Результат интеллектуальной деятельности: Способ определения 1-гидроксипирена в моче методом хромато-масс-спектрометрического анализа

Изобретение относится к области аналитической токсикологии и биологического мониторинга, и может быть использовано при оценке воздействия полициклических ароматических углеводородов (ПАУ) на организм человека. В подавляющем случае ПАУ присутствуют в виде смесей, одним из основных компонентов по уровню концентрации является пирен. Метаболит пирена - 1-гидроксипирен (Фиг. 1) является стабильным соединением, относительно легко и надежно определяемым в моче.

Известный способ определения 1-гидроксипирена в моче методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) включает в себя предварительный ферментативный гидролиз β-глюкуронидазой при 37°С 16 ч, твердофазную экстракцию на картридже С₁₈, анализ метанольного экстракта методом ВЭЖХ с флуориметрическим детектором. Предел обнаружения 0,1 нг/см³, нижний предел количественного определения 2 нг/см³ при объеме пробы 10 см³, относительное стандартное отклонение воспроизводимости (RSD) 12,6%, коэффициент корреляции градуировочного графика 0,990, правильность (R) 88±9%. [Jongeneelen F.J., Anzion R.B.M., Henderson Р.Т. Determination of hydroxylated metabolites of polycyclic aromatic hydrocarbons in urine // J. of Chromatography. 1987. V. 413. P. 227-232]. К недостаткам данного способа можно отнести большой объем пробы, длительность процедуры ферментативного гидролиза (16 ч) и ВЭЖХ анализа (50 мин), недостаточная чувствительность для определения концентрации 1-гидроксипирена в моче у населения, а также невысокая точность (RSD 12% и R=88%).

При использовании метода ВЭЖХ возникают проблемы из-за ошибок при идентификации зарегистрированных компонентов. Количественное определение их также может быть затруднено вследствие наложения или неполного разделения хроматографических пиков.

Другим подходящим способом (прототип) является определение 1-гидроксипирена в моче газовой хроматографией с масс-селективным детектированием (ГХ-МС) в режиме электронного удара.

Способ включает в себя следующие стадии: ферментативный гидролиз β-глюкуронидазой при 37°С 17-18 ч, твердофазную экстракцию, упаривание экстракта в токе азота, дериватизацию сухого остатка силилирующим реагентом N,O-бис-(триметилсилил) трифторацетамид (БСТФА) при температуре 60°С 40 мин, ГХ-МС анализ в течение 40 мин. Предел обнаружения 0,5 нг/см³, нижний предел количественного определения 1 нг/см³ при объеме пробы 3 см³, относительное стандартное отклонение воспроизводимости (RSD) 6,7-13,1%, коэффициент корреляции градуировочного графика 0,995, правильность (R) 88,7%. [С.Schummer, О. Delhomme, B.M.R. Appenzeller. Comparison of MTBSTFA and BSTFA in derivatization reaction of polar compounds prior to GC/MS analysis / Talanta 2009. - V. 77. P. 1473-1482].

Технической задачей предлагаемого способа является повышение точности определения методом ГХ-МС за счет использования изотопно-меченного стандарта 1-гидроксипирена-d9, повышение чувствительности определения за счет увеличения степени экстракции из биологической матрицы, а также значительное сокращение времени пробоподготовки за счет уменьшения продолжительности ее следующих стадий: ферментативного гидролиза, дериватизации 1-гидроксипирена силилирующим реагентом N,O-бис-(триметилсилил) трифторацетамид (БСТФА) (Фиг. 2), ГХ-МС анализа.

Указанная техническая задача достигается путем внесения в анализируемые пробы мочи изотопно-меченного стандарта 1-гидроксипирена-d9, проведения ферментативного гидролиза в течение 1 часа при 55°С, 2-х кратной жидкостно-жидкостной экстракции гексаном, упаривания гексанового экстракта досуха в токе азота, силилирования сухого остатка N,O-бис-(триметилсилил) трифторацетамидом (БСТФА) при температуре 22-25°С в течение 5 мин и проведении газохроматографического анализа на капиллярной колонке с масс-селективным детектированием в течение 20 мин.

