Результат интеллектуальной деятельности: Способ прогнозирования пятилетней безметастатической выживаемости у больных раком молочной железы на основе экспрессии генов белков YKL-39 и CCL18

Изобретение относится к области медицины, конкретно к онкологии, и может быть использовано для прогнозирования пятилетней безрецидивной выживаемости при раке молочной железы.

Одним из актуальных вопросов современной онкологии является проблема прогнозирования течения злокачественных новообразований с целью предсказания развития разных форм прогрессии заболевания и проведения коррекции противоопухолевой терапии. Важным направлением в исследованиях является поиск новых более информативных маркеров, а также выявление новых комбинаций уже установленных показателей, позволяющих существенно повысить точность и сроки предсказания.

При раке молочной железы одним из факторов, определяющих вероятность отдаленного метастазирования, является взаимодействие опухоли с компонентами микроокружения [3, 4, 5, 6, 8]. При этом одним из ключевых компонентов микроокружения выступают опухоль-ассоциированные макрофаги, которые могут, как способствовать, так и препятствовать формированию гематогенных метастазов. Такая возможность определяется различными поверхностными и секретируемыми белками, характерными для разных субпопуляций макрофагов [7, 9, 10].

Одним из таких белков является YKL-39 - хитиназоподобный протеин макрофагов, относящийся к новому классу внеклеточных медиаторов, которые сочетают в себе свойства цитокинов и факторов роста. Уже известно, что большая часть YKL-39 локализуется не в цитоплазматических везикулах, а в ядерных гранулах, это обстоятельство позволяет предположить не только внеклеточную роль YKL-39 как белка, секретируемого макрофагами, но и его регуляторную функцию для «программирования» самих макрофагов. Изменение уровня хитиназоподобных белков в тканях и в кровотоке является ценным диагностическим критерием для мониторинга разных типов активации иммунной системы при различных заболеваниях, в том числе при развитии злокачественных новообразований [11, 14].

Белок CCL18 представляет собой хемокин, продуцируемый M2-субпопуляцией макрофагов [Kodelja et al., 1998)]. Белок CCL18 осуществляет привлечение в очаг воспаления наивных Т-клеток, [11] Т-регуляторных клеток, [7] [12] Т-хелперных клеток 2, [13], дендритных клеток, [7] [10] базофилов [13] и В-клеток [wiki]. Гиперпродукция CCL18 в макрофагах M2 показана при различных заболеваниях, ассоциированных с хроническим воспалением [Martinez et al., 2009]. Кроме того, конститутивная экспрессия CCL18 наблюдается в макрофагах, инфильтрирующих опухоль яичников, желудка и глиому [Chang et al., 2010; Leung et al., 2004; Schutyser et al., 2002; Zohny and Fayed, 2010].

Наиболее близким к предлагаемому выбранный за прототип является способ прогнозирования риска лимфогенного метастазирования при раке молочной железы на основе экспрессии гена белка YKL-39 (патент РФ №2632115 опубликован 02.10.2017), включающий исследование препаратов ткани новообразований и последующий расчет диагностических показателей, при этом, проводят молекулярно-генетическое исследование биопсийных образцов опухолевой ткани, которые берут у пациенток под контролем ультразвукового метода исследования до проведения неоадъювантной химиотерапии, выделяют РНК и определяют уровень гена, экспрессируемого макрофагами с помощью количественной обратно-транскриптазной полимеразной цепной реакции в режиме реального времени RT-qPCR, определяют уровень экспрессии YKL-39 по технологии TaqMan с помощью специфичных праймеров и пробы Sense 5'-aacaacaaggttatcatcaaggac-3', AntiSense 5'-tttgggattcttggttttgag-3', Probe FAM-5'-agtgaagtgatgctctaccagaccat-3'-BHQ1, далее проводят ПЦР-анализ экспрессии гена белка YKL-39, оценивают относительную экспрессию гена белка YKL-39 с помощью метода Pfaffl в условных единицах (УЕ) относительно гена рефери GAPDH, при этом, в качестве калибратора используют нормальную ткань молочной железы, в которой при проведении исследования аналогичным выше описанному способом уровень экспрессии гена белка YKL-39 составляет 1, и при уровне экспрессии YKL-39 более 1 УЕ прогнозируют низкий риск развития лимфогенных метастазов, а при уровне экспрессии гена белка YKL-39 менее 1 УЕ - высокий риск лимфогенного метастазирования. Однако, область применения известного способа ограничена, ввиду того, что прогноз возможно осуществить на недостаточно длительный срок.

