Способ прогнозирования риска развития рака печени у экспериментальных животных

Изобретение относится к области медицины, а именно, к экспериментальной онкологии, фармакологии и может быть использовано в качестве способа прогнозирования риска развития рака печени индивидуально у каждого животного в эксперименте.

Онкологические заболевания, представляют серьезную медико-социальную проблему. Статистка рака неутешительна, так как во многих странах показатели заболеваемости и распространенности различных форм значительно увеличились за последние годы.

Ежегодно от рака погибает 300000 пациентов, поэтому онкологические заболевания занимают 2 место среди причин смерти населения. По статистке одной из причин такой ситуации является бессимптомное течение процесса и как следствие позднее обращение за медицинской помощью.

Известно, что рак печени занимает одно из лидирующих мест в структуре заболеваемости и смертности среди онкологических заболеваний желудочно-кишечного тракта. Зачастую это бывает связано с бессимптомным течением и как следствие поздней обращаемостью, а так же не возможностью проведения оперативного вмешательства из-за распространенности процесса.

В связи с этим поиск способов прогнозирования риска развития рака, в частности рака печени, является актуальным, так как может способствовать ранней выявляемости, снижению заболеваемости и ранней смертности от онкологии.

Известен способ прогнозирования риска возникновения рака яичников, заключающийся в том, что пациенту проводят анализ экспрессии гена TUSC3 в биологическом образце (предпочтительно образец ткани) с последующим сравнением экспрессии данного маркера в образцах от здоровых доноров. При низком уровне экспрессии гена TUSC3 у обследуемого индивида прогнозируют риск развития заболевания по определенной формуле (Patent Application Publication №US 2009/0298068 A1, 2009). Недостатками этого метода являются его трудоемкость и необходимость наличия дорогостоящих реактивов. Невозможность использования метода в среднестатистических клинических лабораториях без использования специальной аппаратуры, а также не достаточная точность метода. Данный метод является низкоспецифичным методом, так как рассчитан на прогнозирование риска развития исключительно рака яичников и не способен выявить риск развития рака других локализация.

Известен способ прогнозирования риска развития РЯ, заключающийся в выявлении генетических вариантов в гене BRCA2 для определения предрасположенности к ВКСА2-ассоциированным злокачественным новообразованиям, в частности к РМЖ и РЯ. Кроме того, описываемый способ позволяет прогнозировать течение заболеваний и определять ответ и эффективность лечения у пациентов (United States Patent №US 8476020 B1, 2013). Данный способ так же является низко специфичным и дорогим в применении.

В целом, главным недостатком известных способов прогнозирования риска развития РЯ являются: низкая специфичность метода, отсутствие индивидуального прогноза риска развития рака, невозможность использовать метод вне специализированной лаборатории.

Наиболее близким к предполагаемому изобретению является способ прогнозирования риска развития рака яичников [патент №2599502 Способ прогнозирования риска развития рака яичников 2016 г Прокофьева Дарья Симоновна, Хуснутдинова Эльза Камилевна, Бермишева Марина Алексеевна, Нургалиева Альфия Хаматьяновна], который осуществляют путем выделения ДНК из лимфоцитов периферической венозной крови, при этом выделение ДНК проводят с помощью наборов реагентов для выделения геномной ДНК из цельной крови, согласно протоколу производителя. Полученную ДНК используют в качестве матрицы при проведении дальнейшего молекулярно-генетического анализа.

Детекцию мутации c.5266dupC в гене BRCA1 проводят с помощью HRM анализа. Специфические последовательности олигонуклеотидных праймеров представлены в работе Bogdanova N. (Bogdanova N. Genetic determinants of breast cancer susceptibility in the Byelorussian population. Dissertation dr. rer. nat. - 2008. - Vol. 193. - P. 1-193). Используются следующие последовательности олигонуклеотидов: (F) 5'-gggaatccaaattacacagc-3', (R) 5'-ccaaagcgagcaagagaatctc-3'. Состав реакционной смеси для ПЦР общим объемом 17 μl включает в себя: 2 μl геномной ДНК (70 нг), 1.88 μl dNTPs, 4 μl MgCl₂, 3,4 μl Q-solution, 1 μl смеси праймеров, 2.12 μl однократного буфера для Top-Tag полимеразы, 0.1 μl Top-Tag полимеразы, 0,8 μl EvaGreen и 1.7 μl воды высокой степени очистки. Режим амплификации: предварительная денатурация 7 минут при 95°С, затем 40 циклов со следующими параметрами - 95°С - 15 секунд, 60°С - 45 секунд, 72°С - 45 секунд. Плавление ПЦР-продукта проводят в диапазоне температур 55-95°С. Используют канал SYBR Green I, данные о кривых плавления анализируют в температурных пределах от 65°С до 95°С со скоростью линейного изменения 0,5°С в секунду.

