Способ профилактики хронической токсической коагулопатии у экспериментальных животных

Изобретение относится к экспериментальной медицине, экологии и токсикологии и может быть использовано для экспериментальной разработки методов профилактики и патогенетической коррекции нарушений функционального состояния системы гемостаза при хроническом токсическом воздействии тяжелых металлов, в частности никеля.

В качестве средства профилактики коагулопатии при хронической никелевой интоксикации мы использовали синтетический аналог гормона эпифиза мелатонина - Мелаксен. В многочисленных исследованиях показано, что мелатонин участвует практически во всех процессах жизнедеятельности, контролируя сон, деятельность сердечно-сосудистой, эндокринной и иммунной систем. Показано выраженное адаптогенное действие, противовоспалительное, десенсибилизирующее, антиоксидантное, антигипертензивное,

гепатопротекторное действие, антистрессорные эффекты и др. (Попович И.Г. 2008). Выраженные мембранопротекторные свойства мелаксена обусловлены его мощным антиоксидантным действием (Лилица Г.А., Заславская P.M., Калинина Е.В. 2005; Арушанян Э.Б. 2012). Мелаксен применяется в терапии патогенетически отличающихся патологических состояний, в том числе и протекающих с нарушениями системы гемостаза (М.И.Смирнов, 1974; Лазарева Е.Н., Галимзянов Х.М., Самотруева М.А. 2013; A. Hoffer, 2010).

Лазарева Е.Н. и соавт. показали эффективность мелатонина в качестве средства коррекции функциональной активности тромбоцитов в условиях экспериментальной гипо- и гиперагрегации (Лазарева Е.Н., Галимзянов Х.М., Самотруева М.А. 2013). Гипоагрегационную модель нарушений функции тромбоцитов индуцировали введением ацетилсалициловой кислоты (per os в дозе 20 мг/кг). Гиперагрегация была вызвана внутрибрюшинным введением 0,1 мл 10% раствора кальция хлорида. Данных о возможности применения мелатонина с целью профилактики нарушений системы гемостаза при никелевой интоксикации мы в доступной литературе не обнаружили.

Известен способ профилактики проявлений кадмиевой коагулопатии у крыс с применением одного из компонентов прополиса, обладающего антиоксидантными и противовоспалительными свойствами (Ashour Т.Н. Preventative Effects of Caffeic Acid Phenyl Ester on Cadmium Intoxication Induced Hematological and Blood Coagulation Disturbances and Hepatorenal Damage in Rats //ISRN Hematology, Volume 2014, Article ID 764754, 7 pages. http://dx.doi.org/10.1155/2014/764754). Недостатком данного способа является то, что с его помощью, невозможно изучение профилактики никелевой коагулопатии, так как в данной работе не рассматривалось влияние никеля на свертывающую систему крови.

Известен также способ профилактики нарушений гемостаза с использованием препаратов простациклинового ряда при субхронической свинцовой интоксикации у животных (Подолян С.К. Вплив хлористого свинцю на систему регуляцii агрегатного стану кровi у бiлих щypiв // Буковинський медичний вiсник. - 1998. - №3-4. - С. 131-136). Использование стабильного негалогенизированного аналога простациклина (ММ-706), способствовало снижению индекса спонтанной агрегации тромбоцитов и уменьшению процента адгезированных тромбоцитов, за счет стабилизации их мембран.

Недостатком данного способа является то, что с его помощью невозможно изучение профилактики никелевой коагулопатии, так как в способе не рассматривается влияние никеля на свертывающую систему крови. Известно, что все тяжелые металлы имеют преимущественные системы- и органы - «мишени» повреждающего воздействия. Воздействие свинца на организм в течение короткого времени также не позволяет получить модель хронической коагулопатии. Эксперимент проводимый в течение двух месяцев является более приближенным к натуральным условиям, моделирует поступление токсиканта в организм с пищей и водой из окружающей среды в условиях антропогенного загрязнения, более информативен и позволяет подробно в разные сроки в динамике изучить формирование нарушений звеньев системы гемостаза в условиях токсического воздействия, что особенно важно в коагулологии.

