянухина О.А., Калаев В.Н., Воронина B.C. Влияние антибиотиков на получение стерильных культур при микроклональном размножении пяти видов рода Campanula // Актуальные проблемы биологии, нанотехнологий и медицины: Матер. 6 международ. науч.-практич. конф. (1-3 октября 2015 г., г. Ростов-на-Дону). - Ростов-на-Дону: Издательство Южного федерального университета, 2015. - С. 117-118.), что однократная стерилизация канамицином приводит в течение развития адвентивных побегов к нарушению у них синтеза хлорофилла, приводящее к гибели эксплантов («смертельное отсутствие хлорофилла»). Клафоран в концентрации 250 мг/л, обычной при уничтожении свободноживущих бактерий во время генетической трансформации, увеличивает каллусообразование и замедляет рост побегов. Действие гентамицина, хотя и дает наибольший процент выживших эксплантов, тем не менее, в течение двух недель приводит к гибели растений. Эксперименты по дополнению самих питательных сред исследованными антибиотиками выявили постепенный некроз тканей растений и остановку в развитии, что свидетельствует о нецелесообразности их использования в качестве добавки к питательной среде.

Известен способ подготовки микропобегов in vitro ясеня, осины, ивы для последующего укоренения в условиях ex vitro (патент РФ 2565806, МПК А01Н 4/00, опубл. 20.10.2015), включающий перенос растений после стадии мультипликации на питательную среду WPM для элонгации, с добавлением сахарозы 30 г/л, агар-агара 9 г/л, инозитола 100 мг/л, пиридоксина 0,1 мг/л, тиамина 0,1 мг/л и никотиновой кислоты 0,5 мг/л, причем в среду для элонгации добавляют глутамин в концентрации 0,5 или 1,0 ммоль/л, при этом культивирование растений осуществляется при повышенной освещенности - от 5 до 8 тыс. люкс.

Недостатком данного способа является использование полной по минеральному составу среды WPM, что на данном этапе размножения часто приводит к появлению витрифицированных («остекленных») нежизнеспособных растений с недостаточно развитыми корнями. Наш способ предлагает питательную среду с половинным солевым составом, вдвое уменьшенным количеством сахарозы, без добавления глутамина, что способствует оздоровлению растений и удешевлению методики. Освещенность 5-8 тыс. люкс приводит к чрезмерно высокой температуре в помещении, что требует постоянной работы кондиционирующих устройств и, следственно, к удорожанию способа. Для размножения вейгелы достаточно 2500-3000 люкс, при этом температура в помещении держится на постоянном уровне.

Изобретение по патенту РФ 2485755 (МПК A01G 1/00, опубл. 27.06.2013), взятое за прототип, относится к способу выращивания посадочного материала и включает заготовку побегов, их стерилизацию, индукцию развития основного пазушного побега на первичных эксплантах, укоренение изолированных побегов, их мультипликацию в условиях in vitro, перевод побегов в нестерильные условия и высадку в почву. Причем микрочеренкование осуществляют на питательной среде WPM - Woody Plant Medium, со сниженным содержанием БАП - бензиламинопурин 0,2 мг/л и добавлением ГК - гиббереллиновой кислоты 0,2 мг/л. Высадку пробирочных микрорастений в нестерильные условия проводят без их предварительной адаптации к условиям климатической камеры. Использование данного способа позволяет производить качественный двухлетний посадочный материал в условиях открытого грунта.

Регенерация растений осуществляется на основе пролиферации пазушных меристем (прямой выгонки пазушных побегов), их укоренения и мультипликации полученных микрорастений, т.е. с помощью модели размножения, исключающей этап каллусообразования. При этом в качестве эксплантов используются узловые сегменты активно растущих летних неодревесневших (а не зимних одревесневших) побегов, применение гормональных питательных сред ограничивается всего одним сроком культивирования (один месяц) первичных эксплантов взрослых деревьев, а на этапе укоренения микропобегов, их доращивания и мультипликации используются одни и те же безгормональные среды.

Недостатком данного способа является то, что используются только летние неодревесневшие побеги, а для размножения вейгелы подходят и зимние, и летние побеги разного возраста, что становится возможным при дополнительной обработке антибиотиком. Кроме того, нами исключены стадии холодовой предобработки перед изоляцией эксплантов и дополнительной стерилизации раствором «Domestos», вдвое уменьшена концентрация стерилизующего агента «Белизна» (с 7 до 3-4%), убрано добавление дорогостоящего препарата Твин 20, он может быть заменен на любое бытовое моющее средство для мытья посуды (1 капля на 200 мл воды). После адаптации в нестерильных условиях однолетние, а не двухлетки, как в сравниваемом патенте, растения вейгелы переносятся в открытый грунт на сформированные грядки.

