Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ МОЛОЧНОЙ КИСЛОТЫ

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии, в частности к способам культивирования молочнокислых бактерий и получения молочной кислоты, которая может быть использована в качестве предшественника для целого ряда продуктов, использующихся в промышленности для изготовления производственных и потребительских товаров, среди которых биоразлагаемые термопласты (полимолочная кислота), «зеленые растворители» (этил-, пропил-, бутилацетаты), окисленные химические вещества (пропиленгликоль) и многие другие.

Эффективность процесса биосинтеза молочной кислоты (МК) главным образом зависит от микроорганизма-продуцента МК и режимов культивирования. МК существует в двух диастереоизомерических формах: L(+) - и D(-). Микроорганизмы могут синтезировать оба стереоизомера как одновременно, так и по отдельности. Синтез зависит от наличия соответствующих лактатдегидрогеназ.

Известен способ получения МК путем сбраживания различных углеродсодержащих субстратов, в том числе отходов предприятий пищевой промышленности, с использованием различных микроорганизмов: бактерий, грибов, дрожжей, (Abdel-Rahman М. A., Tashiro Y. and Sonomoto К. Recent advances in lactic acid production by microbal fermentation processes // Biotechnol. Adv. - 2013. - Vol. 31. 877-902 pp.; Kleerebezem, R. Mixed culture biotechnology for bioenergy production / R. Kleerebezem, M.C.M. van Loosdrecht // Curr. Opin. Biotechnol. - 2007. Vol. 18. 207-212 pp.; Патент США №7300787), а также смешанных культур (Cui, F. Lactic acid production from corn stover using mixed cultures of Lactobacillus rhamnosus and Lactobacillus brevis / F. Cui, Y. Li, C. Wan // Bioresour. Technol. - 2011. - Vol. 102. 831-1836 pp.; Nancib, A. Production of lactic acid from date juice extract with free cells of single and mixed cultures of Lactobacillus casei and Lactococcus lactis I A. Nancib, N. Nancib, J. Boudrant // World J. Microbiol. Biotechnol. - 2009. -Vol. 25. 1423-1429 pp.).

Недостатками такого способа являются: образование в процессе ферментации нежелательных побочных продуктов, продуцирование смеси органических кислот либо образование молочной кислоты недостаточной степени оптической чистоты.

Известен способ получения молочной кислоты (Патент США №5786185), где в качестве питательного субстрата для молочнокислых бактерий используют сывороточный белок, кроме того добавляют также протеазы (ферменты класса гидролаз, которые расщепляют пептидную связь между аминокислотами в белках), необходимые для гидролиза белка с целью образования аминокислот в процессе ферментации. Жидкая питательная среда содержит также дрожжевой экстракт, K₂HPO₄, MgSO₄*7H₂O, MnSO₄*2H₂O, твин 80, лактозу для обеспечения оптимальной реакционной способности молочнокислых бактерий (Патент США №4749652; Патент США №5503750). В процессе ферментации контролируют рН водной суспензии для поддержания практически нейтральных или слабокислых значения для того, чтобы избежать накопления молочной кислоты в ферментативной среде, которая может ингибировать рост молочнокислых бактерий и их продуктивность. Таким образом, непрерывное добавление оснований, таких как гидроксид кальция, гидроксид натрия или аммиака преобразует молочную кислоту в лактат. Лактат в дальнейшем может быть переведен в молочную кислоту в результате реакции с кислотами.

Как правило, продуктивность простого периодического культивирования с поддержанием рН среды невелика. Наибольшая продуктивность отмечена у штаммов Lactobacillus casei, Lactobacillus bulgaricus, Lactococcus lactis ssp. lactis (Abdel-Rahman M. A., Tashiro Y. and Sonomoto K. Recent advances in lactic acid production by microbal fermentation processes // Biotechnol. Adv. - 2013. - Vol. 31. 877-902 pp.). Для повышения продуктивности процесса применяют различные способы непрерывного культивирования, каскад реакторов, системы с иммобилизованными клетками микроорганизмов, мембранный реактор (Патент США №5503750; Патент США №5635368).

