Способ профилактики привычного невынашивания беременности

Изобретение относится к области молекулярной генетики и репродуктивной медицины и может быть использовано для профилактики привычного невынашивания беременности.

Среди важнейших проблем практического акушерства и репродуктивной медицины одно из первых мест занимает проблема невынашивания беременности. В настоящее время установлено, что 15-20% всех клинически диагностируемых беременностей заканчивается спонтанным прерыванием, из них 75-80% в сроке до 12 недель. Подобное явление имеет место в популяции, вероятно, как фактор естественного отбора, препятствующий развитию генетически аномальных плодов. При этом существует около 1-2% супружеских пар, у которых потери беременности происходят неоднократно - это так называемое привычное невынашивание беременности.

Согласно определению ВОЗ, привычным невынашиванием беременности принято считать наличие в анамнезе у женщины подряд трех и более самопроизвольных прерываний беременности в сроке до 22 недель, однако Американское общество репродуктивной медицины (ASRM) предлагает относить семью к категории привычного невынашивания уже после двух последовательных выкидышей, при этом масштаб проблемы возрастает до 2-5% супружеских пар [1].

В этиологической структуре привычного невынашивания беременности выделяют генетические, анатомические, инфекционные, эндокринные и иммунологические факторы. При исключении всех вышеперечисленных причин, ведущих к потерям беременности, остается 40% женщин, генез привычного выкидыша у которых представляется неясным (идиопатические выкидыши).

Известен способ ЕР 2881464 (Method for assessing risk of imprinting disorder / Метод оценки риска болезней импринтинга) от 18.06.2015, который заключается в тестировании статуса метилирования импринтированных генов в сперме при использовании вспомогательных репродуктивных технологий для исключения передачи потомству от отца импринтированных генов с нарушенным статусом метилирования по сравнению с нормой.

Прототипом заявленного способа выбран патент СА 2863078 А1 (ЕР 2686444), опубликованный 20.09.2012 (NLRP7 - based diagnosis of female reproductive conditions / NLRP7 - основа для диагностики женских репродуктивных состояний). Этот способ направлен на идентификацию мутаций в гене NLRP7 (Gene ID 199713, 19q13.42) у женщин с привычным невынашиванием беременности, имеющих в анамнезе только пузырный занос. Недостатками прототипа являются анализ причин только пузырного заноса и анализ носительства мутаций гена NLRP7 только у женщин, в анамнезе которых привычное невынашивание беременности сопровождается наличием пузырного заноса.

Новый технический результат - повышение вероятности наступления беременности в рамках циклов экстракорпорального оплодотворения за счет более точного определения причины идиопатического привычного невынашивания беременности и элиминации эмбрионов с наследственными мутациями, влияющими на течение нормального эмбрионального развития.

Для достижения нового технического результата в способе профилактики привычного невынашивания беременности, включающем проведение тестирования множественных эпимутаций импринтированных генов у спонтанного абортуса, у спонтанного эмбриона с предварительно установленным нормальным кариотипом, исключающим наличие хромосомных аномалий, определяют статус метилирования 7 импринтированных генов PEG1, DLK1, PEG10, PLAGL1, KCNQ10T1, PEG3 и GRB10 с предпочтением анализа метилирования в локусах PEG1, DLK1 и PEG10, и в случае наличия у эмбриона эпимутаций в трех и более импринтированных генах, у него проводят секвенирование гена NLRP7 (Gene ID 199713), при наличии у абортуса мутаций в гене NLRP7 в гомозиготном или компаундном гетерозиготном состоянии выявляют носительство этих мутаций у обоих супругов и при выявлении носительства гена NLRP7 рекомендуют проводить преимплантационную генетическую диагностику при экстракорпоральном оплодотворении для отбора и переноса эмбриона с нормальным генотипом по гену NLRP7.

