Результат интеллектуальной деятельности: Способ прогнозирования безрецидивной и общей выживаемости у ВПЧ16-позитивных больных раком шейки матки

Изобретение относится к области медицины, конкретно к онкологии, и может быть использован для прогнозирования безрецидивной и общей выживаемости у ВПЧ 16-позитивных больных раком шейки матки

Одним из актуальных вопросов современной онкологии является проблема прогнозирования течения злокачественных новообразований для проведения коррекции противоопухолевой терапии. Важным направлением разработок является поиск новых более информативных маркеров, а также выявление новых комбинаций уже установленных показателей, позволяющих существенно повысить точность прогноза.

Согласно последним эпидемиологическим данным, рак шейки матки находится на 6-ом месте по частоте встречаемости среди женского населения РФ, а в структуре онкологических заболеваний женской репродуктивной системы - на 3-м после рака молочной железы и тела матки. Также высоко число заболевших/умерших от данной онкопатологии в России - за последний год данные показатели составили 6522 и 4248 женщины, соответственно [1]. Кроме того, в последние годы неуклонно растет количество случаев злокачественных эпителиальных опухолей шейки матки, связанных с вирусом папилломы человека высокого канцерогенного риска, который является важнейшим этиологическим фактором канцерогенеза шейки матки [2, 3]. По данным различных исследований до 85-95% больных РШМ в России являются носителями ВПЧ ВКР, и, соответственно, только 5-15% опухолей шейки матки не содержит вируса. При этом, из всех ВПЧ-позитивных больных раком шейки матки, до 70% являются носителями именно ВПЧ 16 генотипа [7].

Попадая в организм, ВПЧ инфицирует базальный слой эпителия зоны трансформации шейки матки. После проникновения в базальную клетку многослойного плоского эпителия освободившаяся от капсида ДНК ВПЧ ВКР поступает в ядро, где поддерживается в виде эписомы. Персистенция ВПЧ может сопровождается интеграцией ДНК ВПЧ в геном клеток эпителия шейки матки, что, в свою очередь, приводит к геномной нестабильности, потере способности к апоптозу и является ключевым событием в злокачественной трансформации эпителиальных клеток шейки матки [4]. Интеграция ВПЧ в клеточный геном сопровождается снижением функциональной активности вирусного белка Е2, которое приводит к повышенной экспрессии вирусных белков Е6 и Е7 [5].

При эписомальной форме ВПЧ у большей части пациенток происходит элиминация ВПЧ и не развивается дисплазия и РШМ. Интегрированная форма вируса дольше сохраняется, благодаря чему обнаруживается в эпителиальных дисплазиях высокой степени и РШМ, вызывает пролиферативные процессы в клетках, геномную нестабильность и формирование мутаций [9, 10].

Наиболее близким к заявляемому является способ прогнозирования общей и безрецидивной выживаемости ВПЧ 16-позитивных больных РШМ на основе определения физического статуса вируса (Das, P., A. Thomas, S. Kannan, K. Deodhar, S.K. Shrivastava, U. Mahantshetty, and R. Mulherkar. Human papillomavirus (HPV) genome status & cervical cancer outcome-A retrospective study// The Indian journal of medical research. 2015, V. 142, N. 5. P. :525-532), Рестроспективное наблюдение в течение 18 месяцев включало 132 пациенток с РШМ. Интегрированная форма ВПЧ определена в 86,0% случаев (114 больных), тогда как 18 пациенток были носительницами эписомальной формы вируса. Пациентки с эписомальной формой вируса имели лучшую общую и безрецидивную выживаемость по сравнению с группой пациенток с интегрированной формой вируса, однако, статистическая значимость была отмечена только на уровне тенденции (р=0,095). Таким образом, существенным недостатком предлагаемого способа является низкий уровень доверительной вероятности, что не позволяет в таком виде использовать определение физического статуса в качестве фактора прогноза.

Новый технический результат - повышение точности способа.

Для достижения нового технического результата в способе прогнозирования безрецидивной и общей выживаемости у ВПЧ 16-позитивных больных раком шейки матки, включающем определение физического статуса вируса папилломы человека 16 генотипа в соскобе эпителия цервикального канала и наружной части шейки матки, который берут у пациенток во время первичного осмотра, с последующим выделением ДНК и проведением качественной и количественной оценки наличия вируса папилломы человека высокого канцерогенного риска при помощи ПЦР в режиме реального времени, оценивают физический статус вируса папилломы человека 16 генотипа при помощи количественной ПЦР в режиме реального времени по следующим критериям: выявление области Е6 при отсутствии области Е1/Е2 интерпретируют, как интеграцию ВПЧ в ДНК человека, выявление области Е6 при наличии области Е1/Е2 - как смешанную форму или частичную интеграцию вируса в ДНК человека, отсутствие области Е6 при наличии области Е1/Е2 - как эписомальную форму вируса и при выявлении только интегрированной формы ВПЧ 16, прогнозируют высокий риск агрессивного течения заболевания, в случае определения только эписомальных форм вируса с высокой степенью вероятности прогнозируют 100% общую и безрецидивную выживаемость, а у больных со смешанной формой ВПЧ 16 типа прогнозируют промежуточный риск безрецидивной и общей выживаемости.

