Результат интеллектуальной деятельности: Антикоагулянтное лекарственное средство, представляющее собой синтетический дипептид Ac-Trp-Arg-Pip ⋅HCl, фармацевтическая композиция, включающая это антикоагулянтное лекарственное средство

Изобретение относится к медицине, а именно к созданию лекарственного средства, антикоагулянта прямого действия, на основе трипептида, ингибирующего одновременно и тромбин и фактор Ха (ФХа) и предназначенного для превентивной терапии ишемического инсульта и системных эмболий - сердечно-сосудистых патологий, обусловленных внутрисосудистым тромбообразованием.

Основной причиной тромбоза является нарушение функционирования коагуляционной системы крови. Любое нарушение системы кровообращения ведет к целому ряду серьезных заболеваний. Система свертывания крови является частью системы гемостаза, функция которого заключается в остановке кровотечения при повреждении кровеносного сосуда. Однако чтобы этот процесс происходил именно в нужном месте и в нужное время большинство компонентов в крови находятся в виде неактивных предшественников, активация которых носит каскадный характер, наиболее эффективно обеспечивающий образование тромба. Однако для каждой ступени каскада имеется система регуляции в виде кофакторов и компонентов фибринолитической системы. [1]]

Для предупреждения тромбозов и нормализации функционирования системы гемостаза можно воздействовать на различные ее звенья: применять антитромбоцитарные препараты, снижающие активацию и агрегацию тромбоцитов (антиагреганты), использовать антикоагулянты - антагонисты витамина К, снижающие синтез предшественников прокоагулянтных факторов, или ингибиторы протеиназ коагуляционной системы крови.

Антикоагулянты делят на прямые, действующие непосредственно на тромбин, или фактор Ха (ФХа), принимающий непосредственное участие в образовании активного тромбина, и непрямые, нарушающие процесс образования факторов свертывания в печени.

Наиболее широко используемым непрямым антикоагулянтом является варфарин, который входит в десятку самых часто назначаемых сердечно-сосудистых препаратов. Он блокирует превращение витамина К в его активную форму, которая участвует в биохимических реакциях на завершающих стадиях синтеза факторов свертывания крови II (тромбин), VII, IX, X. Поскольку антикоагулянтный эффект от применения варфарина наступает не сразу, это средство предназначено для длительной или пожизненной антикоагулянтной терапии. [2].

Недостатками варфарина являются как узкий терапевтический диапазон, требующий аккуратного подбора дозы, так и постоянное мониторирование свертывающей способности крови (MHO) с целью поддержания эффективной концентрации препарата и профилактики геморрагических осложнений. Кроме того, имеется огромный список лекарственных взаимодействий, продуктов питания, содержащих витамин К, а также наличие генного полиморфизма что определяет различную индивидуальную чувствительность к варфарину. [3].

Прямые антикоагулянтные средства представлены:

Во-первых группой гепаринов - сульфатированных гликозаминогликанов различного молекулярного веса, выделяемых из слизистой оболочки кишечника свиньи и из легких крупного рогатого скота, а также синтетическими аналогами гепарина. Гепарин ингибирует тромбин и фактор Ха только в комплексе с антитромбином III (AT).. В отечественной практике используют следующие препараты низкомолекулярных гепаринов: эноксапарин натрия (Клексан), надропарин кальция (Фраксипарин), далтепарин натрия (Фрагмин), сулодексид (Вессел-дуэ Ф).

Основным и недостатками применения гепаринов являются геморрагические проявления из-за увеличения проницаемости сосудов, а также истощение AT при длительном применении в больших дозах является, что может вызвать состояние гиперкоагуляции и стать причиной тромбоза. [4].

Во-вторых, белковым физиологическим антикоагулянтом антитромбином III, который выделяют из плазмы крови доноров, поэтому при его введении нельзя полностью исключить риск возникновения заболеваний, вызванных переносом инфекционных возбудителей, в том числе неизвестного происхождения. Кроме того, как и при введении других компонентов плазмы, могут возникать различные нежелательные явления и анафилактоидные или анафилактические реакции. Более того самостоятельно антитромбин обладает слабым антикоагулянтным действием, ингибируя практически все протеазы свертывания (за исключением фактора VII), плазмин, трипсин, а также Cls компонент комплемента.