Настоящее изобретение решает задачу производства качественного посадочного материала гибридных пестролистных растений с высокими показателями роста и сохранением генотипа исходного растения с целью озеленения городских парков, клумб и создания плантационных насаждений.

Технический результат изобретения заключается в получении посадочного материала двух представителей рода вейгела (Weigela) - трудноукореняемого краснокнижного кустарника вейгела приятная (Weigela suavis (Коm.) L.H. Bailey) и пестролистного кустарника вейгела цветущая «вариегата» (Weigela florida «Variegata» Bunge A.D.C.) в виде нормально сформированных укорененных растений исходного генотипа.

Технический результат достигается тем, что в способе микроклонального размножения и получения посадочного материала вейгелы приятной (Weigela suavis (Коm.) L.H. Bailey) и вейгелы цветущей «вариегата» (Weigela florida «Variegata» Bunge A.D.C), включающем использование в качестве исходных эксплантов одно- и двухузловые сегментов весенних или летних побегов, их стерилизацию, выгонку пазушных побегов, мультипликацию и укоренение, которое осуществляется на питательной среде 1/2 WPM, перевод растений к нестерильным условиям и высаживание в грунт, согласно изобретению в качестве исходных эксплантов используют побеги вейгелы приятной (Weigela suavis (Коm.) L.H. Bailey) и вейгелы цветущей «вариегата» (Weigela florida «Variegata» Bunge A.D.C), проводят дополнительную поверхностную стерилизацию раствором бензилпенициллина 200 мг/л в течение 20-40 мин, выгонку пазушных побегов и мультипликацию осуществляют на питательной среде, содержащей половинный набор хлористого и азотнокислого кальция и макроэлементов 1/2 WPM, микроэлементы, витамины, хелат железа - согласно прописям Мурасиге и Скуга (MS), дополненной половинным количеством сахарозы 10-15 г/л, агар-агара 7 г, 6-бензиламинопурина 0,2 мг/л, гиббереллина 0,1 мг/г, мио-инозитола 100 мг/л, аскорбиновой кислоты 2 мг/л; проводят культивирование на светокультуральных стеллажах в условиях 16-часового периода освещения светодиодными лентами напряжением 12 В, мощностью 4.5 Вт/м, общая освещенность 2500-3000 люкс, причем на каждой полке добавлена лента с красными фотодиодами; после укоренения растения переносят в формы с промытым песком под микропарником, а в открытый грунт переносят после зимовки в лабораторных условиях.

На фиг. 1 приведена таблица 1 минеральных составов питательных сред в мг/л.

На фиг. 2 приведена таблица 2, отражающая влияние среды культивирования на мультипликацию побегов вейгелы приятной и вейгелы цветущей «вариегата» при микроклональном размножении.

На фиг. 3 приведено изображение, иллюстрирующее образование адвентивных побегов из пазушных почек вейгелы цветущей «вариегата» (вверху) и вейгелы приятной (внизу) на разных стадиях развития.

На фиг. 4 приведено изображение, иллюстрирующее рост, развитие и образование корней у растений вейгелы цветущей «вариегата» и вейгелы приятной.

На фиг. 5 приведено изображение, иллюстрирующее перевод стерильных растений вейгелы в горшечную культуру: А - растения в микротеплице после высадки из пробирок; Б - адаптированные в течение двух недель к условиям in vivo растения; слева - в. цветущая «вариегата», справа - в. приятная.

Предлагаемый способ микроклонального размножения двух видов вейгел реализуется следующим образом.

Пример

Стерилизация растительного материала. Побеги нарезают на отрезки 4-7 см длиной, протирают губкой со стиральным порошком, отмывают водопроводной водой. Затем промывают 10 минут на качалке в дистиллированной воде, содержащей каплю моющего средства для равномерного смачивания поверхностей, после чего осуществляют промывку проточной водой для удаления сапрофитной микрофлоры (20 минут). Все последующие действия производят в стерильных условиях ламинар-бокса. Первичные экспланты помещают в стерильные банки, заливают 4% раствором бытового отбеливателя «Белизна», содержащим 0.02-0.04% мертиолята. Время стерилизации - 20-40 минут. После этого растительный материал отмывают трижды по 10 минут дистиллированной водой на качалке. Последняя стадия стерилизации - поверхностная обработка раствором бензилпенициллина (200 мг/л) без отмывания в течение 20-40 мин.