Недостатками вышеуказанных способов следует признать повышенное содержание побочных продуктов биосинтеза и неутилизированных минеральных компонентов.

Одним из способов улучшения технологии является управляемое культивирование, а именно - контролируемый оксидативный стресс (ОС), который представляет собой оптимальное целенаправленное воздействие, при котором развивающаяся устойчивость к стрессорному воздействию ведет к благоприятным изменениям в метаболизме. Контролируемое стрессовое воздействие используется для повышения эффективности процессов культивирования, поскольку при определенных условиях при воздействии стрессовых факторов возможно улучшить отдельные показатели биосинтеза (Davies J. М. S., Lowry С.V. and Davies K. J. A. Transient adaptation to oxidative stress in yeast // Archives of biochemistry and biophysics. - 1995. - Vol. 317, issue 1. 1-6 pp.; De Angelis M., Calasso M., Cavallo J. et al. Fermentation and proteome profiles of Lactobacillus plantarum strains during growth under food-like conditions // Proteomics. - 2016. - Vol. 16. 946-962 pp).

Известен способ (Патент РФ №2394098; Патент РФ №2268924) получения биомассы дрожжей, заключающийся в культивировании дрожжей на углеводсодержащем субстрате в присутствии пероксида водорода, причем предварительно проводят адаптацию клеток дрожжей к пероксиду водорода. Затем осуществляют брожение при использовании подготовленного посевного материала и уровне освещения 40-90 мВт/л. Способ обеспечивает высокий выход биомассы дрожжей (прототип).

Также известно, что механизм фоторепарации присутствует у Lactobacillus casei (Srittmatter С.F. Flavin-linked oxidative enzymes of Lactobacillus casei // J. Biol. Chem. - 1959. - Vol. 234(10). 2794-2800 pp.) Таким образом, было интересно оценить возможность получения посевного материала культур МКБ с улучшенными физиолого-биохимическими характеристиками по аналогии с получением биомассы дрожжей (Патент РФ №2394098; Патент РФ №2268924), что может являться перспективным методом интенсификации биосинтеза молочной кислоты.

Технической задачей настоящего изобретения является получение L-молочной кислоты с высоким выходом (не менее 97%).

Сущность заявленного изобретения заключается в том, что разработан способ получения молочной кислоты, заключающийся в культивировании молочнокислых бактерий Lactobacillus paracasei ВКПМ В-4079, адаптированных к агенту оксидативного стресса Н₂О₂, с использованием источника дополнительного освещения при освещенности 300-3000 лк.

Технический результат настоящего изобретения заключается в получении L-молочной кислоты с выходом 97-98%.

В настоящем изобретении для культивирования МКБ использовали колбы Эрленмейера и биореактор. Объектом экспериментов являлись МКБ Lactobacillus paracasei ВКПМ В-4079, адаптированные к агенту оксидативного стресса Н₂О₂ по известной методике (A.S. Derunets. Using of oxidative stress for improvement of lactic acid biosynthesis // 18^th interntional multidisciplinary scientific geoconference SGEM 2018. - Vol. 18. - 2018. - P. 315-321). При культивировании оптимальная температура составляла 37°С, рН от 6,5 до 7,0.

Состав среды для культивирования МКБ Lactobacillus paracasei ВКПМ В-4079, г/л: глюкоза - 30 г/л, K₂HPO₄ - 2,0 г/л, MgSO₄ - 0,1 г/л, MnSO₄ - 0,05 г/л, источник азота и ростовых факторов (дрожжевой экстракт) - 7,5 г/л, вода - водопроводная. Компоненты питательной среды стерилизовали при 0,5 ати в автоклаве в течение 30 мин.

Сущность изобретения может быть проиллюстрирована следующими примерами:

Пример 1. Подготовка посевного материала (инокулята).