Способ осуществляют следующим образом:

1. Проводят цитогенетический анализ плацентарных тканей (цитотрофобласт хориона или внезародышевая мезодерма) у спонтанного абортуса от супружеской пары с идиопатическим привычным невынашиванием беременности для исключения хромосомных аномалий в эмбриональных клетках;

2. У абортусов с нормальным кариотипом определяют статус метилирования импринтированных генов PEG1, DLK1, PEG10, PLAGL1, KCNQ1OT1, PEG3 и GRB10 с первоочередным анализом характера метилирования в локусах PEG1, DLK1 и PEG10, в которых наиболее чаще выявляются эпимутаций;

3. В случае наличия у эмбриона эпимутаций в трех и более импринтированных генах, проводят секвенирование гена NLRP7, с первоочередным анализом нуклеотидной последовательности экзонов 5, 6, 9 и 13 [9];

4. При наличии у абортуса мутации в гене NLRP7 выявляют носительство этих мутаций у супругов путем секвенирования выявленного участка NLRP7 с использованием ДНК из лимфоцитов периферической крови;

5. Рекомендация преимплантационной генетической диагностики при экстракорпоральном оплодотворении для выбора бластоцисты с нормальным генотипом по гену NLRP7.

Возможное оборудование для осуществления способа: световой микроскоп, ПЦР-амплификтор, секвенатор.

Предлагаемый способ основан на анализе результатов собственных научных исследований. Ранее авторами был показан мультилокусный характер эпимутаций импринтированных генов у спонтанных абортусов I триместра беременности с нормальным кариотипом при привычном невынашивании беременности у матери [2; 3]. Затем множественный характер эпимутаций импринтированных генов при патологии эмбрионального развития был подтвержден и другими исследователями [4; 5]. Позднее авторами был проведен анализ полногеномного статуса метилирования импринтированных локусов при нарушениях внутриутробного развития человека с помощью метилочипа «GoldenGate Cancer Panel I» (Illumina). В результате были установлены спектр и частота эпимутаций импринтированных генов, оценен их вклад в нарушение ранних этапов онтогенеза человека, определены импринтированные гены, затронутые множественными эпимутациями. Такими генами оказались DLK1, PEG 10, PLAGL1, KCNQ1OT1, PEG3, GRB10, PEG1/MEST, PHLDA2, WT1, ZNF215, HTR2A, INS, HI9, TRPM5, GNAS, SNURF-SNRPN, ATP10A и CPA4 [6]. Репликативное исследование статуса метилирования 7 импринтированных генов, наиболее часто затрагиваемых эпимутациями (DLK1, PEG10, PLAGL1, KCNQ1OT1, PEG3, GRB10 и PEG1/MEST), в расширенных выборках эмбрионов подтвердило результаты микрочипового анализа. Установлено, что потери беременности действительно сопровождаются мультилокусными дефектами метилирования импринтированных генов, частота которых статистически значимо повышена у спонтанных абортусов с нормальным кариотипом от женщин с привычным невынашиванием [7].

Мультилокусность эпимутаций импринтированных генов поднимает вопрос о причинах возникновения данного феномена, указывая на возможность существования особых регуляторных механизмов, централизовано контролирующих эпигенетический статус множества импринтированных локусов генома. В данном контексте авторами была предложена гипотеза о том, что наличие мутаций в гене NLRP7 (Gene ID 199713, 19q13.42) может быть причиной формирования множественных эпимутаций в импринтированных генах, являющихся причиной регулярной остановки эмбрионального развития. Предпосылкой для таких утверждений стали данные мировой литературы об ассоциации мутаций в гене NLRP7 с множественными дефектами метилирования в импринтированных генах при биродительском полном пузырном заносе, при котором фенотипическая картина полного пузырного заноса, в отличие от классического диандрогенетического варианта, формируется на фоне нормального кариотипа в зиготе [8]. Позже авторами у 7 из 14 спонтанных абортусов с эпимутациями в трех и более импринтированных генах от женщин с привычным невынашиванием беременности было выявлено 7 новых миссенс-мутаций и три мутации сдвига рамки считывания в гене NLRP7. Все мутации были представлены в компаундном гетерозиготном или в гомозиготном состоянии с некоторыми известными полиморфными вариантами. Анализ родительского происхождения показал, что новые мутации у трех эмбрионов были унаследованы от отцов, в то время как все полиморфные варианты имели материнское происхождение. Примечательно, что большинство из множественных эпимутаций в импринтированных генах были представлены постзиготическим гипометилированием материнских аллелей PEGS, PEG10, DLK1, PLAGL1 и KCNQ1OT1, тогда как герминативное гиперметилирование отцовских аллелей гена PEG1 было найдено исключительно у спонтанного абортуса с мутациями гена NLRP7 отцовского происхождения. Таким образом, распространенность мутаций NLRP7 в отцовской зародышевой линии дает новое понимание молекулярно-генетических механизмов, ответственных за контроль геномного импринтинга в сперматогенезе и на ранних стадиях эмбрионального развития человека повышает точность и информативность диагностики.

