СПОСОБ ОТБОРА ЛОШАДЕЙ С НИЗКИМ УРОВНЕМ ОБМЕНА ТОКСИЧНЫХ ЭЛЕМЕНТОВ ПО ЖЕЛАТЕЛЬНОМУ ГЕНОТИПУ

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Изобретение относится к сельскому хозяйству, в частности к способам отбора лошадей, и может быть использовано для селекционного процесса в коневодстве. В качестве критерия для отбора лошадей с низким содержанием токсичных микроэлементов для селекционного процесса, выступает изучение полиморфизма микросателлитной ДНК по локусу HMS7, отбор животных производят по желательным аллелям: OQ, LO, JM, NO, NQ.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Патентный поиск показывает отсутствие каких-либо литературных данных по способу отбора лошадей с низким уровнем обмена токсичных элементов по желательному генотипу для селекционного процесса.

Цель изобретения - создание способа отбора лошадей с низким уровнем обмена токсичных элементов по желательному генотипу для селекционного процесса по результатам определения полиморфизма микросателлитов ДНК по 17-ти локусам, рекомендованные Международным обществом по изучению генетики животных: VHL20, HTG4, АНТ4, HMS7, HTG6, АНТ5, HMS6, ASB23, ASB2, HTG10, HTG7, HMS3, HMS2, ASB17, LEX3, HMS1, СА425 и сопоставлением с суммой токсичных микроэлементов (Sr, Al, Cd, Pb, Sn, Hg) в ммоль/кг.

Способ позволяет решить следующие технические задачи: выявлять животных носителей желательных аллелей: OQ, LO, JM, NO, NQ по локусу HMS7, концентрация токсичных микроэлементов в волосе с гривы средние значения которых не превышают 3,09 ммоля/кг.

РАСКРЫТИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Роль химических элементов в функционировании живого организма не вызывает сомнения, доказано их участие в большинстве биохимических процессов и разнообразных функциях. При этом каждый макро- или микроэлемент характеризуется определенным оптимальным диапазоном содержания в организме. Отклонения в концентрации химических элементов способны привести к возникновению реакций различной степени выраженности, физиологическим изменениям в пределах обычной регуляции, значительным нарушениям метаболизма и специфическим заболеваниям (Авцын А. П. Микроэлементозы человека: этиология, классификация, органопатология / А.П. Авцын, А.А. Жаворонков, М.А. Риш, Л.С. Строчкова. - М.: Медицина, 1991. - 496 с.).

Воздействие токсичных микроэлементов вызывает широкий спектр неблагоприятных последствий для здоровья животных приводя к снижению продуктивных и репродуктивных качеств и др. (Ronis M.J. Reproductive toxicity and growth effects in rats exposed to lead at different periods during development./ M.J. Ronis, T.M. Badger, S.J. Shema, P.K. Roberson, F Shaikh. //Toxicol. Appl. Pharmacol. 1996. - P. 136:361-371. doi: 10.1006/taap.1996.0044; Kalashnikov V. The content of essential and toxic elements in the hair of the mane of the trotter horses depending on their speed / V. Kalashnikov, A. Zajcev, M. Atroshchenko, S. Miroshnikov, A. Frolov, O. Zav'yalov, L. Kalinkova, T. Kalashnikova // Environmental Science and Pollution Research. - 2018. 21961-21967. doi: 10.1007/sl 1356-018-2334-2.).

Способ был реализован следующим образом: на первом этапе исследований был изучен элементный состав волос гривы лошадей (n=415): пород: Башкирская (n=50), Кабардинская (n=52), Вятская (n=56), Тувинская (n=47), Якутская (n=50), Мезенская (n=45), Чистокровная верховая (n=60), Арабская (n=55), на основании этих исследований был установлен процентильный интервал рассчитанный по сумме молей токсичных микроэлементов (75 процентиль), соответствующий предельному уровню концентрации для данной группы животных, принятый по рекомендациям, в качестве «физиологической нормы» (Skalnaya М. G. The limits of physiological (normal) content Ca, Mg, P, Fe, Zn and Cu in human hair. Mikroelementy v meditsine/ M.G. Skalnaya, V. A. Demidov, A. V Skalny. //Microelements in medicine. - 2003. P. 5-10.).