Наиболее близким к предполагаемому изобретению является способ коррекции нарушений гемостаза при гипероксидации с помощью витаминов-антиоксидантов (Бышевский А.Ш., Галян СЛ., Ральченко И.В., Рудзевич А.Ю., Алборов Р.Г., Винокурова Е.А., Волков А.И., Умутбаева М.К. Влияние комбинации витаминов-антиоксидантов на гемостаз при экспериментальной гипероксидации //Экспериментальная и клиническая фармакология. -2005. -Том 68, №3 - С. 34- 36) заключающийся в том, что животным вводили с рационом препарат компливит из расчета по витамину А - в дозе 1,8 мг/кг в сутки -одновременно с ежедневным введением ацетата свинца в дозе 0,5 мг/кг в течение 15 дней с пищей. Избыток витамина А на фоне токсического влияния свинца ослабляет сдвиги показателей системы гемостаза вызванные металлом, сдерживает активацию тромбоцитов и вызывает снижение уровня маркеров внутрисосудистого свертывания крови (продуктов деградации фибрина, растворимые комплексы фибринмономеров, D-димеры, факторы Р3 и Р4).

Недостатками прототипа являются:

сложность определения количества антиоксиданта витамина А, поступающего с пищей в организм на единицу массы тела животного;

- сложность определения количества поступающего в организм с пищей металла на единицу массы тела животного;

- используемый в качестве профилактического средства витамин А в избыточных количествах может оказывать побочные влияния;

- профилактическое введение антиоксиданта - витамина А в течение короткого времени не позволяет получить способ профилактики хронической коагулопатии. Хронический эксперимент, который проводят в течение двух месяцев является более информативным, и позволяет подробно в разные сроки в динамике изучить механизмы профилактического действия антиоксиданта на формирование нарушений звеньев системы гемостаза в условиях токсического воздействия, что особенно важно в коагулологии;

- недостатком данного способа является то, что с его помощью невозможна разработка способа профилактики никелевой коагулопатии, так как в прототипе не рассматривалось профилактическое влияние антиоксиданта на свертывающую систему крови при токсическом воздействии никеля на организм экспериментальных животных. Известно, что разные металлы имеют преимущественные системы- и органы- «мишени» повреждающего воздействия. Соответственно эффективность данного способа при свинцовой интоксикации не доказывает возможность профилактического использования мелатонина при никелевой интоксикации.

Заявляемое изобретение направлено на решение задачи, заключающейся в разработке способа профилактики хронической токсической коагулопатии у экспериментальных животных.

Решение этой задачи обеспечивает значительное уменьшение сдвигов показателей свертывающей системы крови при хроническом отравлении у экспериментальных животных, что сопровождалось уменьшением интенсивности липопероксидации.

Для достижения этого технического результата заявляемый способ профилактики хронической токсической коагулопатии у экспериментальных животных при хроническом отравлении, включающий ежедневное введение антиоксиданта и тяжелого металла (прокоагулянта), отличается тем, что животным вводят мелаксен один раз в сутки в дозе 5 мг/кг через зонд в желудок в течение двух месяцев одновременно с ежедневным внутрижелудочным введением раствора хлорида никеля в дозе 5 мг/кг, в пересчете на металл.

Ежедневное профилактическое введение мелаксена через зонд в желудок в дозе 5 мг/кг одновременно с внутрижелудочным введением раствора хлорида никеля приводит к уменьшению патологических сдвигов показателей клеточного и плазменного гемостаза за счет уменьшения цитотоксичности никеля, мембранопротекторного и антиоксидантного действия мелатонина.. Заявленный способ является эффективным, экономически выгодным и легко воспроизводимым.

По имеющимся у авторов сведениям совокупность существенных признаков, характеризующих сущность заявляемого изобретения, не известна, что позволяет сделать вывод о соответствии изобретения критерию «новизна».