При выделении по физическому статусу ВПЧ 16 типа трех групп статистическая значимость прогноза составляет р=0,001 для безрецидивной выживаемости и р=0,003 для общей выживаемости, т.е. по сравнению с прототипом точность прогноза увеличивается в 32-95 раз.

Способ осуществляют следующим образом. У больных РШМ проводят молекулярно-генетическое исследование биологического материала (соскоб цервикального канала и шейки матки). Соскоб цервикального канала и шейки матки осуществляется стандартными методами (Методические рекомендации по технике сбора и транспортирования биоматериалов в микробиологические лаборатории МУ 4.2.2039-05 от 01.07.2006 г.). Соскоб помещается в реагент для транспортировки и хранения клинического материала «Транспортная среда с муколитиком (ТСМ)» (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия) в пробирку типа эппендорф на 1.5 мл (с 0,5 мл транспортной среды). Пробирка помещается в холодильник на +4°С.

Биологический материал должен быть обработан не позднее, чем через 1 сутки. Если обработка задерживается более чем на сутки, то пробирки с образцами следует поместить в морозильную камеру с температурой не выше минус 20°С. Допускается использование свежего/замороженного биологического материала. В случае заморозки, разморозить пробирку с образцом, отделить 100 мкл соскоба простым центрифурированием.

Выделение ДНК осуществляется в соответствии с инструкцией к набору реагентов для выделения ДНК из клинического материала «ДНК-сорб-АМ» (http://www.interlabservice.ru/catalog/reagents/?sid=1402&id=8692). Концентрация и чистота выделения ДНК оценивается на спектрофотометре NanoDrop-2000 (Thermo Scientific, USA). Концентрация ДНК должна быть не менее 50 нг/мкл, А₂₆₀/А₂₈₀ не менее 2,10; А₂₆₀/А₂₃₀ не менее 2,15. ПЦР-анализ на типы ВПЧ и определение физического статуса проводится при помощи набора реагентов «Amplisens®» ВПЧ ВКР скрин-титр-FL» (с дифференциацией 16 генотипа), кат# R-V31-F (Москва, Россия) в соответствии с инструкцией производителя http://www.interlabservice.ru/catalog/reagents/?sid=1418&id=6002, если выделенная ДНК показала высокое качество при исследовании на спектрофотометре и капиллярном электрофорезе.

Анализ результатов исследования ДНК биологического материала осуществляют при помощи программы, заложенной в стандартную инструкцию к набору реагентов «Amplisens®» ВПЧ ВКР скрин-титр-FL» (с дифференциацией 16 генотипа) (http://www.interlabservice.ru/catalog/reagents/?sid=1402&id=8692).

Обработка полученных данных в указанной выше программе позволяет оценить вирусную нагрузку и физическое состояние (степень интеграции) для ВПЧ 16 генотипа. Оценивают физический статус вируса папилломы человека 16 генотипа при помощи количественной ПЦР в режиме реального времени по следующим критериям: выявление области Е6 при отсутствии области Е1/Е2 интерпретируют, как интеграцию ВПЧ в ДНК человека, выявление области Е6 при наличии области Е1/Е2 - как смешанную форму или частичную интеграцию вируса в ДНК человека, отсутствие области Е6 при наличии области Е1/Е2 - как эписомальную форму вируса и при выявлении только интегрированной формы ВПЧ 16 прогнозируют высокий риск агрессивного течения заболевания, в случае определения только эписомальных форм вируса с высокой степенью вероятности прогнозируют 100% общую и безрецидивную выживаемость, а у больных со смешанной формой ВПЧ 16 типа прогнозируют промежуточный (58% безрецидивную и 55% общую выживаемость) риск безрецидивной и общей выживаемости.

Пример 1. Больная К., 37 лет. В 2008 году обратилась в клинику НИИ онкологии Томского НИМЦ.

