Результат интеллектуальной деятельности: Рекомбинантный штамм дрожжей Komagataella kurtzmanii - продуцент бета-глюканазы

Изобретение относится к микробиологии и биотехнологии и касается получения штамма дрожжей Komagataella kurtzmanii, способного продуцировать бета-глюканазу (β-глюканазу).

β-глюканы представляют собой семейство полисахаридов, состоящих из мономеров D-глюкозы, соединенных посредством β-гликозидных связей и являются естественным компонентом клеточных стенок бактерий, грибов, дрожжей и злаков, таких как овес и ячмень. β-глюканы различного происхождения различаются структурой, уровнем разветвления и молекулярной массой, а также физико-химическими свойствами.

β-глюканазы - группа ферментов, катализирующих расщепление β-глюканов с β-1,2-, β-1,3-, β-1,4- и β-1,6-связями.

Важное значение среди ферментов, относящихся к этой группе имеют β-1,3-1,4-глюканазы, которые находят широкое применение, в частности, при производстве пищевых добавок [FEBS Lett., 1975, 52, 202-207], где их используют в качестве добавки к кормам сельскохозяйственных животных с однокамерным желудком. Корм для домашних животных, смешанный с ферментами β-1,3-1,4-глюканазы и ксиланазы, усиливает увеличение веса, потребление корма и усвояемость азота (+5,6%) и липидов (+6,2%), а также уменьшает образование липкого помета, что существенно уменьшает санитарные проблемы [Trends in Biotechnology, 1993, 11(10), 424-430].

Природными источниками β-глюканаз являются различные микроорганизмы: бактерии, грибы, дрожжи и актиномицеты

Большинство кормовых ферментных препаратов, в состав которых входят β-глюканазы, имеют грибное происхождение. Однако, большой интерес представляет разработка рекомбинантных продуцентов ферментов на основе дрожжей, поскольку они более удобны для проведения генно-инженерных работ и быстрее накапливают целевой фермент в сравнении с грибными продуцентами.

Существенным преимуществом дрожжевых продуцентов является также то, что на их основе значительно легче создавать продуценты моноферментов, тогда как грибные продуценты обычно синтезируют комплексы целлюлитических ферментов. Промышленное получение моноферментов позволяет более эффективно решать задачи составления оптимальной композиции ферментов при использовании различных субстратов.

В настоящее время наиболее перспективным является создание продуцентов на основе рекомбинантных штаммов метилотрофных дрожжей рода Pichia, Komagataella или Hansenula [J Ind Microbiol Biotechnol 2009, 36: 1435-1438].

Использование метилотрофных дрожжей позволяет достичь высоких скоростей экспрессии гетерологичных белков с высокой плотностью клеток, а также высокого уровня и качества N-гликозилирования белков.

Особенно часто для высокоуровневой экспрессии геретологичных белков используют метилотрофные дрожжи Pichia pastoris [FEMS Microbiol.Rev., 2000, 24, 45-66].

Показано [J. Ind. Microbiol. Biotechnol., 2012 39(6), 869-876], что ген bgl16C1 из Penicillium pinophilum, кодирующий эндо-1,3(4)-β-D-глюканазу, эффективно экспрессируется в клетках дрожжей Pichia pastoris, при этом активность рекомбинантной β-глюканазы в культуральной жидкости при культивировании в 15-литровом ферментере составляет 28721 U/ml.

Известны также рекомбинантные штаммы Pichia pastoris, продуцирующие термостабильную β-1,3-1,4-глюканазу из Bacillus amyloliquefaciens. [CN101899458]

Поиск новых высокоактивных β-глюканаз, обладающих свойствами, необходимыми для их индустриального использования и способных эффективно выражаться в дрожжах, а также создание на их основе промышленно значимых продуцентов, является актуальной задачей.

В работе [Биотехнология, 2018, Т. 34, №5, С. 12-22] описан ген bgl из Bacillus pumilus, кодирующий β-глюканазу, относящуюся к классу эндо-β-1,3(4)-D-глюканаз (Е.С.3.2.1.6).

Komagataella kurtzmanii - новый вид метилотрофных дрожжей, выделенный из Pichia pastoris [Antonie van Leeuwenhoek, 2013, 104(3), Published online, DOI 10.1007/s10482-013-9956-7].

В работе [Тюрин О.В. Разработка системы экспрессии генов на основе метилотрофных дрожжей Komagataella kurtzmanii: диссертация, канд. биол. наук. ГосНИИгенетика, Москва, 2014.] описана система экспрессии для данных дрожжей и на модельных штаммах показана ее эффективность для продукции гетерологических белков.

Задачей заявляемого изобретения является расширение арсенала рекомбинантных микроорганизмов, продуцирующих β-глюканазу

Задача решена путем получения рекомбинантного штамма дрожжей Komagataella kurtzmanii Bg20 ВКПМ Y-4464, продуцирующего β-глюканазу, содержащего ген bgl, кодирующий эндо-β-1,3(4)-D-глюканазу из Bacillus pumilus.