Предлагаемый способ основан на анализе данных следующих репрезентативных объемов выборок:

1) Два вида плацентарных тканей (цитотрофобласт хориона и внезародышевая мезодерма) 234 спонтанных абортусов первого триместра беременности с нормальным кариотипом и с внутриутробной остановкой развития, верифицированной с помощью ультразвукового обследования (всего 468 образцов), из них:

а) 120 спонтанных абортусов от женщин с привычным невынашиванием беременности (два и более спонтанных аборта, 240 образцов);

б) 114 спонтанных абортусов от женщин с одной потерей беременности в анамнезе (228 образцов).

2) Два вида плацентарных тканей (цитотрофобласт хориона и внезародышевая мезодерма) 100 медицинских абортусов I триместра беременности с нормальным кариотипом, полученных от женщин, добровольно прервавших нормально протекавшую беременность не по медицинским показаниям (всего 200 образцов, контрольная группа).

3) Супружеские пары без привычного невынашивания беременности, имевшие спонтанный аборт с нормальным кариотипом (100 семей).

4) Супружеские пары с идиопатическим привычным невынашиванием беременности (три и более спонтанных аборта при отсутствии живорожденных детей). Объем выборки - 50 семей, от которых доступен биологический материал как минимум одного спонтанного абортуса с нормальным кариотипом.

Методы, использованные для проведения данных научных исследований:

1) Выделение ДНК осуществляли из плацентарных тканей спонтанных и медицинских абортусов, и лимфоцитов периферической крови.

2) Кариотип спонтанных и медицинских абортусов, так же как и в лимфоцитах периферической крови, устанавливали с помощью стандартного кариотипирования G-окрашенных метафазных хромосом, либо, в случае спонтанных абортусов с низкой пролиферативной активностью клеток, комбинации сравнительной геномной гибридизации (CGH) и флуоресцентной in situ гибридизации (FISH) для исключения анеуплоидии и полиплоидии у абортусов.

3) Анализ статуса метилирования был выполнен с помощью метилочипа «GoldenGate Methylation Cancer Panel I» (Illumina, США) после бисульфитной модификации ДНК, согласно протоколу производителя. Результаты гибридизации анализировали с использованием программного пакета «GenomeStudio Methylation Module» (Illumina, США), который переводит интенсивность флуоресценции в количественную величину β - индекс метилирования.

4) Определение статуса метилирования отдельных импринтированных генов осуществлялся с использованием метил-чувствительной (МЧ-ПЦР), метил-специфической (МС-ПЦР) ПЦР или метилспецифической мультиплексной лигазной цепной реакции (MS-MLPA).