На втором этапе у 215 голов лошадей пород: Башкирская (n=25), Кабардинская (n=30), Вятская (n=25), Тувинская (n=25), Якутская (n=25), Мезенская (n=25), Чистокровная верховая (n=25), Арабская (n=25) были отобраны для изучения по 17-ти локусам микросателлитов ДНК - волосяные луковицы, для определения содержания токсичных микроэлементов - волос с гривы. (Храброва Л.А. Взятие и транспортировка проб для генетического анализа. Генетический метод контроля происхождения лошадей // [Электронный ресурс] URL: http://www.ruhorses.ru/genetic/genetic.html (дата обращения: 07.11.2018); Храброва Л.А. Инструкция (образцы волосы). Правила взятия проб волос для анализа ДНК // [Электронный ресурс] URL: https://medre.ru/dnk-test/instruction-hair.php (дата обращения: 07.11.2018))

Тестирование лошадей проводили в лаборатории генетики ВНИИ коневодства. Выделение ДНК из волосяных луковиц проводили с использованием реагентов «Extra Gene ТМ DNA Prep 200» (ООО «Лаборатория Изоген», Москва). Амплификацию ДНК проводили методом ПНР с использованием 17-плексного набора праймеров для генотипирования лошадей «StockMarksR» в амплификаторе 2720 Thermal Cycler согласно рекомендациям производителя. Разделение и детекция продуктов амплификации проводилась методом капиллярного электрофореза на генетическом анализаторе АВ 3130 (Applied Biosystems). Идентификацию результатов осуществляли с использованием профиля контрольной ДНК и данных международных сравнительных испытаний (Horse Comparison Tests).

Элементный состав волос определяли методами атомно-эмиссионной и масс-спектрометрии (АЭС-ИСП и МС-ИСП) в испытательной лаборатории АНО «Центр биотической медицины», г. Москва (Registration Certificate of ISO 9001:2000, Number 4017 - 5.04.06). Озоление биосубстратов проводили с использованием микроволновой системы разложения MD-2000 (США). Оценка содержания элементов в полученной золе осуществлялась с использованием масс-спектрометра Elan 9000 (Perkin Elmer, США) и атомно-эмиссионного спектрометра Optima 2000 V (Perkin Elmer, США). Элементный состав биосубстратов исследовали по 6 показателям (Al, Cd, Pb, Sn, Hg, Sr).

На основании анализа элементного состава волос гривы лошадей (n=415), были посчитаны суммы молей токсических микроэлементов, дентальным методом определены границы 75% процентиля который составлял 3,09 ммоля/кг.

Анализ аллелей микросателлитов ДНК по 17-ти локусам: VHL20, HTG4, АНТ4, HMS7, HTG6, АНТ5, HMS6, ASB23, ASB2, HTG10, HTG7, HMS3, HMS2, ASB17, LEX3, HMS1, СА425 с суммой токсичных микроэлементов (Sr, Al, Cd, Pb, Sn, Hg), показал, что по локусу HMS7 выявлена четкая взаимосвязь полиморфизма с накоплением токсичных микроэлементов в волосе с гривы (Табл. 1).

Следует отметить, что у лошадей всех 8 изучаемых пород: Башкирской, Кабардинской, Вятской, Тувинской, Якутской, Мезенской, Чистокровной верховой, Арабской обнаружены желательные полиморфы аллелей.

ОСУЩЕСТВЛЕНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ Для подтверждения способа были суммированы желательные полиморфы аллелей: OQ, LO, JM, NO, NQ, которые вошли в первую группу сумма молей токсических элементов которых составляла 2,03 мкмоль/г и аллели KO, KL, LL, KM, JO, JJ, Ж, LN, LM, MN, OO, JL, KK, KN, MM, JN, LQ, NN, МО которые вошли во вторую, сумма молей составила 5,32 мкмоль/л, что достоверно (Р≤0,01) выше чем в первой группе (Табл 2).

* Р≤0,05; ** Р≤0,01, *** Р≤0,001 по сравнению с I группой

Исходя из полученных результатов, рекомендуется проводить отбор лошадей с содержанием суммы токсических микроэлементов ниже 3,09 ммоля/кг, по желательным аллелям: OQ, LO, JM, NO, NQ микросателлитной ДНК по локусу HMS7, концентрация которых не превышает установленной нормы.