Результат интеллектуальной деятельности: Способ прогнозирования характера течения изолированной формы акантолитической пузырчатки полости рта

Изобретение относится к области медицины, а именно к дерматологии, стоматологии и клинической лабораторной диагностике, и может быть использовано для прогнозирования перехода у больного изолированной формы акантолитической пузырчатки полости рта в тяжелую форму заболевания.

Известен способ прогнозирования изменения клинической формы пузырчатки, включающий исследование профиля антигенов-мишеней в сыворотке крови больных методом иммунопреципитации [Western blot technique) (Kawana S., Hashimoto Т., Nishikawa Т., Nishiyama S. Change in clinical features, histologic findings, and antigen profiles with development of pemphigus foliaceus from pemphigus vulgaris // Arch. dermatol., 1994; 130: p. 1534-1538]. Недостатком этого способа является его низкая чувствительность и специфичность, что не позволяет с достаточной достоверностью прогнозировать возможности изменения клинических форм пузырчатки.

Известен способ прогнозирования возможности изменения клинической формы пузырчатки путем исследования сыворотки крови больного, которую наслаивают в разные субстраты и определяют профили антигенов-мишеней методом непрямой иммунофлюоресценции [Hashimoto Т., Amagai М., Garrod DR., Nishikawa Т. Immunofluorescence and immunoblot studies on the reactivity of pemphigus vulgaris and pemphigus foliaceus sera with desmoglein 3 and desmoglein 1 // Epithelial Cell Biol., 1995; 4: p. 63-69].

Недостатком этого способа является то, что точность прогноза недостаточна, поскольку не всегда можно определить профиль антигенов-мишеней из-за отсутствия циркулирующих аутоантител в сыворотке крови больных. Это связано как с чувствительностью используемых субстратов, так и со способностью антител сорбироваться в тканях больного и прочно связываться с антигенами-мишенями. Поэтому только в 60-70% случаев можно выявить аутоантитела, специфически направленные к определенным антигенам-мишеням.

Известен способ прогнозирования течения пузырчатки, включающий исследование биологической ткани [Carlotti A., Balaton A.J., de Muret A. et al. Autoimmune pemphigus. A distinct staining pattern with an anti-desmoglein antibody // Arch. Dermatol., 1993; 129(5): р. 596-9]. Исследуют парафиновые срезы биоптата с пораженного или интактного, около поврежденного участка кожи больного методом пероксидазной метки с использованием моноклональных антител к десмоглеину. При выявлении экспрессии десмоглеина в виде тонкой и равномерной сетки вдоль цитоплазматической мембраны кератиноцитов прогнозируют благоприятное течение пузырчатки, оставляя надежду на выздоровление. При наличии грубых гранулярных отложений десмоглеина - прогнозируют тяжелое течение пузырчатки с подбором индивидуальных поддерживающих доз глюкокортикостероидов. Недостатком этого способа является длительное время проведения исследования и возможность получить ложноположительные реакции, которые могут наблюдаться и при других заболеваниях, в основе которых лежит формирование пузырей (акантолитический дискератоз, болезнь Хейли-Хейли, буллезный пемфигоид, герпес, экзема и транзиторный акантолитический дерматоз). Наличие ложноположительных реакций снижает чувствительность и специфичность данного способа, что осложняет постановку точного прогноза течения пузырчатки, прогнозирование ее течения и проведение адекватной терапии в оптимально ранние сроки.

Известен способ прогнозирования течения пузырчатки исследованием клинически интактного участка кожи больного методом прямой иммунофлюоресценции [патент 2386400, 2010 г.]. Определяют место локализации фиксированного иммуноглобулина класса G. При локализации иммуноглобулинов класса G в межклеточной субстанции всех слоев эпидермиса прогнозируют возможность изменения формы пузырчатки, при наличии иммуноглобулинов класса G не во всех слоях - вероятность изменения клинической формы пузырчатки низкая. Недостатком этого способа является сложность проведения исследования (изучение на молекулярно-биологическом уровне морфологического строения и биохимического состава пораженного участка кожи).