К прямым ингибиторам тромбина относится гирудин - белок, впервые обнаруженный в слюнных железах медицинских пиявок Hirudo medicinalis. Селективно связываясь с тромбином гирудин необратимо ингибирует не только свободный, но и связанный с тромбом. В РФ переоформлено Регистрационное удостоверение для препарата Ангиокс, действующим веществом в котором является бивалирудин - 20-членный полипептид гирудина.

Все рассмотренные выше антикоагулянты представляют собой инъекционные препараты, что существенно осложняет их применение вне клинических условий, кроме того большая часть из них импортного производства.

В последние годы разработан ряд антикоагулянтов нового поколения для орального применения - новые оральные антикоагулянты (НОАК). Это низкомолекулярные синтетические соединения, которые эффективно ингибируют тромбин и ФХа. Все они исключительно импортного производства.

Зарегистрированный в РФ лекарственный препарат Прадакса (Германия) представляет собой пролекарство, на основе ингибитора тромбина дабигатрана. Препарат широко используют в клинической практике для профилактики инсульта, особенно у больных с неклапанной фибрилляцией предсердий [5], хотя при его применении достаточно высок риск возникновения ИМ. Главным побочным эффектом, связанным с использованием дабигатрана, считается желудочно-кишечное кровотечение.

Ривароксабан - разработанный и производящийся фирмой Bayer AG в кооперации с фирмой Johnson & Johnson Pharmaceutical Research & Development зарегистрирован в РФ под названием Ксарелто. Ривароксабан конкурентно ингибирует коагуляционный фактор Ха. Официально утвержденными показаниями лечения ривароксабаном являются профилактика инсульта и системных эмболий при неклапанной фибрилляции предсердий, лечении тромбоза глубоких вен и тромбоэмболии легочной артерии, а также профилактика венозной тромбоэмболии.

Фирмой Пфайзер Инк (США) выпускается препарат Эликвис, действующим веществом в котором является апиксабан - ингибитор фактора Ха. Основные показания к назначению препарата Эликвис полностью повторяют таковые для ривароксабана.

Общим побочным эффектом для этих препаратов является повышенный риск развития скрытого или явного кровотечения, и, как следствие, развитие постгеморрагической анемии. Риск возникновения кровотечений при терапии пероральными антикоагулянтами усугубляется отсутствием антидотов к ним. Если при терапии варфарином исправить ситуацию может введение витамина К, то антидотов к НОАК не существует. Кроме того отсутствие необходимости регулярного антикоагуляционного мониторинга может привести к позднему обнаружению кровотечения или тромбоза. [6].

Кроме того следует учесть, что дабигатран (Прадакса) элиминируется из организма почками в неизменном виде, поэтому для пациентов с почечной недостаточностью его применение ограничено. Ривароксабан (Ксарелто) и апиксабан (Эликвис) напротив, в основном метаболизируются в печени поэтому их применение ограничено для пациентов с почечной недостаточностью.

Таким образом, все имеющиеся на сегодняшний день препараты имеют ограничения в применении и побочные эффекты, что лимитирует их использование.

Для лечения и профилактики целого ряда заболеваний разработаны стандарты и клинические рекомендации, руководствуясь которыми врач назначает препараты той или иной фармакологической группы с учетом имеющихся у пациента заболеваний, лекарственных взаимодействий и возможных побочных процессов [7-9]. Ксарелто, Эликвис и Прадакса входят в список жизненно необходимых и важных лекарственных препаратов (ЖНВЛП), но включены не во все стандарты лечения. Для расширения спектра показаний необходимо проведение дополнительных клинических исследований.

Учитывая все вышесказанное создание отечественных эффективных и безопасных низкомолекулярных синтетических ингибиторов тромообразования для превентивной терапии ишемического инсульта и системных эмболий различного генеза является весьма актуальной задачей современной фармацевтики и фармакологии.

Весьма перспективными с этой точки зрения являются низкомолекулярные пептидные соединения, специфически действующие только на ферменты-мишени, и обладающие низкой токсичностью, так как они являются природоподобными веществами.