Новый технический результат – расширение области применения способа за счет использования дополнительного маркера и определения числовых значений комбинации маркеров, позволяющих прогнозировать течение заболевания и оценить пятилетнюю безметастатическую выживаемость пациентов.

Для достижения нового технического результата в способе прогнозирования пятилетней безметастатической выживаемости у больных раком молочной железы на основе экспрессии генов белков YKL-39 и CCL18, включающем проведение молекулярно-генетического исследования биопсийных образцов опухолевой ткани, которые берут у пациенток под контролем ультразвукового метода исследования до проведения неоадъювантной химиотерапии, выделение РНК и определение уровня транскрипции гена, экспрессируемого макрофагами с помощью количественной обратно-транскриптазной полимеразной цепной реакции в режиме реального времени RT-qPRC, определение уровня экспрессии гена YKL-39 по технологии TaqMan с помощью специфических праймеров и проб Sense 5'- aacaacaaggttatcatcaaggac -3'. Antisense 5'- tttgggattcttggttttgag -3, ПЦР-анализ экспрессии генов белка, оценку относительной экспрессии генов YKL-39 с помощью метода Pfaff1 в условных единицах (УЕ) относительно гена рефери GAPDH, при этом, в качестве калибратора используют нормальную ткань молочной железы, в которой при проведении исследования аналогичным выше описанному способу уровень экспрессии генов YKL-39 составляет 1, причем, дополнительно и одновременно определяют уровень экспрессии гена CCL18 по технологии TaqMan с помощью специфических праймеров и проб Sense 5'- ccaagccaggtgtcatcct-3' Antisense 5'- cttcaggtcgctgatgtatttct -3', далее, проводят ПЦР-анализ экспрессии генов белка CCL18, оценивают относительную экспрессию генов CCL18 с помощью метода Pfaff1 в условных единицах (УЕ) относительно гена рефери GAPDH, в качестве калибратора также используют нормальную ткань молочной железы, в которой при проведении исследования аналогичным выше описанному способу уровень экспрессии генов CCL18 составляет 1 и при уровне экспрессии YKL-39 и CCL18 в биопсийных образцах ткани опухоли у больных раком молочной железы более 1 УЕ при комбинации генов YKL-39⁺CCL18⁺ прогнозируют 100% пятилетнюю безметастатическую выживаемость, в случае других комбинаций экспрессии генов: YKL-39⁺CCL18⁻, YKL-39⁻CCL18⁺, YKL-39⁻CCL18⁻ прогнозируют риск возникновения гематогенных метастазов в 85%, 71% и 69% случаев, соответственно

Способ осуществляют следующим образом.

Для молекулярно-генетических исследований используют биопсийные образцы опухолевой ткани (~10 мм³), которые берут у пациенток под контролем ультразвукового метода исследования до проведения неоадъювантной химиотерапии. Образцы ткани опухоли помещают в раствор RNALater (Ambion, USA) и сохраняют при температуре 80ºС (после 24х-часовой инкубации при температуре +4ºС) для дальнейшего выделения РНК и ДНК.

РНК из взятых биопсийных образцов опухолевой ткани выделяют с помощью набора RNeasy Plus mini Kit, содержащего ДНК-азу I (Qiagen, Germany, # 74134). На спектрофотометре NanoDrop-2000 (Thermo Scientific, USA) оценивают концентрацию и чистоту выделения РНК. Целостность РНК оценивают при помощи капиллярного электрофореза на приборе TapeStation (Agilent Technologies, USA) и набора R6K ScreenTape (Agilent Technologies, USA # 5067-5367). С полученной РНК осуществляют синтез ДНК. Уровень экспрессии гена белка YKL-39 оценивают при помощи количественной обратно-транскриптазной полимеразной цепной реакции (ПЦР) в режиме реального времени (RT-qPCR) по технологии TaqMan на амплификаторе RotorGene-6000 (Corbett Research, Australia). С полученной ДНК проводят ПЦР-анализ экспрессии генов белков YKL-39 и CCL18. Относительную экспрессию гена белка YKL-39 и CCL18 оценивают с помощью метода Pfaffl в условных единицах (УЕ) относительно гена рефери GAPDH. В качестве калибратора используют нормальную ткань молочной железы, в которой уровень экспрессии гена белка YKL-39 и CCL18 составляет 1.