По мнению авторов, сущность заявляемого изобретения не следует для специалистов явным образом из известного уровня медицины, так как из него не выявляется вышеуказанная возможность получения способа профилактики хронической токсической коагулопатии, отличающегося тем, что животным вводят мелаксен один раз в сутки в дозе 5 мг/кг через зонд в желудок в течение двух месяцев одновременно с ежедневным внутрижелудочным введением раствора хлорида никеля в дозе 5 мг/кг, в пересчете на металл, что позволяет сделать вывод о соответствии критерию «изобретательский уровень».

Совокупность существенных признаков, характеризующих сущность изобретения, в принципе может быть многократно использована в медицине с получением результата, заключающегося в эффективном и легко воспроизводимом способе профилактики хронической токсической коагулопатии, путем уменьшения интенсивности процессов перекисного окисления липидов, восстановления ферментов антиоксидантной защиты, подавления активации свертывающей и восстановления противосвертывающей и фибринолитической систем, уменьшения уровня тромбинемии при хроническом отравлении, что позволяет сделать вывод о соответствии изобретения критерию «промышленная применимость».

Данный способ осуществляется следующим образом.

Для получения токсического вещества хлорид никеля растворяют в дистиллированной воде таким образом, что на единицу раствора, равную 1 мл, приходится 2,5 мг никеля, в пересчете на металл. На каждые 100 г массы крысы вводят 0,2 мл токсического раствора, что не является чрезмерной водной нагрузкой на организм экспериментального животного.

Раствор мелаксена приготавливают таким образом, что на каждую единицу раствора, равную 1 мл, приходится 5 мг мелаксена. Раствор мелаксена готовят ежедневно перед внутрижелудочным введением.

Ранее в нашей лаборатории было показано, что применение Мелаксена в дозе 10 мг/кг массы эффективно профилактирует морфо-функциональные изменения у крыс при хронической токсической кардиопатии, нефро- и гепатопатии вызванных поступлением в организм тяжелых металлов - цинка, кадмия и свинца в эксперименте (Брин В.Б., Митциев А.К. 2016). Однако по данным (Лазарева Е.Н. и соавт. 2013), изолированное введение мелаксена интактным животным в дозе 10 мг/кг может оказывать влияние на сосудисто-тромбоцитарный гемостаз, подавляя активность тромбоцитов. Вместе с тем показана корригирующая способность мелаксена в дозе 1 мг/кг: на фоне «аспириновой» гипоагрегации - уменьшается дезагрегационный эффект ацетилсалициловой кислоты, а в условиях «кальциевой» гиперагрегации напротив снижается агрегационная активность тромбоцитов (Лазарева Е.Н. и соавт. 2013). В предлагаемом способе используется доза мелатонина - 5 мг/кг с целью профилактики никелевой коагулопатии при хронической интоксикации.

Двум группам животных вводят раствор хлорида никеля в дозе 5 мг/кг через атравматичный зонд в желудок ежедневно 1 раз в сутки в течение 60 дней. Одновременно с первого дня введения хлорида никеля одной группе каждый день внутрижелудочно вводят мелаксен в дозе 5 мг/кг через атравматичный зонд.

Состояние системы гемостаза и процессов перекисного окисления липидов оценивают через два месяца. В крови определяются показатели, характеризующие: сосудисто-тромбоцитарное звено гемостаза (количество тромбоцитов и их агрегационную активность); коагуляционное звено гемостаза: активированное частичное тромбопластиновое время (АЧТВ), протромбиновое время (ПВ), лебетоксовое время (ЛЕТ), тромбиновое время (ТВ), содержание фибриногена. По активности антитромбина III (AT III) судят о состоянии противосвертывающей системы, по времени XIIa- калликреин зависимого фибринолиза (XIIa-ЗЛ) исследуют состояние фибринолитической системы, по концентрации растворимых фибрин-мономерных комплексов (РФМК) судят об уровне тромбинемии.

Об интенсивности процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ) судят по концентрации малонового диальдегида (МДА) в эритроцитах и уровню гидроперекисей в плазме крови. Определение активности каталазы в эритроцитах производят с целью оценки эффективности антиоксидантной защиты (АОЗ).

