ИММУНОАДЪЮВАНТНАЯ КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ ВАКЦИН ПРОТИВ ИНФЕКЦИОННЫХ АГЕНТОВ ВИРУСНОЙ И БАКТЕРИАЛЬНОЙ ПРИРОДЫ

Изобретение относится к медицине, касается вакцинопрофилактики инфекционных заболеваний и описывает адъювантную композицию, состоящую из хитозана и олигодезоксинуклеотида (oligodeoxynucleotide или ODN). Преимущественная область применения: адъювантная композиция обеспечивает повышение иммуногенности и защитного эффекта при включении в состав различных по типу и способу введения вакцин против актуальных инфекционных агентов человека и животных бактериальной и вирусной природы.

Добавление иммуноадъювантов (адъювантов) к вакцинам позволяет решать ряд проблем профилактики актуальных инфекционных заболеваний человека и животных [WHO. State of the world's vaccines and immunization, 3rd ed. 2009, p. 118-122]: повышение эффективности во всех популяционных группах без ущерба безопасности, индукция широко перекрестного иммунного ответа, снижение дозы и переход на простые (однократные) схемы иммунизации. Однако, в настоящее время отсутствуют адъюванты, оптимально сочетающие эффективность, безопасность и экономическую целесообразность, особенно при массовой иммунизации.

Известен способ повышения иммуногенности инактивированной вакцины против гриппа при добавлении адъюванта, содержащего смесь высоко- и низкомолекулярного хитозана с молекулярной массой (ММ) 100-500 и 0,5-20 кДа, соответственно, степенью деацетилирования (СД) в пределах 60-90% [RU 2323742]. Однако способ получения низкомолекулярного хитозана с использованием азотистой кислоты приводит к тому, что образующийся в ходе реакции концевой восстанавливающий ангидроманнозный остаток низкомолекулярного хитозана является нестабильным, альдегидная группа маннозного остатка реагирует с аминогруппой в олигомерах хитозана с образованием основания Шиффа, что способствует расщеплению гликозидной связи следующей за ангидроманнозным остатком с отщеплением воды и образованием 5-гидроксиметилфурфурола [Mourya V.K., Inamdar N.N., Choudhari Y.M. Chitooligosaccharides: synthesis, characterization and applications. Polymer Science. 2011, 53, N.7, p. 583-612]. Из литературных данных известно, что оксиметилфурфурол и продукты его метаболизма обладают токсическим и мутагенным действием. Исследования на крысах подтверждают токсичность оксиметилфурфурола при подкожном введении (200-500 мг/кг) [Abraham K., Gurtler R., Berg K. et al. Toxicology and risk assessment of 5-Hydroxymethylfurfural in food. Mol Nutr Food Res. 2011, 55, N. 5, p. 667-678]. Кроме того, в патенте не указаны результаты испытаний на бактериальные эндотоксины для парентерального введения вакцины с адъювантом.

Известен способ повышения иммуногенности инактивированной вакцины против полиомиелита; в качестве адъюванта используют суспензию микро/наночастиц сульфата хитозония (100-1300 нм) в концентрации 0,05-0,5%. В заявке на патент [RU 2013154748] не уточняются основные физико-химические характеристики адъюванта на основе хитозана: ММ и СД.

Наиболее близким по существу и назначению к предлагаемому изобретению является иммуногенная композиция [US 2004258702], содержащая неионный блок-сополимер Pluronic F127 и/или олигодезоксинуклеотид (ODN) - CpG или хитозан, которую добавляют к анатоксинам столбняка, дифтерии и антигену сибирской язвы. Используют хитозан средней MM (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, штат Миссури) или Protasan® (Хитозан хлорид, UP CL 213; ProNova Biomedical, Осло, Норвегия), приготовленный в концентрации 3% (вес.) в 1% (об.) уксусной кислоте, в 0,9% (вес/об.) хлористого натрия. Однако в патенте не рассматривается совместное использование смеси CpG и хитозана.

Способ приготовления хитозана с ODN описывается в патенте CN 104689325. Смесь хитозана с ODN представляет собой наночастицы олигохитозана с ММ 80-160 кДа, СД 90-98%, с ODN - неметилированная последовательность ДНК (5'-GGCGTT-3', 5-ATCGAT-3, две 5-GTCGTC-3 и две 5'-AACGTT-3' последовательности). В качестве стерилизующего способа используют фильтрование, при этом в патенте не рассматриваются стабильность комплекса наночастиц хитозана с ODN при хранении и способы применения комплекса для повышения иммуногенности вакцин.

Задача, решаемая настоящим изобретением, заключается в создании адъювантной композиции, которая при включении в состав вакцин повысит иммуногенность и защитный эффект иммунобиологических препаратов вне зависимости от типа антигена, способа введения, а также происхождения антигена.