Диагноз: С53 Рак шейки матки; T₃N₂M₀, стадия IIIB. С целью прогноза течения заболевания выполнено молекулярно-генетическое исследование эпителия шейки матки. В результате проведенного анализа было установлено наличие ВПЧ 16 генотипа, а также определена интегрированная форма вируса (выявлена облает Е6 при отсутствии области Е1/Е2). Общий срок наблюдения за пациенткой составил 7 месяцев. Через 3 месяца после постановки диагноза у больной был обнаружен рецидив опухоли. Общая выживаемость составила 7 месяцев.

Пример 2. Больная Л., 50 лет. В 2010 году обратилась в клинику НИИ онкологии Томского НИМЦ.

Диагноз: С531 Рак шейки матки; T₂N₂M₀, стадия IIIB. С целью прогноза течения заболевания выполнено молекулярно-генетическое исследование эпителия шейки матки согласно предлагаемому способу. В результате проведенного анализа было установлено наличие ВПЧ 16 генотипа, а также определено состояние вируса, как эписомальное (отсутствие области Е6 при наличии области Е1/Е2). Общий срок наблюдения за пациенткой составил 42 месяца. Данные за прогрессирование заболевания, рецидив опухоли, отдаленное метастазирование не получены.

Пример 3. Больная В., 49 лет. В 2008 году обратилась в клинику НИИ онкологии Томского НИМЦ.

Диагноз: С538 Рак шейки матки; T₃N_XM₀, стадия IIB. С целью прогноза течения заболевания выполнено молекулярно-генетическое исследование эпителия шейки матки согласно предлагаемому способу. В результате проведенного анализа было установлено наличие ВПЧ 16 генотипа, а также определена смешанная форма вируса (выявление области Е6 при наличии области Е1/Е2). Общий срок наблюдения за пациенткой составил 24 месяцев. В 2011 году при проведении контрольного обследования был обнаружен рецидив опухоли.

Предлагаемый способ основан на анализе результатов клинических исследований. В исследование было включено 53 пациентки в возрасте от 21 до 79 лет с первичным местно-распространенным РШМ (11в-111в стадий), проходивших обследование и лечение в НИИ онкологии Томского НИМЦ. Диагноз верифицирован гистологически, опухоли были охарактеризованы в соответствии с классификацией FIGO (классификация Международной федерации акушеров и гинекологов). Комплексное обследование включало гинекологический осмотр, кольпоскопию, цитологическое и гистологическое исследование, УЗИ, MPT, КТ что позволило верифицировать диагноз. Всем больным проведена неоадъювантная химиотерапия по схеме гемзар-цисплатин (2 курса), операции в объеме расширенной экстирпации матки с придатками или без и сочетанной лучевой терапии - дистанционной ЛТ в СОД 46 Гр и внутриполостной ЛТ в СОД 50 Гр.

Материалом для исследования служили соскобы эпителия цервикального канала и наружной части шейки матки. Выявление и генотипирование ДНК ВПЧ проводили методом мультиплексной полимеразной цепной реакции (ПЦР) в режиме реального времени на приборе RotorGene 6000 («Corbett Research)), Австралия) с использованием комплектов реагентов фирмы «Amplisens®» ("АмплиСенс® ВПЧ ВКР скрин-титр-FL", кат# R-V31-T-4x (RG, iQ, Mx); "АмплиСенс® ВПЧ ВКР генотип-FL", кат# R-V25(RG, iQ, Mx)) (Москва, Россия). Физический статус ДНК ВПЧ 16 определялся с использованием набора реагентов «Amplisens®)) ВПЧ ВКР скрин-титр-FL» (с дифференциацией 16 генотипа), кат# R-V31-F (Москва, Россия). Значение вирусной нагрузки рассчитывалось в геномных эквивалентах ДНК ВПЧ/105 клеток, порог релевантного количества вируса принимался равным 3 lg ДНК ВПЧ /105 клеток в соскобе. Выявление области Е6 при отсутствии области Е1/Е2 интерпретировалось как интеграция ВПЧ в ДНК человека, выявление области Е6 при наличии области Е1/Е2 - как смешанная форма или частичная интеграция вируса в ДНК человека, отсутствие области Е6 при наличии области Е1/Е2 - как эписомальная форма вируса.

Для оценки статистической значимости различий в распределении частот качественных признаков между группами использовали двусторонний критерий Фишера http://vassarstats.net/odds2x2.html. Для количественных признаков использовали U-критерий Манна-Уитни. Оценку выживаемости проводили по методу Каплана-Майера. Каждая пациентка из представленной группы являлась носительницей ВПЧ 16 типа.

В ходе нашего исследования было показано, что частоты форм ВПЧ 16 типа распределились следующим образом: эписомальная форма встречалась в 9,4% случаев, смешанная и интегрированная - в 62,3% и 28,3% случаев, соответственно.