Уровень экспрессии YKL-39 и CCL18 в биопсийных образцах ткани опухоли у больных раком молочной железы более 1 УЕ при комбинации экспрессии генов YKL-39⁺CCL18⁺ рассматривают как гиперэкспрессию и прогнозируют 100% пятилетнюю безметастатическую выживаемость. В случае других комбинаций экспрессии генов YKL-39 и CCL18 - YKL-39⁺CCL18⁻, YKL-39⁻CCL18⁺, YKL-39⁻CCL18⁻ - прогнозируют риск возникновения гематогенных метастазов в 85%, 71% и 69% случаев, соответственно.

Сущность предлагаемого способа иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1

Больная С., 57 лет, диагностирован рак молочной железы слева, инвазивная карцинома неспецифического типа, Т2N1М0 люминального В молекулярного подтипа, экспрессия рецепторов HER2 отрицательная. В предоперационном периоде получила 4 курса химиотерапии по схеме FAC с эффектом - 70% уменьшения размера опухоли - частичная регрессия, проведена органосохранная операция (секторальная резекция). В послеоперационном периоде получала 2 курса химиотерапии по схеме FAC и гормональную терапию тамоксифеном. Уровень экспрессии  в опухолевой ткани молочной железы до лечения YKL39 составил 3.17, CCL18 – 2.34 классифицирована как YKL39+CCL18+ больная - отслеженная безметастатическая выживаемость 60 месяцев с момента окончания лечения(100%).

Пример 2

Больная Б., 42 года, диагностирован рак молочной железы справа, инвазивная карцинома неспецифического типа, Т2N0М0 люминального В молекулярного подтипа, экспрессия рецепторов HER2 отрицательная. В предоперационном периоде получила 4 курса химиотерапии по схеме FAC с эффектом - 35% уменьшение размера опухоли - стабилизация, проведена операция (секторальная резекция). В послеоперационном периоде получала 2 курса химиотерапии по схеме FAC и гормональную терапию ингибиторами ароматазы. Уровень экспрессии  в опухолевой ткани молочной железы до лечения YKL39 составил 1.63, CCL18 – 0.48 классифицирована как YKL39+CCL18- больная – через 20 месяцев с момента окончания лечения развились метастазы в легких и средостении(85%).

Пример 3

Больная Б., 43 года, диагностирован рак молочной железы слева, инвазивная карцинома неспецифического типа, Т2N1М0 люминального В молекулярного подтипа, экспрессия рецепторов HER2 отрицательная. В предоперационном периоде получила 4 курса химиотерапии по схеме FAC с эффектом - 48% уменьшение размера опухоли - стабилизация, проведена операция (радикальная резекция). В послеоперационном периоде получала 2 курса химиотерапии по схеме FAC и гормональную терапию ингибиторами ароматазы. Уровень экспрессии  в опухолевой ткани молочной железы до лечения YKL39 составил 0, CCL18 – 7.12 классифицирована как YKL39-CCL18+ больная – через 18 месяцев с момента окончания лечения развились метастазы в легких и головном мозге(71%).

Пример 4

Больная Н., 47лет, диагностирован рак молочной железы справа, инвазивная карцинома неспецифического типа, Т2N0М0 люминального В молекулярного подтипа, экспрессия рецепторов HER2 отрицательная. В предоперационном периоде получила 4 курса монотерапии таксотером с эффектом - 84% уменьшение размера опухоли – частичная регрессия, проведена операция (секторальная резекция). В послеоперационном периоде получала 2 курса химиотерапии по схеме FAC и гормональную терапию тамоксифеном.

Уровень экспрессии  в опухолевой ткани молочной железы до лечения YKL39 составил 0, CCL18 – 0.40 классифицирована как YKL39-CCL18- больная – через 37 месяцев с момента окончания лечения развились множественные метастазы в легких, костях и печени(69%).

Предлагаемый способ основан на анализе данных морфологического и молекулярно-генетического методов исследования биопсийного и операционного материала, анализе амбулаторных карт и медицинских карт стационарного больного.