Опыты демонстрируют эффективность применения Мелаксена с целью профилактики хронической токсической коагулопатии. Мелатонин способствует уменьшению выраженности изменений клеточного и плазменного гемостаза, снижает уровень тромбинемии благодаря выраженной антиоксидантной активности в условиях хронической никелевой интоксикации.

Пример конкретного выполнения.

Двум группам крыс-самцов линии Вистар (по 10 крыс в каждой) массой 200-300 г вводили через атравматичный зонд в желудок раствор хлорида никеля в дозе 5 мг/кг каждый день в течение 60 дней. Одновременно, с первого дня введения хлорида никеля, группе №2 каждый день внутрижелудочно вводился мелаксен в дозе 5 мг/кг. Контролем служили интактные животные (10 крыс) содержащиеся в стандартных условиях вивария, и животные с внутрижелудочным введением только мелаксена (10 крыс).

Через 60 дней исследовали показатели свертывающей, противосвертывающей и фибринолитической систем и активность процессов перекисного окисления липидов.

Для оценки функционального состояния свертывающей системы крови, определяли: агрегацию тромбоцитов (Born G.V., 1962) (агрегометр «Solar», индуктор - ADP, конечная концентрация 10,0 мкг/мл); активированное частичное тромбопластиновое время (АЧТВ); протромбиновое время (ПВ); лебетоксовое время (ЛЕТ) (Баркаган З.С., Цывкина Л.П. 1988); тромбиновое время (ТВ); содержание фибриногена по методу Клаусса; концентрацию растворимых фибрин-мономерных комплексов (РФМК) определяли количественным вариантом фенантролинового теста; активность антитромбина III (AT III); XIIa-калликреин зависимый фибринолиз (XIIa-ЗЛ). Исследование гемокоагуляционных свойств крови проводилось по стандартным методикам (Петрищев Н. Н. Папаян Л.П. 1999; Момот А.П., Цывкина Л.П., Тараненко И.А., 2011) с применением диагностических наборов фирмы «Технология стандарт», (Россия).

Для оценки липопероксидации и антиоксидантного потенциала определяли содержание: малонового диальдегида (МДА) (Данилова Л.А., 2003), гидроперекисей (ГП) (диеновые конъюгаты и диеновые кетоны) в плазме крови (Камышников B.C., 2003), активность каталазы по методу E.Beutler (Данилова Л.А., 2003). Тесты выполнялись на спектрофотометре «Solar-300», турбидиметрическом коагулометре «CGL-2110» и агрегометре «АР-2110» Solar (Беларусь).

Статистическая обработка результатов проводилась с использованием статистических программ Statistica 10.0 (StatSoft, Inc.), Microsoft Excel 2003. Данные представлены в виде медианы (Me), [25-75] процентили выборки. Использовали непараметрический U-критерий Манна-Уитни для оценки статистической значимости различий (Стентон Гланц., 1999). Рассчитывали коэффициент ранговой корреляции (r_s) Спирмена для анализа силы взаимосвязей между исследуемыми параметрами. Для всех тестов статистически достоверными считались различия при р<0,05.

Проведенные исследования показали, что внутрижелудочное введение хлорида никеля в дозе 5 мг/кг массы тела каждый день в течение двух месяцев способствовало развитию токсической коагулопатии (Таблица 1.).

Выявлялось подавление активности клеточного звена гемостаза тромбоцитопения. Наблюдалась тенденция к уменьшению концентрации фибриногена в плазме крови. На фоне укорочения АЧТВ и тромбинового времени происходило удлинение протромбинового времени, лебетоксовое время статистически не отличалось от интактного контроля. Изолированное удлинение ПВ при нормальном ЛЕТ может свидетельствовать о снижении активности VII фактора свертывающей системы (Баркаган З.С., Цывкина Л.П., 1988) вероятно вследствие нарушения синтетической функции печени при металлотоксикозе. Это подтверждает ранее полученные данные, где в разных дозах и в разные сроки выявлялись дистрофические и некробиотические изменения в тканях почек, печени и сердца при хронической никелевой интоксикации (Такоева Е.И. и др., 2012; Брин В.Б., Закс Т.В., 2015).