Индукция развития пазушных почек. У эксплантов обрезают концевые участки, впитавшие стерилизующий раствор, нарезают на кусочки, содержащие одну-две пазушные почки, и помещают по одному в пенициллиновые пузырьки с питательной средой, заглубляя отрезки до почки. Используемая питательная среда - 1/2 Вуди Плант Медиум (1/2 Woody Plant Medium; 1/2 WPM), имеющая состав: соли кальция, мг/л: 36,3 - СаСl₂×2Н₂O, 284 - Са(NO₃)₂×4Н₂O; макроэлементы, мг/л: 495 - KNO₃, 185 - K₂SO₄, 200 - MgSO₄×7Η₂O) (Lloyd, G., McCown B. Commercially-feasible micropropagation of mountain laurel, Kalmia latifolia by use of shoot-tip culture // Proc. Inter. Plant Prop. 1980. V. 30. P. 421-427), содержащая половинное количество макросолей и сахарозы. Микроэлементы, витамины, хелат железа использованы согласно прописям Мурасиге и Скуга (MS) ((мг/л) 0,025 - СоСl₂×6Н₂O; 0,025 - CuSO₄×5Н₂O; 6,2 - Н₃ВО₃; 0,83 - ΚΙ; 16,9 - MnSO₄×Н₂O; 0,25 - Na₂MoO₄×2Н₂O; 8,6 - ZnSO₄×7Η₂O), хелат железа, мг/л: 27,8 - FeSO₄×7Н₂O; 37,3 - Na₂EDTA, витамины (мг/л): 0,5 - никотиновая кислота; 0,5 - пиридоксин-НСl; 1,0 - тиамин)) (Murashige Т., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue culture // Physiol. Plant. 1962. V. 15. P. 473-497), 0,2 мг/л 6-бензиламинопурина (БАП) и 0,1 мг/л гиббереллин (ГА₃). Низкая концентрация БАП в среде на всех этапах культивирования позволяет получать экспланты с хорошими ростовыми характеристиками без образования каллуса, который возникает при увеличении концентрации БАП до 0,5 мг/л. Количество побегов на 1 эксплант в течение месяца и длина главного побега в зависимости от среды культивирования представлены в таблице 2. Один сегмент дает в среднем 3 побега за 10 суток на протяжении 4-6 месяцев, что дает очень высокий коэффициент мультипликации.

Мультипликация и укоренение побегов. Пробирочные растения формируются в виде микрокустиков, которые повторно черенкуются для получения необходимых количеств вейгел (фиг. 3). Для укоренения вейгелы приятной используют питательную среду вышеуказанного состава (т.е. хлористый и азотнокислый кальций, макросоли по прописи 1/2 WPM, а микросоли, витамины и хелат железа - по прописи MS), но вместо БАП и ГА₃ используют 1 мг/л индолилуксусной (ИУК) совместно с 1 мг/л идолилмасляной кислоты (ИМК) или только 1 мг/л ИМК (фиг. 4). Вейгела цветущая «вариегата» укореняется на безгормональной среде. После укоренения растения для подращивания переносят в культивационные сосуды на безгормональную питательную среду WPM с половинным набором макросолей и сахарозы.

Укоренившиеся растения из условий in vitro переводят в условия in vivo для постепенной адаптации к нестерильным условиям. Микрорастения сажают в формы с промытым песком, накрывают минипарником с периодическим опрыскиванием водой и проветриванием (фиг. 5). После зимовки в условиях лаборатории или теплицы растения переносят в открытый грунт.

Культивирование проводят на светокультуральных стеллажах в условиях 16-часового периода освещения светодиодными лентами напряжением 12 В, мощностью 4.5 Вт/м (3 светодиода на 10 см ленты), общая освещенность 2500-3000 люкс. На каждой полке добавлена лента с красными фотодиодами. Светодиоды имеют преимущества в большом сроке службы: до 20-50 тысяч часов, в малом потреблении энергии и малом тепловыделении, что позволяет при большом количестве светокультуральных стеллажей поддерживать оптимальную температуру (23-26°С) в растильнях. Использование светодиодных лент позволяет снизить температуру в растильне, значительно уменьшить потребляемую мощность и улучшить световые условия для растений. Красная составляющая диодов увеличивает фотосинтез, скорость и развитие растений.