Техническим результатом изобретения является повышение иммуногенности и защитного эффекта различных вакцин против актуальных инфекционных агентов человека и животных. Технический результат достигается тем, что адъювантная композиция содержит хитозан и синтетический олигодезоксинуклеотид. Хитозан в составе адъювантной композиции обеспечивает образование депо с последующим замедленным высвобождением антигена, а олигодезоксинуклеотид - прямую иммуномодулирующую активность по механизму агониста TLR9. В качестве хитозана композиция содержит катионный полисахарид, полученный из хитина крабов, с молекулярной массой в диапазоне от 200 до 1000 кДа, степенью деацетилирования от 75 до 98%, индексом полидисперсности не более 2,0, уровнем эндотоксинов и постороннего белка менее 100 ЕД/мл и 0,05%, соответственно; в качестве олигодезоксинуклеотида - синтетический олигодезоксинуклеотид, представляющий собой 5 повторяющихся мотивов ODN - Cg с тиофосфорильными связями у межнуклеотидных фосфатов при следующем соотношении (масс.) компонентов - хитозанхинтетический ODN как (20-50):1, растворенные в 1% глутаминовой кислоте. Технический результат достигается во всем диапазоне указанных характеристик хитозана: ММ от 200 до 1000 кДа, СД от 75 до 98%, эндотоксины и посторонний белок менее 100 ЕД/мл и 0,05%, соответственно и при различном соотношении хитозан : ODN как (20-50):1.

Известно, что хитозан может использоваться как определяющий адъювантный компонент в составе вакцины, или же оказывать аддитивное действие при комбинировании с прямыми иммуномодуляторами [Heffernan M.J., Zaharoff D.A., Fallon J.K. et al. In vivo efficacy of a chitosanAL-12 adjuvant system for protein-based vaccines. Biomaterials. 2011, 32, N.3, p. 926-932]. Связь характеристик биополимера и его адъювантных свойств в составе различных вакцин не прослеживается.

Известно, что один из механизмов иммуноадъювантного действия высокомолекулярного хитозана заключается в формировании депо в месте введения с последующим замедленным высвобождением антигена [Bertram U., Bernard М., Haensler J. et al. In situ gelling nasal inserts for influenza vaccine delivery. Drug Dev. Ind. Pharm. 2010, 36, N.5, p.581-585]. С целью усиления иммуногенных свойств вакцин в качестве адъювантов также исследуются иммуностимуляторы факторов врожденного иммунитета, в частности, агонисты TLR9 - CpG-ODN [Krieg A.M. Therapeutic potential of Toll-like receptor 9 activation. Nat Rev Drug Discov. 2006, 5, N. 6, p. 471-484].

Мы разработали адъювантную композицию, содержащую хитозан и синтетический ODN для повышения иммуногенности и защитного эффекта вакцин против бактериальной и вирусной природы за счет потенцирующего действия минимальных доз индивидуальных веществ.

Изобретение иллюстрируется следующими графическими материалами:

Фиг. Химическая структура хитозана (n>m):

m - остаток ацетилглюкозамина;

n - остаток глюкозамина.

Примеры

Пример 1. Получение адъювантной композиции

Адъювантная композиция представляет собой смесь раствора хитозана в кислоте, представляющего собой природный катионный полисахарид (фиг. 1), полученного из хитина крабов, с ММ 200-1000 кДа, СД 75-95%, индексом полидисперсности (ИП) 1,8-2,3, уровнем эндотоксинов и постороннего белка менее 100 ЕД/мл и 0,05%, соответственно, и синтетического ODN, представляющего собой 5 повторяющихся сегментов Cg с тиофосфорильными связями у межнуклеотидных фосфатов.

Хитозан (фирмы ООО «Биопрогресс», Щелково, Московская область) со средневязкостной молекулярной массой 200 и 1000 кДа, СД 95 и 85%, соответственно, подвергали дополнительной очистке. Для этого хитозан с ММ 200 и 1000 кДа, СД 85% растворяли в 1М уксусной кислоте при рН 3,8 в течение 4-х часов. Проводили фильтрование от грубых примесей с использованием фильтра с диаметром пор 100-160 мкм (ISO 4793-80). Фильтрат титровали 12% раствором NH4OH до рН 8,0-8,5. Выпавший осадок хитозана диализовали с многократной сменой воды. По окончании диализа хитозан лиофильно высушивали. Хитозаны (фирмы Sigma-Aldrich, США) с ММ от 200 до 600 кДа, СД от 75 до 85% использовали без предварительной очистки. Различными методами для хитозана были определены основные характеристики - ММ и СД. С помощью ПМР, кондуктометрического титрования и УФ-спектрометрии определяли СД. С использованием ВЭЖХ и капиллярной вискозиметрии определяли ММ. С помощью ВЭЖХ также определяли ИП. Характеристику чистоты исходных субстанций и препаратов хитозана проводили по уровню специфической примеси - эндотоксинов с использованием хромогенного LAL-теста, остаточного белка - аминокислотным анализом. ODN, представляющий собой 5 повторяющихся сегментов Cg с тиофосфорильными связями у межнуклеотидных фосфатов коммерческий. Для приготовления адъювантной композиции компоненты растворяли в 1% глутаминовой кислоте при следующем соотношении хитозана : ODN как (20-50): 1. Адъювантную композицию автоклавировали при температуре 121°С в течение 15 мин.