Вместе с тем регистрировалось угнетение противосвертывающего звена гемостаза (снижалась активность антитромбина (III)), истощение резервных возможностей фибринолитической системы (замедление фXIIa-зависимого эуглобулинового лизиса) и достоверное увеличение содержания растворимых фибрин мономерных комплексов, что свидетельствует о наличии тромбинемии.

Параметры системы гемостаза при хронической интоксикации коррелировали с изменениями активности процессов перекисного окисления липидов и антиоксидантных ферментов под влиянием никеля у животных.

Снижение активности каталазы у крыс, внутрижелудочно получавших хлорид никеля, сочеталось с увеличением концентрации малонового диальдегида, выявлялось истощение уровня гидроперекисей в плазме крови относительно фоновых значений, что свидетельствует об активации процессов липопероксидации (Таблица 2.).

Выявлена значимая положительная корреляция энзиматической активности каталазы с антитромбином III (r_s=0,73;P<0,05), а также высокая степень обратной корреляции с показателями XIIa-ЗЛ (r_s=-0,69;P<0,05). Изменения показателей РФМК и сдвиги МДА были ассоциированы тесно положительно (r_s=0,77;Р<0,02). Это может свидетельствовать о роли свободнорадикального окисления в механизмах активации внутрисосудистого свертывания крови, угнетении противосвертывающего и фибринолитического звеньев гемостаза и развития тромбинемии при никелевой интоксикации.

Анализ параметров гемостаза у контрольной группы животных, получавших в течение двух месяцев только мелаксен в дозе 5 мг/кг массы тела свидетельствует об отсутствии влияния препарата на свертывающую систему крови. Выявлялась незначительная тенденция к уменьшению количества тромбоцитов относительно интактного контроля, но степень АДФ агрегации не изменялась (Таблица 1).

Результаты исследования показали, что, у опытных животных с профилактическим введением Мелаксена на фоне хронической интоксикации хлоридом никеля изменения показателей клеточного и плазменного гемостаза были менее выражены. Мелатонин способствовал уменьшению степени тромбоцитопении (Таблица 1). Количество тромбоцитов было ниже относительно интактных животных, но больше, чем у опытной группы животных. ПВ укорачивалось относительно группы с изолированным введением хлорида никеля (р<0,05), но относительно контроля статистически значимых различий не было. Выявлялись менее выраженные изменения АЧТВ и ТВ.

Введение мелаксена в условиях хронической интоксикации хлоридом никеля способствовало уменьшению выраженности изменений противосвертывающей и фибринолитической систем. Это выражалось в увеличении активности АТ(III) и укорочении времени XIIa-зависимого фибринолиза по сравнению с крысами получавшими только хлорид никеля (р<0,05 и р<0,01). Уменьшался уровень тромбинемии (Таблица 1). Концентрация растворимых фибринмономерных комплексов была выше интактного контроля (р<0,05), но ее уровень был достоверно ниже, чем у опытных крыс с введением только NiCl2.

Профилактическое применение мелаксена способствовало повышению уровня активности каталазы в эритроцитах с одновременным снижением концентрации малонового диальдегида и восстановлением уровня гидроперекисей в плазме крови, что свидетельствует о выраженном антиоксидантном действии мелаксена в условиях хронической никелевой интоксикации (Таблица 2).

Из вышеизложенного следует, что профилактическое применение мелаксена в условиях хронической никелевой интоксикации является эффективным способом профилактики хронической токсической коагулопатии. Полученные данные могут стать экспериментальным основанием для разработки алгоритмов комплексного лечения и профилактики нарушений механизмов регуляции свертывающей системы с использованием мелаксена в регионах с техногенным загрязнением окружающей среды тяжелыми металами, проведения у населения ежегодного обследования состояния системы гемостаза.