Эффективность использования способа профилактики привычного невынашивания беременности: в группе спонтанных абортусов с нормальным кариотипом множественные эпимутации, затрагивающие нарушение статуса метилирования двух генов, выявлены как в группе эмбрионов от женщин с привычным невынашиванием беременности (24,2%), так и у эмбрионов от женщин только с одним выкидышем (6,1%). Вместе с тем, наличие трех и более эпимутаций в импринтированных генах было отмечено только в группе спонтанных абортусов от женщин с привычным невынашиванием беременности (11,7%). Поэтому обоснована необходимость тестирования эпимутаций у СА, как минимум в трех импринтированных генах. Из 7 включенных в предложенный способ диагностики импринтированных генов PEG1, DLK1, PEG 10, PLAGL1, KCNQ1OT1, PEGS и GRB10, выбранных на основе данных широкогеномного и репликативного исследования [6; 7], с наибольшей частотой нарушения статуса метилирования выявляются в генах PEG1, DLK1 и PEG 10 (от 15%о в гене DLK1 до 29% в гене PEG1) Частота эпимутаций в других генах составляет 9% (KCNQ1OT1, GRB10) и 10,8% (PLAGL1). В группе эмбрионов с тремя и более эпимутациями в импринтированных генах мутации в гене NLRP7, согласно собственным данным, обнаруживаются в 50% случаях. Соответственно, вероятность обнаружения мутации NLRP7 у спонтанного абортуса с нормальным кариотипом и эпимутациями не менее чем в трех импринтированных генах составит 5,85%. Если учесть тот факт, что аномалии хромосом при кариотипировании спонтанных абортусов выявляются примерно в 50% случаев, то в неселектированной группе абортусов от женщин с привычным невынашиванием беременности мутации в гене NLRP7 будут обнаруживаться с вероятностью 2,93%. Именно для этой части супружеских пар с идиопатическим привычным невынашиванием беременности показано выявление носительства мутаций NLRP7, обнаруженных у их спонтанного абортуса. Идентификация носительства мутаций в генах, контролирующих эпигенетический статус импринтированных локусов, позволило предложить таким супружеским парам процедуру преимплантационной генетической диагностики для исключения передачи потомству мутантного аллеля.

Эффективность использования прототипа СА 2863078 А1 (ЕР 2686444): среди супружеских пар спорадический полный пузырный занос встречается с частотой в среднем 1:600 или 0,17%. Из них 6% имеют привычное невынашивание беременности сопровождающееся пузырным заносом. Частота встречаемости данной патологии составляет 0,01% [10]. При этом мутации в гене NLRP7 из них обнаруживаются примерно в 60%. Таким образом, только для 0,06% супружеских пар рекомендован данный способ диагностики. Сопоставляя полученные показатели 2,93% (заявляемый способ диагностики) и 0,06% (прототип) видно, что настоящий способ диагностики более эффективен.

Пример 1.

Пациентка М.Е., 29 лет, диагноз - идиопатическое привычное невынашивание беременности, имеющая в последнем случае неразвивающуюся беременность в сроке 12 недель. Срок развития эмбриона по данным ультразвукового исследования составил 10-11 недель. В анамнезе три неразвивающихся беременности в сроке 8-12 недель.

Проведен цитогенетический анализ внезародышевой мезодермы для выявления хромосомных аномалий. Установлен нормальный кариотип 46,ХХ. Анализ статуса метилирования импринтированных генов в плацентарных тканях (цитотрофобласт хориона и внезародышевая мезодерма) показал наличие у спонтанного абортуса эпимутаций в четырех импринтированных генах: герминативное гиперметилирование гена PEG1 и соматическое гипометилирование генов DLK1, PEG10, PLAGL1. Секвенирование гена NLRP7 показало наличие у спонтанного абортуса двух миссенс-мутаций в компаундном гетерозиготном состоянии: первая - 6 экзон с.1753С>Т, p.Asp423Asn; вторая - 9 экзон с.2811С>Т, p.Gly775Asp (rs542783229). Секвенирование гена NLRP7 у родителей абортуса показало наследование первой мутации от отца, а второй - от матери. Оба родителя имели эти мутации в гетерозиготном состоянии. Заключение: супругам рекомендовано проведение преимплантационной генетической диагностики при экстракорпоральном оплодотворении для выбора бластоцисты с нормальным генотипом по гену NLRP7. В последствии с учетом рекомендаций в результате проведенного ЭКО рожден доношенный ребенок.

Пример 2.