Заявляемый рекомбинантный штамм дрожжей Komagataella kurtzmanii Bg20 получен путем интеграции в состав хромосомы штамма K. kurtzmanii 727Δ His4 ВКПМ Y-4462 экспрессионной кассеты, в состав которой входит ген bgl из Bacillus pumilus.

Штамм является продуцентом эндо-β-1,3(4)-D-глюканазы и депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов (ВКПМ) НИЦ «Курчатовский институт» - ГосНИИгенетика как Komagataella kurtzmanii Bg20 ВКПМ Y-4464.

Культурально-морфологические характеристики заявляемого штамма:

При культивировании при температуре 28°С в течение 48 часов на агаризованной среде YP ((мас. %): пептон - 2, дрожжевой экстракт - 1, агар - 2, вода - остальное), с добавлением глюкозы (2 мас. %) клетки имеют овальную форму, 3-4 мкм в диаметре. Клетки почкуются, при этом почкование истинное, многостороннее. Истинного мицелия не образуют.

Споруляция происходит при инкубации культуры на агаризованной среде следующего состава (мас. %): хлорид калия - 1.0, ацетат натрия - 0.5, глюкоза - 1.0, агар - 2.0, вода - остальное. Аски имеют тетраэдрическую форму, включают 4 аскоспоры.

На агаризованной среде YP с добавлением глюкозы (2 мас. %) колонии светло-бежевого цвета с ровным краем, матовой поверхностью, линзовидным профилем и пастообразной консистенцией.

При росте в жидкой среде YP (мас. %: пептон - 2, дрожжевой экстракт - 1, вода - остальное) с добавлением глюкозы (маc. 2%), при 28°С в течение 24 ч культивирования - жидкость мутная, осадок белый, коагуляции не наблюдается, пристеночных пленок не образует.

Физиолого-биохимические признаки:

Штамм способен к росту как в аэробных, так и в анаэробных условиях.

В качестве единственного источника углерода способен использовать метанол, этанол, глюкозу, глицерин, лактат, сукцинат, не способен ассимилировать мальтозу, сахарозу, ацетат, крахмал, лактозу.

Штамм не способен к росту при 35°С.

Штамм не способен к ассимиляции трегалозы.

При культивировании в присутствии метанола штамм способен синтезировать β-глюканазу.

Изобретение проиллюстрировано следующими фигурами:

Фиг. 1 Экспрессионная кассета 1

Фиг. 2 Электрофорез гена bgl Bacillus pumilus

Фиг. 3 Фингерпринт штамма Komagataella kurtzmanii Bg20 Y-4464

Изобретение подтверждается следующими примерами.

Пример 1. Получение штамма дрожжей Komagataella kurtzmanii, несущего ген bgl из Bacillus pumilus

В качестве источника гена bgl используют тотальную геномную ДНК штамма Bacillus pumilus Bg57 ВКПМ В-13195 [Биотехнология, 2018, Т. 34, №5, С. 12-22]. Синтезируют ДНК гена bgl методом ПЦР с использованием праймеров N1344m (5'-catccatggaaaagagatcccaaacgggcgggtcgttttat) и N1345m (5'-atactcgagttatctttttgtgtaacgcacccag).

На основе вектора pPH93-AOX1_Y727-HSA [Тюрин О.В. Разработка системы экспрессии генов на основе метилотрофных дрожжей Komagataella kurtzmanii: диссертация канд. биол. наук. ГосНИИгенетика, Москва, 2014.] получают интегративную плазмиду pPH727-(Bgl1)×3, содержащую три тандемно расположенные копии целевой экспрессионной кассеты AOX1_Y727-artHH-Bgl1-aox1T.

В состав экспрессионной кассеты 1 (фиг. 1) входят следующие генетические элементы:

1. Ген bgl Bacillus pumilus, встроенный в единую рамку считывания с нуклеотидной последовательностью сигнального пептида artHH, под контролем АОХ1_Y727 промотора

2. Терминатор транскрипции аох1Т_Y727

3. Дрожжевой селективный маркер His4_Y727

4. Область интеграции - нуклеотидная последовательность гена АОХ1_Y727

Плазмиду pPH727-(Bgl1ng)×3 расщепляют рестриктазой MluI. MluI/MluI фрагмент ДНК используют для трансформации клеток дрожжей.

Указанную интегративную экспрессионную кассету трансформируют в клетки Komagataella kurtzmanii 727Δ His4 ВКПМ Y-4462, полученного на основе штамма K. kurtzmanii ВКПМ Y-727 [Тюрин О.В. Разработка системы экспрессии генов на основе метилотрофных дрожжей Komagataella kurtzmanii: диссертация … канд. биол. наук. ГосНИИгенетика, Москва, 2014.] путем делеции гена His4.

Процедуру трансформации осуществляют методом электропорации, как описано в [Тюрин О.В. Разработка системы экспрессии генов на основе метилотрофных дрожжей Komagataella kurtzmanii: диссертация канд. биол. наук. ГосНИИгенетика, Москва, 2014.].