Известно, что в активном центре тромбина эффективно связываются пептиды, содержащие остаток аргинина. Заявителями исследованы ингибирующие свойства ряда аргинин-содержащих пептидов и запатентован наиболее эффективный обратимый ингибитор тромбина - Fta-Gly-Arg-Pip (RU 2377246). Однако при получении этого соединения используется фталевый ангидрид, обладающий общетоксическим действием. Кроме того при разложении этого пептида в организме образуется достаточно токсичная фталевая кислота, которая оказывает негативное влияние на эндокринную систему.

Задачей настоящего изобретения является расширение арсенала антикоагулянтных лекарственных средств.

Поставленная задача решена

- созданием антикоагулянтного лекарственного средства, представляющего собой синтетический дипептид Ac-Trp-Arg-Pip⋅HCl или его фармацевтически приемлемые соли.

- разработкой фармацевтической композиции, включающей в качестве действующего вещества синтетический дипептид Ac-Trp-Arg-Pip⋅HCl или его фармацевтически приемлемые соли и вспомогательные вещества:

микрокристаллическую целлюлозу и стеариновую кислоту и/или ее фармацевтически приемлемую соль, при следующем соотношении компонентов, мас. %:

Заявляемый синтетический дипептид Ac-Trp-Arg-Pip HCl является низко токсичным лекарственным средством и действует одновременно на два основных фермента коагуляционной системы крови: тромбин и фактор Ха, эффективно снижая концентрацию активного тромбина в крови и препятствуя тромбообразованию, вызванному нарушением в функционировании коагуляционной системы крови.

Изобретение подтверждено следующими примерами:

Пример 1. Получение дипептида Ac-Trp-Arg-Pip⋅HCl

Пептид (Ас- ацетил, Pip - пиперидин-4-ил) получают последовательным наращиванием пептидной цепи, начиная с замещенного амида аргинина.

Замещенный амид аргинина 2HCl⋅H-Arg-Pip получают путем взаимодействия

Boc-Arg-OH (27,5 г) с N,N'-дициклогексилкарбодиимидом (20,7 г) и N-гидроксисукцинимидом (6,3 г) и пиперидином (10 мл) в диметилформамиде [10]. Boc-защитную группу с Boc-Arg-Pip удаляют стандартным методом путем обработки 4 М раствором хлористого водорода в диоксане [11]. Выход HCl⋅H-Arg-Pip 25,0 г (90%)

Активированный эфир Boc-Trp-OPƒp получают стандартным методом путем реакции о Вос-Trp-ОН с N,N'-дициклогексилкарбодиимидом в тетрагидрофуране с последующей кристаллизацией продуктов из смеси диэтилового эфира и гексана [11].

Получение дипептида 2HCl* H-Trp-Arg-Pip. К охлажденному до 0°С раствору Boc-Trp-OPfp (25,9 г) в 120 мл в ДМФА добавляют раствор 17,5 г 2HCl*H-Arg-Pip в 150 мл ДМФА и 10 мл DIPEA и перемешивают реакционную смесь в ледяной бане в течение 2 ч, затем оставляют перемешиваться на ночь при комнатной температуре. Реакционную смесь упаривают на роторном испарителе, полученный остаток растворяют в смеси воды (350 мл), метанола (40 мл) и диэтилового эфира (350 мл), водный слой отделяют от эфирного в делительной воронке, подкисляют 10% HCl до рН=3-3,5 при интенсивном перемешивании и промывают диэтиловым эфиром, по каплям прибавляют 5 М NaOH до рН=9,5-10, и снова промывают дтэтиловым эфиром. К водному раствору добавляют сухой NaCl (75 г) и н-бутанол (300 мл), двухфазный раствор перемешивают до полного растворения солей, переносят в делительную воронку, водный слой промывают бутанолом (150 мл), объединенные вытяжки бутанола сушат над безводным Na₂SO₄ в течение 10 минут. Раствор фильтруют с помощью стеклянного фильтра, и упаривают на роторном вакуумном испарителе до состояния вязкого масла. Остаток растворяют в ацетоне (500 мл), полученный мутный раствор профильтровывают с целитом и упаривают. Вос-защитную группу с полученного масла HCl* Boc-Trp-Arg- удаляют стандартным методом путем обработки 4 М раствором хлористого водорода в диоксане [11]. Выход 2HCl*H-Arg-Pip 15,6 г, 62%.