Пример 2. Потенциирующий эффект

К расщепленной вакцине против гриппа H1N1 добавляли адъюванты: хитозан, или ODN, или адъювантную композицию в виде раствора так, чтобы получить конечную концентрацию адъюванта 0,5% и 3 мкг вакцины в общем объеме 0,2 мл. Мышей иммунизировали внутримышечно, двукратно, вводя по 0,2 мл вакцины с адъювантом или без него (фосфатно-солевой раствор (ФСР)). Хитозан и ODN по отдельности достаточно иммуногенны, однако в составе композиции они обладают потенцирующим действием: существенно повышают титры сывороточных антител в отношении всех 3 компонентов расщепленной сезонной вакцины против гриппа. Иммуногенность расщепленной вакцины в отношении вируса H1N1 представлена в Таблице 1. Адъювантная композиция, содержащая хитозан и ODN, повышает средний титр антител в 32 раза в сравнении с вакциной без адъюванта, тогда как адъюванты на основе хитозана или ODN в 8 и 2 раза, соответственно.

Пример 3. Иммуногенность и защитный эффект

К инактивированной цельновирионной вакцине против гриппа на основе штамма A/California/07/2009 Х-179А (H1N1) добавляли адъюванты: хитозан, или ODN, или адъювантную композицию, или гидроксид алюминия, или адъювант Фрейнда (CFA) так, чтобы получить конечную концентрацию адъювантов, %: 0,5 или 0,002 или 0,5 или 0,01 или 0,5, соответственно, и вакцины в соотношении 1:1 (по объему). Мышей иммунизировали как описано в примере 2. Иммуногенность оценивали методом РЗГА по наличию антител в сыворотках против вакцинного вируса. Результаты представлены в Таблице 2. Адъювантная композиция, содержащая хитозан и ODN, существенно повышает иммуногенность инактивированной цельновирионной вакцины против гриппа свиного происхождения на основе штамма H1N1 в сравнении с адъювантами других групп по природе и механизму действия (Таблица 2).

В сравнении с вакциной без адъюванта средние титры антител при иммунизации адъювантной композицией, состоящей из хитозана и ODN, увеличиваются в 20 раз; хитозана - в 10 раз; ODN или гидроксида алюминия - не увеличиваются; адъюванта Фрейнда (CFA) - в 3 раза. При интраназальном введении живых аттенуированных вакцин на основе холодоадаптированных штаммов гриппа типа А и В адъювантная композиция повышает иммуногенность (местные и системные вирус-специфические иммуноглобулины класса G), а также защитный эффект вплоть до стерильного иммунитета.

Пример 4. Иммуногенность вакцин против полиомиелита

К инактивированной цельновирионной вакцине против полиомиелита I, II и III типа на основе живых аттенуированных (Sabin) и диких штаммов добавляли адъюванты: хитозан, или ODN, или адъювантную композицию, или гидроксид алюминия, или адъювант Фрейнда (CFA) так, чтобы получить конечную концентрацию адъювантов, как описано в примере 3. Наличие антител в сыворотках крови определяли в реакции нейтрализации (РН). Иммуногенность вакцины против вируса Sabin III типа представлена в Таблице 3.

Добавление к вакцине адъювантной композиции, состоящей из хитозана и ODN, приводило к повышению антител нейтрализующих продуктивную инфекцию в 128 раз в сравнении с вакциной без адъюванта; хитозана - в 32 раза, ODN - в 4 раза, гидроксида алюминия - в 8 раз, адъюванта Фрейнда (CFA) - в 16 раз.

Адъювантная композиция, содержащая хитозан и ODN, существенно повышает иммуногенность инактивированных цельновирионных вакцин против полиомиелита I, II и III типа на основе живых аттенуированных (Sabin) и диких штаммов в сравнении с адъювантами других групп по природе и механизму действия.

Пример 5. Защитная эффективность вакцин против синегнойной палочки (рекомбинантные антигены)

К рекомбинантной вакцине против синегнойной палочки добавляли адъюванты: хитозан, или адъювантную композицию, или гидроксид алюминия, так чтобы получить конечную концентрацию адъювантов, как описано в примере 3. Добавление к рекомбинантной вакцине адъювантной композиции, содержащей хитозан и ODN, приводило к существенному повышению защитной эффективности вакцины на модели летальной инфекции синегнойной палочки. Индекс эффективности при использовании композиции превышал 6,0, хитозана - 3,0, гидроксида алюминия - 2,0. После двукратной внутримышечной иммунизации мышей вакциной с добавлением адъювантной композиции полная защита от инфекции обеспечивалась до LD50 80 млн. м.к.