В результате получают набор трансформантов Y727-Bgl1, в геном каждого из которых оказывается интегрировано различное число копий целевой экспрессионной кассеты, включающей ген β-глюканазы Bacillus pumilus.

Трансформанты дрожжей K. kurtzmanii культивируют в колбах при температуре 29°С на ротационной качалке (250 об/мин). Культивирование проводят в жидкой среде YPgM следующего состава (мас. %): пептон - 2, дрожжевой экстракт - 1, глицерин - 0,5, метанол - 0,5, вода - остальное. Трансформанты засевают в начальном титре 5×10⁵-5×10⁶ мл^-1. Культуры выращивают в течение 69 часов, через 24 и 48 часов после начала культивирования в колбы вносят раствор 50% метанола в количестве 1/100 от объема среды. По истечении 69 часов роста клеточную биомассу отделяют от среды культивирования центрифугированием при 16000 g в течение 2 мин, используя пробирки на 1,5 мл, после чего осветленную культуральную жидкость переливают в чистые пробирки и хранят в холодильнике при температуре +4°С.

Отбор трансформантов, характеризующихся высокой концентрацией β-глюканазы Bacillus pumilus в культуральной жидкости осуществляют методом электрофоретического анализа.

Электрофоретический анализ белков проводят в 15% полиакриламидном геле в денатурирующих восстанавливающих условиях по стандартной процедуре, с использованием системы Mini-PROTEAN Tetra Cell (#165-8000). Буферы, подготовка образцов, нанесение и проведение электрофореза делают согласно инструкции "ВIO-RAD", прилагаемой к системе. В качестве маркеров используют смесь предокрашенных белков с известной молекулярной массой в диапазоне от 10 до 250 кДа ("Thermo Scientific™", PageRuler™ Plus Prestained Protein Ladder, #26620). Окрашивание геля раствором кумасси проводят при помощи набора фирмы "Thermo Scientific™" (Pierce™ Mini Gel Power Staining Kit, #22840) согласно прилагаемой инструкции.

В результате отбирают трансформант Bg20, характеризующийся максимально высокой концентрацией рекомбинантного фермента β-глюканазы Bacillus pumilus в культуральной жидкости.

После окончания ферментации определяют количество фермента β-глюканазы в культуральной жидкости с использованием ДНС метода [Anal. Chem., 1959, 31 (3), 426-428].

При культивировании в описанных условиях отобранный штамм обеспечивает продукцию β-глюканазы Bacillus pumilus в количестве 3500 ед в 1 мл культуральной жидкости.

Отобранный трансформант Bg20, депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов (ВКПМ) НИЦ «Курчатовский институт» - ГосНИИгенетика как Komagataella kurtzmanii Bg20 ВКПМ Y-4464.

Для подтверждения наличия в хромосоме полученного штамма вставки гена bgl Bacillus pumilus методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) используют хромосомальную ДНК, выделенную из клеток этого штамма и специфические праймеры BglPum-f и BglPum-r

Режим реакции ПЦР:

95°С - 3 мин - 1 цикл

30 циклов:

95°С - 30 сек.

60°С - 30 сек.

72°С - 60 сек.

72°С - 5 мин. - 1 цикл

Для контроля величины амплифицированного фрагмента ДНК при электрофорезе использован молекулярный маркер GeneRuler 1 kb DNA Ladder (Fermentas) (линия 2, фиг. 2, размер фрагментов снизу вверх 10000, 8000, 6000, 5000, 4000, 3500, 3000, 2500, 2000, 1500, 1000, 750, 500, 250 п.н.). Наработка фрагмента ДНК размером 642 п.н. (линия 1 фиг. 2) свидетельствует о присутствии в хромосоме штамма вставки гена bgl Bacillus pumilus

На фиг. 3 представлены результаты ПЦР-фингерпринта (Applied and Environmental Microbiology, Oct, 1999, 4351-4356) штамма Komagataella kurtzmanii Bg20 ВКПМ Y-4464

Фингерпринт проведен методом полимеразной цепной реакции (PCR) с использованием неспецифических праймеров М13 (линия 2 фиг. 3) и 1254 (линия 3 фиг. 3).

Праймер М13 gagggtggcggttct

режим реакции:

1 цикл

95°С - 3 мин.

39 циклов

95°С - 30 сек.

45°С - 30 сек.

72°С - 2 мин.

1 цикл

72°С - 5 мин

Праймер 1254 ccgcagccaa

режим реакции:

1 цикл

95°С - 3мин.

39 циклов

95°С - 30 сек.

48°С - 30 сек.

72°С - 1 мин.

1 цикл

72°С - 5 мин

Для контроля величины фрагментов ДНК при электрофорезе использован молекулярный маркер 1kb DNA GeneRuler (Fermentas) (линия 1, фиг. 3 размер фрагментов снизу вверх 10000, 8000, 6000, 5000, 4000, 3500, 3000, 2500, 2000, 1500, 1000, 750, 500, 250 п.н.).