Обнаружение одной из указанных мутаций свидетельствует о повышенном риске развития рака яичников.

Недостатком прототипа является, сложность и дороговизна метода, невозможность использования метода в среднестатистических клинических лабораториях без использования специальной аппаратуры, а также не достаточная точность метода. Данный метод является низкоспецифичным методом, так как рассчитан на прогнозирование риска развития исключительно рака яичников.

Целью изобретения является разработка способа прогнозирования риска развития рака печени в условиях экспериментального канцерогенеза.

Поставленная цель достигается тем, что у исследуемых животных формируется модель экспериментального канцерогенеза печени и пищевода путем введения с питьевой водой N-нитрозодиэтиламина в дозе 100 мг/л воды, в течение 4 месяцев и параллельно вводят ресвератрол предварительно равномерно смешав его с пищей в дозе 100 мг/кг веса животного на протяжении 6 месяцев. Через три месяца от начала эксперимента осуществляли забор крови с последующим изучением биохимических показателей крови исследуемых животных, таких как: аланинаминотрансфераза (АлАТ), аспартатаминотрансфераза (АсАТ) (Ед/л); Осмотическая резистентность мембран эритроцитов (% гемолиза); малоновый диальдигид (МДА) (Ммоль/л); супеоксиддисмутазы (СОД) (%) [Камышников, B.C. Клинико-биохимическая лабораторная диагностика. В 2-х томах: справочник / В.С. Камышников. - Минск: Интерпрессервис, 2003 - Т. 1-495 с. Т. 2-463 с.]

Полученные данные экспериментальных животных, заносят в статистическую программу SPSS. С помощью корреляционно-регрессионного анализа выявляют статистически значимую связь рака печени с АлАТ (r=0,72; р<0,05), АсАТ (r=0,76; р<0,05), Осмотическая резистентность мембран эритроцитов (r=0,74; р<0,05), МДА (r=0,8; р<0,05), СОД (r=0,78; р<0,05). Учитывая наличие связи между вышеперечисленными показателями (признаками), в ходе множественного регрессионного анализа получают уравнение регрессии (формулу) для прогностических моделей, с помощью которого прогнозируют развитие рака печени у экспериментальных животных:

РП=-118,772+(20,7086хА)+(2,59479хВ)+(2,63444хС)+(0,943407xD)-(1,00467хЕ),

где

РП- рак печени (в %),

А- АсАТ (Ед/л),

В- АлАТ (Ед/л),

С - Осмотическая резистентности мембран эритроцитов (в % гемолиза)

D - МДА (Ммоль/л)

Е - СОД (в %)

Согласно общепринятым шкалам (Александрович Ю.С., Гордеев В.И. Оценочные и прогностические шкалы в медицине критических состояний. - Изд-во «Сотис». - 2007. - 140 с. ) риск развития патологического процесса подразделяется на низкий, умеренный и высокий. При получения значения в пределах 0-30% риск развития рака печени низкий, в пределах 30-60%-умеренный, в пределах 60-100%- высокий.

В полученную формулу подставляют данные испытуемого животного и по полученному результату судят о вероятности развития рака печени у конкретного животного.

Статистические методы исследования.

Статистическая обработка данных представленного нами исследования проведена с применением пакета прикладных программ STATGRAPHICS Plus 5,0 for Windows и SPSS 15,0 for Windows. Применялись стандартные статистические методы [Гублер Е.В. Вычислительные методы анализа и распознавания патологических процессов.- Л.: Медицина. - 1978. - 294 с. ], включающие вычисление среднеарифметических, стандартных отклонений, стандартных ошибок среднего, множественный регрессионный анализ. Достоверность различий в группах оценивалась с помощью параметрических методов (t- критерий Стьюдента). Различия при уровне значимости р<0,05 расценивались как достоверные.