Из патентной и научно-технической литературы нам неизвестны способы количественного определения 1-гидроксипирена в моче, содержащие совокупность предложенных нами признаков, что позволяет сделать вывод о новизне заявляемого технического решения.

Кроме того, из существующего уровня техники нам неизвестно использование существенных признаков, характеризующих предлагаемый способ, для достижения описываемого технического результата.

Способ осуществляют следующим образом:

К 2 см³ мочи в центрифужной пробирке вместимостью 10 см³ вносят 20 мм³ раствора 1-гидроксипирена-d9 в ацетонитриле (5 мкг/см³), 1 см³ ацетатно-уксусного буфера с рН=5, 20 мм³ водного раствора β-глюкуронидазы (активность >85000), нагревают 1 ч при 55°С, затем охлаждают 20 мин до температуры 20-25°С, добавляют 0,5 г сульфата магния, 2 см³ гексана и интенсивно встряхивают на мультивортексе 2 мин, после этого разделяют фазы на центрифуге при 4000 об/мин 10 мин, отделяют гексановый экстракт, перенося его во флакон вместимостью 5 см³ с коническим дном, снова вносят 2 см³ гексана, интенсивно встряхивают на мультивортексе 2 мин, разделяют фазы на центрифуге при 4000 об/мин 10 мин, отделяют гексановый экстракт, объединяя с первым экстрактом. Объединенный гексановый экстракт упаривают досуха в небольшом токе азота при температуре водяной бани 60°С, затем к сухому остатку вносят 100 мм³ реагента БСТФА и выдерживают 5 мин.

Основное же преимущество метода ГХ-МС по сравнению с ВЭЖХ - это более лучшее разделение компонентов и возможность применения изотопно-меченного стандарта 1 -гидроксипирен-d9 (дейтерированный стандарт).

Хромато-масс-спектрометрический анализ осуществляют в следующих условиях (табл. 1).

Идентификацию на хроматограммах 1-гидроксипирена и 1-гидроксипирена-d9 в виде производных (триметилсиланов) проводят по времени удерживания и соотношению интенсивностей регистрируемых ионов (таблица 2).

Количественное определение по предлагаемому способу проводят методом внутреннего стандарта по растворам известной концентрации 1-гидроксипирена в моче от 0,1 до 100 нг/см³, предварительно обработанным аналогично анализируемым пробам. При градуировке процедуру ферментативного гидролиза допускается не проводить.

При реакции силилирования 1-гидроксипирена реагентом БСТФА, содержащим 1% триметилхлорсилана, установлено, что температура и время реакции не оказывают значимого влияния на аналитический сигнал, особенно если в качестве аналитического сигнала выступает относительная площадь (высота) пика (табл. 3).

Данные показывают, что силилирование достаточно проводить при комнатной температуре 20-25°С в течение 5 мин и с внутренним стандартом, так как величина RSD самая минимальная.

Экспериментальным путем установлено, что при твердофазной экстракции (ТФЭ) степень экстракции 1-гидроксипирена из мочи составляет 8%, а при жидкостно-жидкостной экстракции (ЖЖЭ) гексаном около 90% (табл. 4).

Несмотря на то, что ТФЭ более современный способ, чем ЖЖЭ, степень извлечения аналита данным способом очень низкая. Это объясняется не тем, что аналит плохо адсорбируется на сорбент C₁₈ и/или плохо элюируется с него метанолом, а тем, что в образце мочи присутствует большое количество полярных соединений, содержащие в своем составе ОН, СООН, NH, NH₂ группы, и гораздо в больших концентрациях, чем наш аналит. Эти компоненты оказывают мешающее влияние при силилировании 1-гидроксипирена реагентом БСТФА. Получается, что реакцию силилирования вступает очень малое количество 1-гидроксипирена. При ЖЖЭ гексаном извлекаются в основном соединения неполярной или малополярной природы, которые не оказывают мешающее влияние при дериватизации БСТФА. Поэтому, подходящим способом извлечения 1-гидроксипирена из биологической матрицы является 2-х кратная ЖЖЭ гексаном.