Далее были проанализированы исходы заболевания в зависимости от физического статуса вируса. На фиг. 1 и 2 представлена безрецидивная и общая выживаемость больных РШМ в зависимости от физического статуса вируса для ВПЧ 16+ больных.

Установлено, что распределение безрецидивной и общей выживаемости для всех четырех групп больных статистически значимо. У больных с эписомальной формой ВПЧ 16 типа наблюдается 100% безрецидивная и общая выживаемость. Самый неблагоприятный исход отмечается у больных с интегрированной формой ВПЧ 16 типа. Медиана безрецидивной выживаемости у них составила 7 месяцев, и в течение 26 месяцев была отмечена 100% смертность больных.

Было проведено сравнение основных клинико-патологических параметров у больных всех 3-х представленных групп, не установлено статистически значимых различий в распределении параметров (данные не представлены). Это показывает, что физический статус ВПЧ является независимым фактором прогноза РШМ.

В результате проведенного исследования, были получены данные о выживаемости больных РШМ в зависимости от физического статуса вируса для ВПЧ 16+ больных. Было показано, что наилучший прогноз имеют ВПЧ 16+ пациентки с эписомальной формой вируса, наихудший - ВПЧ 16+ пациентки с интегрированной формой.

Значимость прогноза составляет р=0,001 для безрецидивной выживаемости и р=0,003 для общей выживаемости, т.е. по сравнению с прототипом точность прогноза увеличивается в 32-95 раз.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет для больных РШМ обеспечить персонализированный подход к лечению данной группы пациенток и осуществить оптимальный выбор агрессивности лечения.

Источники информации

1. Чиссов В.В. Злокачественные новообразования в России в 2008 году (заболеваемость и смертность). М.: ФГБУ «МНИОИ им. ПА Герцена» Минздравсоцразвития России: 12, 2012.

2. Bosch F.X. Human papillomavirus: science and technologies for the elimination of cervical cancer// Expert opinion on pharmacotherapy. 2011, V. 12. P. 2189-2204.

3. zur Hausen H. Papillomaviruses in the causation of human cancers-a brief historical account// Virology. 2009, V.384, N 2. P. 260-265.

4. Tungteakkhun S.S., and Duerksen-Hughes P.J. Cellular binding partners of the human papillomavirus E6 protein// Archives of virology. 2008, V. 153. P. 397-408.

5. Ершов В., Чирский В., Вязовая А., Нарвская О., Лисянская А. Активность процессов пролиферации и апоптоза при интеграции ДНК вируса папилломы человека 16-го типа в цервикальный эпителий// Архив патологии. 2013, В. 75(2), стр. 16-19.

6. Jiang М., Baseman J.G., Koutsky L.A., Feng Q., Мао С, Kiviat N.B., and Xi L.F. Sequence variation of human papillomavirus type 16 and measurement of viral integration by quantitative PCR// Journal of clinical microbiology. 2009, V. 47, N 6. P. 521-526.

7. Уразова Л.Н., Мерзлякова M.К., Никитина Е.Г., Писарева Л.Ф., Коломиец Л.А., Чуруксаева О.Н., Шивит-оол А.А. Сравнительное изучение уровня инфицированности вирусом папилломы человека высокого онкогенного риска женского населения Томской области и республики Тыва// Эпидемиология и вакцинопрофилактика. 2012, В. 6 (67), С. 15-20.

8. Stanley М. Pathology and epidemiology of HPV infection in females// Gynecologic oncology. 2010, V 117, N 2. P. S5-S10.

9. Hu Z., Zhu D., Wang W., Li W., Jia W., Zeng X., Ding W., Wang X., and Wang L.. Genome-wide profiling of HPV integration in cervical cancer identifies clustered genomic hot spots and a potential microhomology-mediated integration mechanism// Nature genetics. 2015, V 47. P. 158-163.

10. Vink M. A., Bogaards J.A., van Kemenade F.J., de Melker H.E., Meijer C.J., and Berkhof J. Clinical progression of high-grade cervical intraepithelial neoplasia: estimating the time to preclinical cervical cancer from doubly censored national registry data// American journal of epidemiology. 2013, V. 178, N. 8. P. 1161-1169. 11. Das P., Thomas A., Kannan S., Deodhar K., Shrivastava S.K., Mahantshetty U., and Mulherkar R. Human papillomavirus (HPV) genome status & cervical cancer outcome-A retrospective study// The Indian journal of medical research. 2015, V. 142, N. 5. P. :525-532.

Фиг 1. Безрецидивная выживаемость больных РШМ в зависимости от физического статуса вируса для ВПЧ 16+ больных (р=0,001)

Фиг 2. - Общая выживаемость больных РШМ в зависимости от физического статуса вируса для ВГТЧ 16+ больных (р=0,003)