Получение заявляемого дипептида Ac-Trp-Arg-Pip HCl. 15,42 г 2HCl⋅H-Trp-Arg-Pip растворяют в ДМФА (100 мл), добавляют уксусный ангидрид (5,6 г;) и раствор охлаждают на ледяной бане до 0°С. Затем в реакционную смесь в течение 10 мин добавляют по каплям 10 мл DIPEA, реакционную смесь перемешивают в течение 3-х ч при комнатной температуре, раствор упаривают на роторном испарителе. Полученный остаток затирают в диэтиловом эфире (300 мл) в течение 4-х часов, затем оставляют на ночь в холодильнике. Выпавшие кристаллы отделяют на стеклянном фильтре, промывают эфиром (3×80 мл) и гексаном (100 мл) и сушат в вакууме. Полученный продукт растворяют в этаноле (150 мл) и добавляют активированный уголь (10 г), перемешивают смесь в течение 30 мин, уголь отфильтровывают, промывают этанолом (3×100 мл), объединенные фракции этанольного раствора упаривают, маслообразный остаток растворяют в изопропаноле (120 мл), раствор профильтровывают и упаривают до состояния затвердевшей пены. К остатку добавляют ацетон (150 мл) и остаток затирают в этом ацетоне в течение 4-х часов, затем оставляют на ночь в холодильнике. Выпавшие кристаллы фильтруют, промывают холодным ацетоном (2×50 мл) и гексаном (50 мл) и сушат в вакууме. Выход Ac-Trp-Arg-Pip HCl 6,78 г, 43,2%,

Пример 2. Получение лекарственной формы заявляемого лекарственного средства-таблетка

Получение массы для таблетирования осуществляют путем смешивания предварительно просеянных 294,00 г целлюлозы микрокристаллической, 300,00 г дипептида и 6,00 г магния стеарата. Полученную смесь перемешивают со скоростью вращения мешалки 300 об/мин в течение 15 минут. Массу для таблетирования прессуют в таблетки по 0,300 г стандартным способом [12]. После обеспыливания готовых таблеток их покрывают пленочной оболочкой указанного состава стандартным способом [13]

Пример 3. Исследование ингибирующего действия заявляемого лекарственного средства на амидазные активности сериновых протеиназ системы гемостаза и пищеварительных ферментов

При выборе структуры пептидного ингибитора ферментов свертывания крови учтены конформационные требования активных центров тромбина и ФХа, однако исследование влияния различных концентраций Ac-Trp-Arg-Pip HCl на собственные амидазные активности ферментов фибринолитической системы плазмина и урокиназы. а также пищеварительных ферментов, попадающих в кровь из поджелудочной железы, проведены с целью подтвердить селективность действия ингибитора.

Оценку влияния дипептида Ac-Trp-Arg-Pip HCl_на активность ферментов проводят стандартным методом, путем определения кинетических констант по измерению начальных скоростей гидролиза соответствующих хромогенных субстратов [14]. Скорости гидролиза различных концентраций субстрата ферментами в присутствии ингибитора определяют из начальных участков кинетических кривых А₄₀₅ - t на спектрофотометре UV-1202 («Shimadzu», Германия). Каждый эксперимент дублирован. Начальные скорости определены по зависимости изменения А₄₀₅ во времени. На основании величин зависимостей Лайнуивера-Берка вычислены кинетические параметры ингибирования гидролиза субстрата IC50 и константы ингибирования K₁ Все эксперименты проведены в трех повторностях.

Отсутствие ингибирования плазмина, урокиназы, трипсина и химотрипсина свидетельствует об отсутствии связывания дипептида с этими ферментами, и, следовательно, не изменяет его эффективную концентрацию в организме.

Пример 4. Оценка антикоагулянтного действия заявляемого лекарственного средства in vivo при внутривенном введении

Оценку антитромботической активности лекарственного средства проводили на модели венозного стаза у крыс-самцов линии Wistar, согласно «Руководству по доклиническому исследованию лекарственных средств» под редакцией Миронова А.Н.