Прототипом изобретения является способ оценки характера течения пузырчатки, включающий определение в сыворотке крови в момент обострения заболевания и через 2 недели после начала лечения содержания альфа-1 кислого гликопротеина. При уменьшении содержания альфа-1 кислого гликопротеина от 2,1-2,5 г/л до 1,6-1,8 г/л оценивают тяжелый характер течения пузырчатки. При уменьшении содержания альфа-1 кислого гликопротеина от 1,9-2 г/л до 1,4-1,55 г/л оценивают благоприятный характер течения пузырчатки [Патент РФ 2316006, МПК G01N 33/88, 2008 г.]. Недостатком этого способа является отсутствие его специфичности по отношению к пузырчатке. Пузырчатка является аутоиммунным буллезным дерматозом, протекающим на фоне патологии со стороны желудочно-кишечного тракта (холецистит, панкреатит, гастродуоденит) и/или сердечно-сосудистой системы (гипертоническая болезнь), нередко осложняющимся вторичной инфекцией из-за наличия открытых входных ворот (обширные эрозивные поверхности на коже и слизистых оболочках). Поэтому при сочетанной патологии нельзя дифференцировать острую фазу воспаления и, следовательно, поставить достоверный прогноз течения пузырчатки. Кроме этого, оценка характера течения пузырчатки проводится на момент обострения заболевания и исключает проведение исследования в межрецидивные периоды заболевания.

Технический результат - повышение точности прогноза за счет определения содержания цитокинов в естественной жидкости очага поражения (в ротовой жидкости).

Предлагаемый способ прогнозирования характера течения изолированной формы акантолитической аутоиммунной пузырчатки полости рта осуществляется следующим образом: у больного в ротовой жидкости определяют количественное содержание интерлейкина-6 (ИЛ-6), интерлейкина-1β (ИЛ-1β) и интерлейкина-4 (ИЛ-4) на 1-5 день лечения. Концентрацию ИЛ-6, ИЛ-1β и ИЛ-4 определяют по общепринятой методике с помощью набора реагентов ProCon IL-6, IL-1β и IL-4, предназначенного для количественного определения интерлейкинов в исследуемых образцах в соответствии с инструкциями производителей [Хаитов, P.M. Экологическая иммунология / P.M. Хаитов, Б.В. Пинегин, Х.И. Истамов. - М.: ВНИРО, 1995. - 220 с.]. При значении концентрации ИЛ-6 1,9 пг/мл и ниже, ИЛ-1β 87 пг/мл и ниже, а также ИЛ-4 46 пг/мл и выше прогнозируют вероятность трансформации в тяжелую форму заболевания.

В ходе проведенных нами исследований, ретроспективный анализ результатов иммунологического обследования 29 больных с изолированной формой акантолитической пузырчатки полости рта до лечения у пациентов без негативной динамики развития процесса и с последующей трансформацией процесса в тяжелый вариант течения (прогрессирование и диссеминация поражения) показал у последних достоверно более низкие показатели концентрации ИЛ-6 (1,9 пг/мл и ниже) и IL-1β (87 пг/мл и ниже) и более высокие показатели концентрации ИЛ-4 (46 пг/мл и выше) в ротовой жидкости. Данные результаты могут указывать на истощение способности иммунной системы больных пузырчаткой продуцировать провоспалительные цитокины (ИЛ-6 и IL-1β), что ведет к утяжелению хронического процесса и неблагоприятному течению, а также активации выработки иммуномедиатора ИЛ-4 (обеспечивающего течение гуморального иммунного ответа) при длительном воздействии антигенной стимуляции.

Результаты наших исследований подтвердили, что изменение содержания цитокинов непосредственно в очагах тканевого повреждения имеет место в патогенезе многих хронических заболеваний [Н.Е. Кушлинский с соавторами, Матриксные металлопротеиназы и воспалительные цитокины в ротовой жидкости больных хроническим генерализованным пародонтитом с различными конструкционными материалами, Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, 2012, Том 153, №1, с. 82-87,]. Поэтому мы считаем более целесообразным определять содержание цитокинов в естественных жидкостях очагов поражения (в частности, в ротовой жидкости при поражении полости рта у больных пузырчаткой), т.к. цитокины являются также и локальными медиаторами [М.А. Шур. Цитокины ротовой жидкости при хронической HCV-инфекции, Дальневосточный Журнал Инфекционной Патологии, №12, 2008, с. 192-193 г.].

Авторами в доступной научно-медицинской и патентной литературе не было обнаружено сведений об использовании определения содержания в ротовой полости ведущих цитокинов для прогнозирования характера течения изолированной формы акантолитической пузырчатки полости рта. Таким образом, заявляемое изобретение соответствует критерию патентоспособности «новизна».

Исследованиями авторов была впервые доказана возможность прогнозирования характера течения аутоиммунной акантолитической пузырчатки у больных с изолированной формой пузырчатки полости рта. Таким образом, заявляемое изобретение соответствует критерию «изобретательский уровень».