По имеющимся у авторов сведениям совокупность существенных признаков, характеризующих сущность заявляемого изобретения, не известна, что позволяет сделать вывод о соответствии изобретения критерию «новизна».

По мнению авторов, сущность заявляемого изобретения не следует для специалистов явным образом из известного уровня медицины, так как из него не выявляется вышеуказанная возможность способа индивидуального прогнозирования риска развития рака печени у животных в условиях экспериментального канцерогенеза, что позволяет сделать вывод о соответствии критерию «изобретательский уровень».

Совокупность существенных признаков, характеризующих сущность изобретения, в принципе может быть многократно использовано в медицине с получением результата, заключающегося в эффективном и легко воспроизводимом способе прогнозирования индивидуального риска развития рака печени у животных путем внесения биохимических показателей крови в формулу, что позволяет сделать вывод о соответствии изобретения критерию «промышленная применимость».

Примеры конкретного выполнения.

Эксперимент проведен на 90 крысах самцах линии Вистар, с исходной массой 180-200 г. Содержание животных осуществляли в соответствии с приказом Минздравсоцразвития России №708н от 23 августа 2010 года «Об утверждении Правил лабораторной практики». Животные находились при 12-часовом световом режиме в условиях свободного доступа к воде и пище. Все животные были разделены на две группы, по 30 в каждой: I группа животные интактного контроля; II группа (животные получавшие только N-нитрозодиэтиламин в дозе 100 мг/л ежедневно, в течение 4 месяцев) и III группа - (животные получавшие одновременно, N-нитрозодиэтиламин и ресвератрол в дозе 100 мг/кг веса животного на протяжении 6 месяцев, предварительно равномерно смешав с творогом). Биохимические показатели крови изучали на третьем месяце эксперимента, т.к. именно в этот период происходит формирование опухолевого процесса в печени в эксперименте, что показано в ранее проведенном исследовании [Кокоев Л.А., Болиева Л.З, Закс Т.В. "Влияние полисахаридов аира болотного на канцерогенез печени и пищевода в эксперименте" Владикавказский медико-биологический вестник 20 29(2014):.]

У исследуемых животных, брали кровь, предварительно усыпив внутрибрюшинным введением 0,1-0,2 мл золетила (Zoletil, Франция).

Осмотическую резистентность эритроцитов определяли спектрофотометрически, путем внесения отмытых эритроцитов в образцы с разным объемным содержанием изотонического и гипертонического растворов хлористого натрия и мочевины.

Изучение осмотической резистентности мембран эритроцитов показало, что количество разрушенных эритроцитов в растворе №1 (40% раствор мочевины) у крыс I (контрольной) группы составило 1,7±0,168%, во II группе животных (получавших только N-нитрозодиэтиламин) - 10,2±0,108% и в III группе животных (получавших одновременно N-нитрозодиэтиламин и ресвератрол), процент гемолиза составил 1,26±0,066% (р<0,001). В растворе №2 (45% мочевины) этот показатель составил 14,18±0,127, 34,84±2,414 и 7,59±2,797 (р<0,002) соответственно. Процент гемолизированных эритроцитов в растворе №4, составил: 53,86±2,3 (р<0,05); 68,42±2,1; 49,83±2,5 (р<0,05) (гемолиз в котором является более показательным, так, как концентрация мочевины в этом растворе составляет 55% и только эритроциты с нормальной стойкостью мембран способны оказывать противодействие, а с ослабленной резистентностью начинают в большей степени разрушаться [«Осмотическая резистентность мембран эритроцитов у крыс с гипер- и гипокальциемией» Козаев А.В., Джиоев И.Г. и соавт.]), (Таб. 1). Показатели оптической плотности в растворе №7 нами принимался за 100%.