Изучался биопсийный материал от 96 больных инвазивной карциномой молочной железы неспецифического типа с морфологически верифицированным диагнозом и клинической стадией IIa – IIIb (T1-4N0-3M0), в возрасте 26-68 лет (средний возраст 48,21 ± 0,68 лет), получавших лечение в клиниках НИИ онкологии Томского НИМЦ (г. Томск, Россия). Исследование проходило в соответствии с Хельсинкской Декларацией 1964 г. (исправленной в 1975 и 1983 гг.) и с разрешения локального этического комитета института, все пациенты подписали информированное согласие на исследование. Больные в соответствии с «Consensus Conference on Neoadjuvant Chemotherapy in Carcinoma of the Breast, April 26 – 28, 2003, Philadelphia, Pennsylvania» [Schwartz G.F., et al., 2004] в неоадъювантном режиме получали 2-4 курса антрациклин-содержащие схемы: FAC (5-фторурацил 600 мг/м2, адриамицин 50 мг/м2 и циклофосфамид 600 мг/м2 один раз в 3 недели), CAX (циклофосфамид 100 мг/м2 внутримышечно, адриамицин 30 мг/м2 внутривенно, кселода 1200 мг/м2 перорально), или монотерапия таксотером (100 мг/м2 часовая инфузия в день), CMX (циклофосфамид 100 мг/м2 внутримышечно, метотрексат 30 мг/м2 внутривенно, кселода 1200 мг/м2 перорально), CP (циклофосфамид – 750 мг/м2 и цисплатин 75 мг/м2 внутривенно 1 раз в 3 недели). Больным через 3-5 недель после НAХТ проводили операцию в объеме радикальной или подкожной мастэктомии, радикальной резекции, секторальной резекции с аксиллярной лимфаденэктомией или другого вида органосохранную операцию, затем больным проводили 2 курса адъювантной химиотерапии по схеме FAC, лучевая терапия и/или гормональное лечение назначались по показаниям.

Для морфологического исследования в течение первого часа после выполнения оперативного вмешательства в операционном материале осуществляли взятие образцов опухолевой ткани. Производили вырезку фрагментов ткани новообразования размером 1х0,5х0,5 см. Материал фиксировали в 10-12% растворе рН-нейтрального формалина. Проводку материала и изготовление гистологических препаратов осуществляли по стандартной методике. Препараты окрашивали гематоксилином и эозином. Проводили верификацию диагноза, гистологический тип опухоли молочной железы устанавливали согласно рекомендациям ВОЗ (Женева, 2012 г.). Среди гистологических типов рака молочной железы в исследование были включены инвазивная карцинома неспецифического типа, инвазивный дольковый рак, медуллярный рак, а также другие редкие типы опухоли. В каждом случаев лимфатических узлах определяли наличие метастатического поражения, а также подсчитывали количество лимфоузлов, пораженных метастазами.

Для молекулярно-генетических исследований были использованы биопсийные образцы опухолевой ткани (~10 мм³), которые были взяты у пациенток под контролем ультразвукового метода исследования до проведения неоадъювантной химиотерапии (НАХТ). Образцы ткани опухоли помещали в раствор RNALater (Ambion, USA) и сохраняли при температуре 80ºС(после 24х-часовой инкубации при температуре +4ºС) для дальнейшего выделения РНК и ДНК.