Наркотизированным животным (нембутал, 40 мг/кг, внутрибрюшинно) в левую яремную вену введен дипептид Ac-Trp-Arg-Pip HCl в дозе 30 мг/кг объемом 1 мл. Контрольным животным введен 0,9% раствор NaCl в эквивалентном объеме. С целью подавления защитной реакции противосвертывающей системы в эту же вену введен раствор атропина сульфата в дозе 5 мг/кг. Для моделирования тромбоза через 15 минут после введения дипептида Ac-Trp-Arg-Pip HCl или 0,9% раствора NaCl в контроле свертывающую систему крови крыс активируют сывороткой человека. Затем перевязывают нитью участок вены (0,7 см), который не использован для введения веществ (правая яремная вена).

Эффективность антитромботической активности оценивают:

1) по форме тромба, извлеченного из перевязанного участка вены,

2) по весу влажного тромба на аналитических весах.

Введенный заявляемый дипептид дает выраженный антитромботический эффект, а именно - в поле зрения несколько микроскопических нитей; в контроле - эффект отсутствует - в поле зрения один большой тромб.

Из результатов, представленных в таблице 2, следует, что введенный заявляемый дипептид дает выраженный эффект - вес образовавшегося тромба в присутствии дипептида почти в 4 раза меньше, чем в контроле.

Пример 5. Оценка антикоагулянтного действия заявляемого лекарственного средства in vivo при внутрижелудочном введении

Лекарственное средство на основе синтетического дипептида_Ac-Trp-Arg-Pip HCl входит в состав таблетки. Для введения этого средства крысам разработана модель венозного стаза у крыс-самцов линии Wistar при внутрижелудочном введении антикоагулянта - дипептида Ac-Trp-Arg-Pip HCl в адекватной лекарственной форме - в виде таблетмассы.

Таблетмасса, приготовленная как в примере 2, плохо растворима в воде, поэтому суспензию таблетмассы готовят в 1% растворе крахмала. Полученную суспензия переносят в стерильные пробирки с навинчивающимися крышками.

Перед введением смесь встряхивают и с помощью специального зонда для внутрижелудочного введения с булавовидным наконечником крысам вводят в дозах 1 ЭТД, 2ЭТД и 3 ЭТД (ЭТД - эффективная терапевтическая доза) объемом 1 мл. Контрольным животным внутрижелудочно вводят 1% раствор крахмала в соответствующем объеме.

Животные анестезированы 1,5% изофлурановым наркозом. Крысы дышали самостоятельно, без интубирования. Для моделирования тромбоза через 30 минут после внутрижелудочного введения суспензии активируют свертывающую систему крови крыс сывороткой человека. Затем перевязывают нитью участок вены (0,5-0,7 см) (правая яремная вена).

Эффективность антитромботической активности оценивают по:

форме тромба, извлеченного из перевязанного участка вены (баллы);

весу влажного тромба на аналитических весах (г).

Оценка формы тромба, извлеченного из перевязанного участка вены

- 0 и 1 балл - выраженный антитромботический эффект, в поле зрения сгустка либо нет, либо несколько микроскопических нитей;

- 2 балла - умеренный антитромботический эффект, в поле зрения несколько маленьких тромбиков;

- 3 и 4 балла - эффект отсутствует или незначителен, в поле зрения один большой или 2-3 тромба меньшего размера).

Пересчет системы баллов на процент предотвращения тромбоза проводили по следующей формуле: [1-(Sa/4n)]×l00,

где а - антитромботический эффект в баллах, n - число экспериментов;

Результаты исследования антитромбической активности заявляемого дипептида, оцененные в соответствии с «Руководством по доклиническому исследованию лекарственных средств» под редакцией Миронова А.Н., представлены в таблице 3. Дозы даны по действующему веществу.

Эффективность антитромбического действия заявляемого дипептида в опытных группах с однократным внутрижелудочным введением в дозах 30-90 мг/кг статистически значимо на различалась и составляла 75%, 82,5% и 87,5%, соответственно.

Количество баллов в опытных группах крыс, отражающих форму тромба, достоверно меньше, чем в контрольной группе животных с внутрижелудочным введением 1% раствора крахмала. В поле зрения либо не наблюдалось сгустка, либо был 1 маленький тромб в виде микроскопической нити. В контрольной группе крыс в поле зрения яремной вены после ее выделения видны большие тромбы.

Масса влажного тромба в опытных группах достоверно меньше, чем в контрольной группе животных.