Пациентка М.В., 32 года, диагноз идиопатическое привычное невынашивание беременности, имеющая в последнем случае неразвивающуюся беременность в сроке 10 недель. Срок развития эмбриона по данным ультразвукового исследования составил 8 недель. В анамнезе три неразвивающихся беременности в сроке 8-12 недель.

Цитогенетический анализ внезародышевой мезодермы показал нормальный кариотип эмбриона (46,XY). Анализ статуса метилирования импринтированных генов в цитотрофобласте хориона и внезародышевой мезодерме выявил наличие эпимутаций в двух импринтированных генах, а именно: герминативное гиперметилирование гена PEG1 и соматическое гипометилирование генов DLK1. Заключение: супругам не рекомендовано проведение секвенирования гена NLRP7 у эмбриона и его родителей с целью проведения преимплантационной генетической диагностики при экстракорпоральном оплодотворении для выбора бластоцисты с нормальным генотипом по гену NLRP7.

Таким образом, преимущество заявляемого способа заключается в повышении его точности и информативности за счет дополнительного учета результатов тестирования причин привычного невынашивания беременности у женщины в независимости от наличия или отсутствия в ее анамнезе пузырного заноса, а также результатов тестирования мутаций в гене NLRP7 у обоих супругов при наличии у их спонтанного абортуса с нормальным кариотипом мутаций в этом гене в компаундном гетерозиготном или гомозиготном состоянии с целью выбора бластоцисты с нормальным генотипом по гену NLRP7 для дальнейшего использования данных во время процедур эктракорпорального оплодотворения (ЭКО) с целью получения полностью положительных его результатов.

Источники информации, принятые во внимание при составлении описания

1. Pfeifer S., Goldberg J., Lobo R. et al. Definitions of infertility and recurrent pregnancy loss: a committee opinion // Fertil. Steril. 2013. V. 99. P. 63.

2. Саженова E.A., Лебедев И.Н. Эпимутаций центра импринтинга KCNQ1OT1 хромосомы 11 при ранней эмбриональной гибели у человека // Генетика. 2008. Т. 44. №12. С. 1609-1616.

3. Саженова Е.А., Лебедев И.Н. Эпимутаций импринтированного гена PLAGL1 при привычном невынашивании беременности // Медицинская генетика. 2010. Т. 9. №11. С.34-39.

4. Diplas A.I., Lambertini L., Lee M.J., Sperling R. et al. Differential expression of imprinted genes in normal and IUGR human placentas // Epigenetics. 2009. V. 4. №4. P. 235-240.

5. Pliushch G., Schneider E., Weise D. et al. Extreme methylation values of imprinted genes in human abortions and stillbirths // Am. J. Pathol. 2010. V. 176(3). P. 1084-1090.

6. Саженова Е.А., Скрябин Н.А., Суханова Н.Н., Лебедев И.Н. Мультилокусные эпимутации импринтома при патологии эмбрионального развития человека // Молекулярная биология. 2012. Т. 46. №2. С. 204-213.

7. Саженова Е.А., Никитина Т.В., Скрябин Н.А., Минайчева Л.И., Иванова Т.В., Немцева Т.Н., Юрьев С.Ю., Евтушенко И.Д., Лебедев И.Н. Эпигенетический статус импринтированных генов в плаценте при привычном невынашивании беременности // Генетика. 2017. Т. 53. №3. С. 364-377.

8. Aghajanova L., Mahadevan S., Altmae S. et al. No evidence for mutations in NLRP7, NLRP2 or KHDC3L in women with unexplained recurrent pregnancy loss or infertility // Hum. Reprod. 2015. V. 30(1). P. 232-238.

9. геномная база данных: Ensemble Access Number: http://www.ensembl.org/Homo_sapiens/Transcript/Exons?db=core;g=ENSG00000167634;r=19:54923510-54941750;t=ENST00000588756.

10. Nguyen N.M., Zhang L., Reddy R., Dery C. et al. Comprehensive genotype-phenotype correlations between NLRP7 mutations and the balance between embryonic tissue differentiation and trophoblastic proliferation // J. Med. Genet. 2014. V.51(9). P. 623-634.