Изучение АлАТ и АсАТ проводили по общеизвестной методике. Как видно из полученных результатов активность АлАТ в сыворотке крови животных получавших наряду с канцерогеном ресвератрол была достоверно ниже активности АлАТ в сыворотке крови животных изолированно получавших канцероген в 2 раза (р<0,05) и достоверно не менялась в сравнениями показателей группы интактного контроля. Активность АсАТ, что составило соответственно по группам, в I-0,59±0,031; во II- 0,798±0,0489 и в III- 0,602±0,033 (р<0,05) и была ниже в группе животных получавших ресвератрол. Полученные результаты приведены в таблице 1.

Изучение МДА проводили по общеизвестной методике. Принцип метода основан на образовании окрашенного комплекса при взаимодействии малонового диальдигида с тиобарбитуровой кислотой [Камышников, B.C. Клинико-биохимическая лабораторная диагностика. В 2-х томах: справочник / В.С. Камышников. - Минск: Интерпрессервис, 2003 - Т. 1 - 495 с. Т. 2 - 463 с.]. Полученные результаты показали достоверное снижение уровня продукта пероксидации липидов в эритроцитах группы животных получавших наряду с канцерогеном ресвератрол на 17,34 (р<0,05) в группе животных получавших ресвератрол, по сравнению с уровнем МДА в эритроцитах животных получавших изолировано канцероген и практически не отличался от группы интактного контроля.(Таб. 1).

Изучение СОД проводили по общеизвестной методике [Камышников B.C. Справочник по клинико-биохимическим исследованиям и лабораторной диагностике / В.С. Камышников. - 3 е изд. - М.: МЕД пресс информ, 2009 - 896 с.]. По нашим данным, активность СОД в III группе была достоверно выше чем во II (р<0,05) и не отличалась от животных I группы. Полученные результаты приведены в таблице 1.

Примечание: Различия достоверны: относительно I группы # - р≤0,05; относительно III группы * - р≤0,05

При этом, в группе животных получавших изолировано канцероген, процент развития новообразований печени, составил 73,4% от общего числа животных данной группы введенных в эксперимент (n=30). В группе животных получавших наряду с канцерогеном ресвератрол частоты возникновения новообразований печени составила 53,3% (р<0,05), что было достоверно ниже относительно II группы. Таким образом, выявленные различия указывают на высокую эффективность ресвератрола в качестве химиопрофилактического средства.

Пример 1.

Животное из группы крыс получавших наряду с канцерогеном, ресвератрол 10 мг/кг массы тела с пищей имело следующие биохимические показатели крови:

АсАТ- 0,57 (Ед/л)-

АлАТ-1,51 (Ед/л)-

Осмотическая резистентности мембран эритроцитов-48,82 (в % гемолиза)

МДА-58,97 (Ммоль/л)

СОД-77,8 (в %)

Прогноз развития рака печени, по полученной формуле составил 3,03%.

Животное дожило до конца эксперимента и после вскрытия опухолевого процесса в печени обнаружено не было, то есть фактические данные соответствовали прогнозу по заявляемому способу.

Пример 2.

Животное из группы крыс получавших изолированно канцероген, имело следующие биохимические показатели крови:

АсАТ- 0,9 (Ед/л)-

АлАТ -2,9 (Ед/л)-

Осмотическая резистентности мембран эритроцитов-65,2 (в % гемолиза)

МДА-69,6 (Ммоль/л)

СОД-50,4 (в %)

Прогноз развития рака печени, по полученной формуле составил 94,18%.

Животное не дожило до конца эксперимента и пало на 5-м месяце эксперимента. При вскрытии был обнаружен опухолевый процесс в печени дифференцированный морфологически как гепатоцеллюлярная карцинома, то есть фактические данные соответствовали прогнозу по заявляемому способу.

Таким образом, проведение расчетов по представленной выше формуле, которое можно производить с помощью калькулятора или программы Microsoft Excel, позволяет с достаточно высокой точностью предсказать прогноз возникновения рака печени за долго до развития заболевания, что может быть использовано, как в эксперименте так и клинической практике и может способствовать предупреждению развития заболевания.

Заявляемый способ по сравнению с известными, имеет преимущества заключающиеся в том, что позволяет использовать данный способ для раннего выявления рака печени, обладает высокой точностью, позволяет рассчитать индивидуальный прогноз развития заболевания, с минимальными материальными затратами, доступен для широкого использования