РНК из взятых биопсийных образцов опухолевой ткани выделяли с помощью набора RNeasy Plus mini Kit, содержащего ДНК-азу I (Qiagen, Germany, # 74134). На спектрофотометре NanoDrop-2000 (Thermo Scientific, USA) оценивали концентрацию и чистоту выделения РНК. Концентрация РНК составляла от 80 до 250 нг/мкл, А₂₆₀/А₂₈₀ = 1,95-2,05; А₂₆₀/А₂₃₀ = 1,90-2,31. Целостность РНК оценивали при помощи капиллярного электрофореза на приборе TapeStation (Agilent Technologies, USA) и набора R6K ScreenTape (Agilent Technologies, USA # 5067-5367). RIN составил 5,6-7,8. С полученной РНК осуществляли синтез ДНК. Уровень экспрессии генов белков YKL-39 и CCL18 оценивали при помощи количественной обратно-транскриптазной полимеразной цепной реакции (ПЦР) в режиме реального времени (RT-qPCR) по технологии TaqMan на амплификаторе RotorGene-6000 (Corbett Research, Australia). С полученной ДНК проводили ПЦР-анализ экспрессии генов белков YKL-39 и CCL18. Относительная экспрессия гена белка YKL-39 оценивалась с помощью метода Pfaffl в условных единицах (УЕ) относительно гена рефери GAPDH. В качестве калибратора использовали нормальную ткань молочной железы, взятую от 10 пациенток, у которых при морфологическом исследовании материала каких-либо патологических изменений обнаружено не было. Исследование уровня экспрессии генов белков YKL-39 и CCL18 в данных образцах нормальной ткани молочной железы было проведено аналогичным выше описанному способом. При этом уровень экспрессии генов белков YKL-39 и CCL18 в образцах нормальной ткани молочной железы составил 1. У 10 больных с YKL39⁺CCL18⁺ макрофагальным фенотипом отмечалась 100% безметастатическая выживаемость. При YKL39⁺CCL18⁻ фенотипе гематогенные метастазы в 5-ти летнем периоде отмечались у 3/20 больных (85% безметастатическая выживаемость). Два макрофагальных фенотипа показали наиболее низкую 5-ти летнюю безметастатическую выживаемость. Гематогенные метастазы при YKL39⁻CCL18⁺ фенотипе развились у 7/24 больных (71% безметастатическая выживаемость) при YKL39⁻CCL18⁻ фенотипе метастазы отмечались у 13/42 больных (69% безметастатическая выживаемость). Статистическая значимость по безметастатической выживаемости достигалась между больными с YKL39⁺CCL18⁺ и YKL39⁻CCL18⁺ или YKL39⁻CCL18⁻ фенотипами.

Анализ результатов исследований позволил сделать следующие выводы: наиболее благоприятным в прогностическом плане является YKL39⁺CCL18⁺ макрофагальный фенотип опухоли, при котором достигалась 100% выживаемость. Неблагоприятными в прогностическом плане являются YKL39⁻CCL18⁺ и YKL39⁻CCL18⁻ макрофагальные фенотипы опухоли, YKL39⁺ССL18⁻ больные имели промежуточный риск метастазирования (на Фиг. 1 представлена связь макрофагального фенотипа опухоли до лечения с безметастатической выживаемостью больных раком молочной железы).

Статистическую обработку полученных результатов выполняли с помощью пакета программ «STATISTICA 8.0» (StatSoft Inc., США) с применением метода Каплан-Майера, критерия Фишера. Сравнение достоверности различий между группами производили с помощью log-rank теста.

Таким образом, при исследовании показателей прогноза у пациенток больных раком молочной железы в зависимости от уровня экспрессии генов белков YKL-39 и CCL18 в опухолевой ткани были получены следующие результаты. Пациентки с гиперэкспрессией генов YKL-39 и CCL18 демонстрировали 100% безметатстатическую выживаемость на протяжении пятилетнего наблюдения. В то время как гипоэкспрессия хотя бы одного показателя из двух или обоих одновременно ассоциирована с существенным снижением показателя выживаемости и, следовательно, с неблагоприятным прогнозом клинического течения заболевания.

Источники информации

1. Осинский С.П. Микроокружение опухолевых клеток и опухолевая прогрессия. Факторы стромального микроокружения / С.П. Осинский // Онкология. Здоровье Украины. - Червень. - 2013. – Тематический номер. – С. 36-39.

2. Sleeman J.P. Concept of metastasis in flux: the stromal progression model / J.P. Sleeman, G. Christofori, R. Fodde [et al.] // Seminar in Cancer Biology. – 2012. – Vol. 22. – P. 174-186.

Smith3. H.A. The metastasis-promoting roles of tumor-associated immune cells / H. A. Smith, Y. Kang // J. Mol. Med. (Berl). – 2013. – Vol. 91(4). - P. 411–429.

4. Quail D.F. Microenvironmental regulation of tumor progression and metastasis / D.F. Quail, J.A. Joyce // Nat. Med. – 2013. – Vol. 19(11). – P. 1423-1437.

Mao5. Y. Stromal cells in tumor microenvironment and breast cancer / Y. Mao, E.T. Keller, D.H. Garfield et al. // Cancer Metastasis Rev. – 2013. – Vol. 32(1-2). – P. 303-315.