Таким образом, получено антикоагулянтное лекарственное средство, представляющее собой синтетический дипептид Ac-Trp-Arg-Pip HCl, ингибирующий в отличие от ближайшего аналога сразу два фермента свертывающей системы крови и не содержащий токсичную фталильную группировку. Эффективность антикоагулянтного действия заявляемого средства и фармацевтической композиции на его основе подтверждена экспериментами in vivo при внутривенном и внутрижелудочном введении экспериментальным животным.

Источники научно-технической информации

1. М.А. Пантелеев, Ф.И. Атауллаханов/ «Свертывание крови: методы исследования и механизмы регуляции.» //Клиническая онкогематология, 2008, т 1, «2,174-1810]

2. Богачев В.Ю. Варфарин …Смерть откладывается // РМЖ. 2013. №15. С. 797

3 Профилактика тромбоэмболических осложнений при фибрилляции предсердий крысиный яд или новые пероральные антикоагулянты: есть ли у нас выбор и стоит ли бояться его сделать? Первый клинический опыт применения ривароксабана в нижнем Новгороде» Королева Л.Ю., Колесниченко И.В., Носов В.П., Гриценко И.И., Тимощенко Е.С.// Рациональная фармакотерапия в кардиологии, 2014, 10 (3), 303-306)

4. А.Л. Мелкумян, А.Л. Берковский, Р.С. Кишинец, А.А. Козлов. «Мониторинг эффективности применения прямых антикоагулянтов»// Гематол. и трансфузиол., 2013, т. 58, №1, 32-38

5. Николаева И.Е., Янбаева С.М., Залалдинова A.M., Ишманова А.Р., Гареева Н.Х., Хмелевских Н.А. Опыт применения дабигатрана этексилата в различных клинических ситуациях у пациентов с фибрилляцией предсердий // РМЖ. 2015. №5. С. 280

6. Stephan Н. Schirmer, MD, PHD; Magnus Hans-Ruprecht Neuberger,; Stefan H. Hohnloser, Isabelle C. van Gelder,; Gregory Y. H. Lip, Michael «Novel Anticoagulants for Stroke Prevention in Atrial Fibrillation, Current Clinical Evidence and Future Developments»//J Am Coll Cardiol 2010; Vol. 56, №25: 2067-2076

7. Стандарт скорой медицинской помощи при инсульте утвержден Приказом Министерства здравоохранения Российской Федерации от 20 декабря 2012 г. №1282 н

8. Стандарт скорой медицинской помощи при остром нарушении мозгового кровообращения, утвержден Приказом Министерства здравоохранения РФ от 5 июля 2016 г.N466н

9. НАЦИОНАЛЬНЫЙ СТАНДАРТ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ ГОСТ Р 56377-2015 КЛИНИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ (ПРОТОКОЛЫ ЛЕЧЕНИЯ) ПРОФИЛАКТИКА ТРОМБОЭМБОЛИЧЕСКИХ СИНДРОМОВ, Божкова С.А., Буланов А.Ю., Вавилова Т.В., Воробьев П.А., Домашенко М.А., Краснова Л.С., Леонтьев С.Г., Момот А.П., Морозов К.М., Ройтман Е.В., Сусин С.В., Сычев Д.А., Явелов И.С., Яковлев В.Б //. ПРОБЛЕМЫ СТАНДАРТИЗАЦИИ В ЗДРАВООХРАНЕНИИ 2015, №7-8, с. 28-68

10 Maxim E. Sergeev, Tatiana L. Voyushina. «Convenient synthesis of novel natural amino acid cyclic amides for use as building blocks for proteinase inhibitors». Letters in Organic Chemistry, 2006, №3, 857

11. А.А. Гершкович, В.К. Кибирев. «Синтез пептидов. Реагенты и методы». Киев, Наукова Думка, 1987,

12. Промышленная технология лекарств. Учебник. В 2-х томах. Под редакцией профессора В.И. Чуешова. - X.: МТК-Книга; Издательство НФАУ, 2002. 1-й том 560 с. 2-й том 716 с

13 Ажгихин И.С. Технология лекарственных форм. М., Медицина, 1980 г

14. Диксон М., Уэбб Э. Ферменты: - Пер с англ. - М.: Мир, 1982. том 1 - 392 с.

15. «Руководство по доклиническому исследованию лекарственных средств» под редакцией Миронова А.Н. Москва, 2012 г.