Ведение пассажей (пересевов) в колбах при внесении пероксида 0,3 г/л (типичная сублетальная концентрация) на конец экспоненциальной фазы роста, концентрация биомассы МКБ в ферментационной среде (среде культивирования) на момент внесения пероксида водорода составляет 2,36-2,54 г/л, при культивировании колбы освещаются источником дополнительного освещения (светодиодный источник белого света), освещенность при этом составляет от 300 лк до 3000 лк. Время культивирования составляет 20-24 часа (см. табл. 1, 2).

Пример 2. Подготовка посевного материала (инокулята).

Ведение пассажей (пересевов) в колбах при внесении пероксида 0,3 г/л на конец экспоненциальной фазы роста, концентрация биомассы МКБ в ферментационной среде (среде культивирования) на момент внесения пероксида водорода составляет 2,36-2,54 г/л, при культивировании колбы не освещаются источником дополнительного освещения. Содержимое колб экранируют и от видимого света светонепроницаемым материалом. Время культивирования составляет 20-24 часа (см. табл. 1, 2).

Пассивирование проводят до тех пор, пока не произойдет адаптация МКБ Lactobacillus paracasei к пероксиду водорода, т.е. пока доля мертвых клеток для пассивированной линии не станет равна доле мертвых клеток для контрольной линии (см. табл. 2). Источник дополнительного освещения используется для активации ферментов фоторепарации, что обеспечивает более быструю адаптацию к агенту стрессового воздействия. Кроме того, контролируют выход молочной кислоты, который увеличивается по мере пассивирования.

Контрольные варианты (Контроль) велись для каждого пассажа, результаты идентичны, поэтому в табл.2 контрольный вариант представлен одной строкой.

Видно, что при отсутствии дополнительного освещения, молочнокислые бактерии плохо адаптируются к стрессовому агенту (пероксид водорода),

выход молочной кислоты меньше по сравнению с контролем, в то время как при использовании источника дополнительного освещения молочнокислые бактерии адаптировались к пероксиду водорода, выход молочной кислоты больше, чем у контрольного варианта. Все это может свидетельствовать об активации механизма фоторепарации.

Посевной материал примера 1 после адаптации к пероксиду водорода (после 20-21 пассажа) используют в качестве инокулята для проведения стадии молочнокислого брожения в биореакторе, культивирование проводят в анаэробном режиме.

Пример 3. Проведение стадии молочнокислого брожения в биореакторе.

Стадию брожения проводят с использованием биореактора Minifors (INFORS НТ, Швейцария), общий объем которого составляет 5 л. Данный аппарат снабжен устройствами для измерения и регулирования температуры и рН среды, оборудован датчиком для измерения концентрации растворенного кислорода, сигнализатором уровня пены и приспособлением для пеногашения, а также резервуарами для хранения компонентов питательной среды и насосами для их непрерывной подачи в ферментер. Рабочий объем среды составляет 3 л. Скорость вращения мешалки - 150,0-200,0 об/мин. В ходе процесса осуществляют автоматическую подтитровку 25% раствором аммиака до значений кислотности среды 6,8. Используют питательную среду того же состава, что и в примерах 1,2 за исключением содержания глюкозы. При культивировании с использованием биореактора концентрация глюкозы составляет 110 г/л. В качестве источника дополнительного освещения используют светодиодный источник белого света, освещенность при этом составляет от 300 лк до 3000 лк.

Культивирование проводят в анаэробном режиме с использованием в качестве инокулята посевного материала примера 1 после адаптации к

пероксиду водорода (после 20-21 пассажа). Выход молочной кислоты при этом составляет 97-98%.

Таким образом, показана возможность существенного улучшения показателей роста МКБ и процесса молочнокислого брожения при сочетании воздействия на МКБ доз агента окислительного стресса (пероксида водорода) и антистресс-фактора - дополнительного освещения, что позволяет предложить новый способ получения молочной кислоты с высоким выходом.