Основными факторами, влияющими на эффективность жидкостно-жидкостной экстракции являются тип экстрагента, продолжительность экстракции, число экстракций, природа и количество высаливающего агента. Опытным путем установлено, что гексан, является более удобным экстрагентом чем, диэтиловый эфир и толуол, так как меньше мешающих влияний при дериватизации. В качестве высаливающего агента подходит сульфат магния, чем сульфат натрия, так как выше процент извлечения аналита. Оптимальные условия проведения ЖЖЭ 1-гидрокиспирена из мочи сводятся к следующим: масса сульфата магния 0,5 г, время экстракции 1-2 мин, кратность экстракции 2.

В таблице 5 приведены результаты анализа реальных образцов мочи работников алюминиевого производства, при двух вариантах ферментативного гидролиза.

Сравнивая два варианта ферментативного гидролиза, видно, что концентрации 1-гидроксипирена не сильно различаются, при втором варианте концентрации аналита даже выше, поэтому ферментативный гидролиз β-глюкуронидазой лучше проводить при температуре 55°С в течение 60 мин (1 ч).

Установлены валидационные характеристики: предел обнаружения, предел количественного определения, линейный диапазон, повторяемость, внутрилабораторная прецизионность, правильность, матричный эффект, селективность.

Предел обнаружения и предел количественного определения составили 0,02 и 0,1 нг/см³ соответственно. Линейный диапазон установили по 6 модельным образцам мочи с разными концентрациями 1-гидроксипирена (0.1, 2, 10, 20, 40, 100 нг/см³), коэффициент корреляции r>0.999. Приемлемый критерий для r не ниже 0,990. Таким образом, линейный диапазон составил от 0,1 до 100 нг/см³. Прецизионность и точность оценивали для 4 образцов мочи с веденными концентрациями 0,5; 2; 20 и 40 нг/см³, каждый образец анализировали 2 раза 5 дней. По результатам анализа рассчитали относительное стандартное отклонение (RSD, %) повторяемости и внутрилабораторной прецизионности, точность как отношение значения найденной концентрации к значению веденной концентрации (табл. 6).

Все значения правильности, лежащие в диапазоне от 96,5 до 102% от номинальной концентрации анализируемого вещества, соответствовали приемлемому критерию (100±7%). Повторяемость (RSD, %) лежит в интервале 1.0-4.4% и внутрилабораторная прецизионность (RSD, %) 6.0-6.4%, также в соответствии с приемлемыми критериями (не выше 12%). Введенные концентрации перекрываются с доверительными интервалами найденных концентраций.

Матричный эффект оценивали в виде относительного смещения В_МЕ, сравнивая относительные сигналы аналита введенного в органический растворитель (A_s) определенного количества и того же количества веденного в образец мочи (A_m) (табл. 10). Расчет осуществляли по следующей формуле (2)

Максимальный матричный эффект составляет 3,9% и не превышает приемлемый критерий 6%.

На рисунке (фиг. 3) приведены масс-хроматограммы холостого образца и 3-х образцов с разными концентрациями 1-гидроксипирена (0.1, 0.5, 39 нг/см³).

Пик ТМС-1-гидроксипирена узкий (полуширина пика 1.5 с), симметричный, мешающие пики отсутствуют. Таким образом, достигается отличная селективность определения. Значение RSD измерения времен удерживания составляет 0,027%.

Данный способ количественного определения 1-гидроксипирена был апробирован на образцах мочи работников (31 человек) производства алюминия. Интервал содержания составил от 0,31 до 263 нг/см³. Также были проанализированы и образцы мочи работников других производств (14 человек), где в производственной воздушной среде отсутствуют ПАУ. Здесь с концентрации лежат от 0,08 до 0,9 нг/см³.

Таким образом, предлагаемым способом с удовлетворительным пределом количественного определения 0.1 нг/см³ можно определять 1-гидроксипирен в моче при более малом объеме анализируемой пробы 2 см³ не только у работников производств алюминия, но и у лиц, не занятых в данном производстве. Применение данного способа позволяет уменьшить продолжительность анализа за счет уменьшения продолжительности ее следующих стадий: ферментативного гидролиза, дериватизации 1-гидроксипирена реагентом БСТФА, ГХ-МС анализа по сравнению с прототипом. Также применение способа позволяет повысить точность определения за счет использования изотопно-меченного стандарта 1-гидроксипирена-d19, повысить чувствительность определения за счет увеличения степени экстракции из биологической матрицы.