6. Kerkar S. P. Cellular Constituents of Immune Escape within the Tumor Microenvironment / S.P. Kerkar, N.P. Restifo // Cancer Research Reviews. – 2012. – Vol. 72(13). – P. 3125-3130.

7. Finger E.C. Hypoxia, inflammation, and the tumor microenvironment in metastatic disease / E.C. Finger, A.J. Giaccia // Cancer metastasis reviews. – 2010. – Vol. 29. - P. 285–293.

8. Galli S.J. Phenotypic and functional plasticity of cells of innate immunity: macrophages, mast cells and neutrophils / S.J. Galli, N. Borregaard, T.A. Wynn // Nature immunology. – 2011. – Vol. 12. – P. 1035-1044.

9. Holness C.L. Molecular cloning of CD68, a human macrophage marker related to lysosomal glycoproteins / Holness C.L., Simmons D.L. // Blood. – 1993. – Vol. 81, N. 6. – P.1607–13.

10. Kodelja V. Alternative macrophage activation-associated CC-chemokine-1, a novel structural homologue of macrophage inflammatory protein-1 alpha with a Th2-associated expression pattern / Kodelja V., Müller C., Politz O. et al. // J Immunol. – 1998. – Vol.160(3). – P.1411-8.

11. Bellinghausen I. Enhanced production of CCL18 by tolerogenic dendritic cells is associated with inhibition of allergic airway reactivity / Bellinghausen I., Reuter S., Martin H. et al. // J. Allergy Clin. Immunol. – 2012. – Vol. 130, N. 6. – P. 1384–93.

12. Vulcano M. Unique regulation of CCL18 production by maturing dendritic cells / Vulcano M., Struyf S., Scapini P. et al. // J. Immunol. – 2003. – Vol. 170, N. 7. – P. 3843–9.

13. Adema G.J. A dendritic-cell-derived C-C chemokine that preferentially attracts naive T cells / Adema G.J., Hartgers F., Verstraten R. // Nature. – 1997. – Vol. 387, N. 6634. – P. 713–7.

14. Chenivesse C. Pulmonary CCL18 recruits human regulatory T cells / Chenivesse C., Chang Y., Azzaoui I. et al. // J. Immunol. – 2012. – Vol. 189, N. 1. – P. 128–37.

15. de Nadaï P. Involvement of CCL18 in allergic asthma / de Nadaï P., Charbonnier A.S., Chenivesse C. et al. // J. Immunol. – 2006. – Vol. 176, N. 10. – P. 6286–93.

16. Martinez F.O. Alternative activation of macrophages: an immunologic functional perspective / Martinez F.O., Helming L., Gordon S. et al. // Annu. Rev. Immunol. – 2009. – Vol. 27. – P. 451–483.

17. Chang C.Y. CC-chemokine ligand 18/pulmonary activation-regulated chemokine expression in the CNS with special reference to traumatic brain injuries and neoplastic disorders / Chang C.Y., Lee Y.H., Leu S.J. et al. // Neuroscience. – 2010. – Vol. 165. – P.1233–1243.

18. Leung S.Y. Expression profiling identifies chemokine (C-C motif) ligand 18 as an independent prognostic indicator in gastric cancer / Leung S.Y., Yuen S.T., Chu K.M. et al. // Gastroenterology. – 2004. – Vol.127. – P. 457–469.

19. Schutyser E. Identification of biologically active chemokine isoforms from ascitic fluid and elevated levels of CCL18/pulmonary and activation-regulated chemokine in ovarian carcinoma. / Schutyser E., Struyf S., Proost P. et al. // J. Biol. Chem. –2002. – Vol. 277. – P. 24584–24593.

20. Zohny S.F. Clinical utility of circulating matrix metalloproteinase-7 (MMP-7), CC chemokine ligand 18 (CCL18) and CC chemokine ligand 11 (CCL11) as markers for diagnosis of epithelial ovarian cancer / Zohny S.F., Fayed S.T. // Med. Oncol. – 2010. Vol. 27. – P.1246–1253.

Schwartz G.F21. . Proceedings of the consensus conference on neoadjuvant chemotherapy in carcinoma of the breast / Schwartz G.F., Hortobagyi G.N., Masood S. // Hum Pathol. – 2004. – Vol.35., N.7 – P.781-4.