Предлагаемый способ прогнозирования иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Больной Н., 62 года, поступил на стационарное лечение в Республиканский кожно-венерологический диспансер с жалобами на боли при разговоре и приеме пищи и появление единичных элементов поражения на слизистой оболочке полости рта. Считает себя больным в течение 4х лет, находится на диспансерном учете у дерматолога по месту жительства. Всегда поражение отмечалось только в полости рта. Последнее обострение заболевание отметил 5 дней назад. Объективно при осмотре: слизистая оболочка полости рта и губ гиперемирована. На мягком небе, по переходной складке обнаружены две обширные болезненные эрозии, покрытые белесоватым налетом. На других слизистых и кожных покровах элементы не обнаружены, общее состояние не страдало. На основании анамнеза, клиники и результата лабораторного исследования (в мазках-отпечатках обнаружены акантолитические клетки) был выставлен диагноз: изолированная форма акантолитической пузырчатки полости рта. Было назначено лечение - ударная доза преднизолона (1 мг/кг/сут), антигистаминные препараты, на эрозии полости рта - водный раствор метиленовой сини 1%. На 5-й день лечения в ротовой жидкости пациента выявлено высокое содержание ИЛ-4, что составило 48 пг/мл, и низкие показатели ИЛ-6 и ИЛ-1β - 1,7 пг/мл и 86 пг/мл соответственно. На 7-й день в полости рта появились новые пузыри с вялой дряблой покрышкой, которые быстро вскрывались и распространялись по всей полости рта. Объективно при осмотре - на слизистой полости рта (внутренняя сторона губ, мягкое небо, щеки) имелись эрозии, сливающиеся между собой, покрытые желтовато-бурыми корками. Несмотря на терапию стероидами, болезненные эрозии не заживали, появился неприятный запах изо рта. Было принято решение - увеличить дозу системного стероида. На 10-й день лечения появились пузыри и эрозии с геморрагическими корками на красной кайме губ, в подмышечных впадинах и на коже грудной клетки. Симптом Никольского был положительным. Больной отмечал общую слабость. Было принято решение консилиумом врачей назначить курс сочетанной терапии преднизолона в дозе 60 мг/сутки перорально в сочетании с парентеральным введением метотрексата по 25-50 мг 1 р/неделю, что позволило добиться положительной динамики (новые элементы не появлялись, старые - эпителизировались). К 28 дню лечения у больного наблюдалась устойчивая тенденция к эпителизации всех элементов, формирование гиперпигментированных пятен на месте прежних эрозий на коже.

Пример 2. Больная А., 52 года, поступила на стационарное лечение в Республиканский кожно-венерологический диспансер с жалобами на резкую болезненность при глотании, болезненные элементы в полости рта. Поражение полости рта появилось впервые 20 дней назад, в течение которых безуспешно лечилась у стоматологов. Объективно при осмотре: на слизистой губ и щек имеются болезненные эрозии. На других слизистых и кожных покровах элементы не обнаружены, общее состояние не страдало. На основании клиники и лабораторного исследования (в мазках-отпечатках обнаружены акантолитические клетки) был выставлен диагноз: изолированная форма акантолитической пузырчатки полости рта. Было назначено лечение - ударная доза преднизолона (1 мг/кг/сут), антигистаминные препараты, на эрозии полости рта - водный раствор метиленовой сини 1%. При поступлении и последующие два дня в ротовой жидкости у пациентки содержание ИЛ-4 составило 40 пг/мл, ИЛ-6 - 2,4 пг/мл и ИЛ-1β - 92 пг/мл. В процессе лечения отмечалось обратное развитие проявлений на слизистой полости рта (эпителизация эрозий). К моменту выписки из стационара (28-й день лечения) - все эрозии заэпителизировались, а содержание в ротовой жидкости вышеназванных цитокинов оставалось прежним.

Как видно из приведенных примеров, результаты определения в ротовой жидкости больных с изолированной формой акантолитической пузырчатки полости рта количественного содержания ИЛ-4, ИЛ-6 и ИЛ-1β позволяют прогнозировать вероятность перехода в тяжелую форму заболевания.

Предлагаемым способом была проведена оценка вероятности возникновения тяжелого течения у 29 больных с изолированной формой акантолитической пузырчатки полости рта, и во всех случаях достигнут указанный технический результат. Способ легко воспроизводим в условиях лаборатории стационара. Таким образом, заявляемое изобретение соответствует критерию патентоспособности «промышленная применимость».