ШТАММ ВИРУСА ГРИППА ПТИЦ A/Goose/Krasnoozerskoye/627/05 СУБТИП Н5N1 ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ АКТИВНОСТИ ЛЕЧЕБНЫХ И ПРОФИЛАКТИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ ПРОТИВ ВИРУСА ГРИППА

Изобретение относится к медицинской вирусологии и микробиологии, а именно к получению нового штамма вируса гриппа птиц, субтипа H5N1, для изучения эффективности лечебных и профилактических препаратов против вируса гриппа.

Известен штамм A/duck/Novosibirsk/56/05 субтип H5N1 вируса гриппа птиц (аналог), выделенный на территории Западной Сибири, который используется для моделирования вирусной инфекции в научных экспериментах при изучении эффективности противовирусных препаратов на культурах клеток (Патент RU 2309983, МПК С12N 7/00, опубл. 27.05.2007 г.).

Однако указанный штамм имеет следующие недостатки: штамм имеет пониженную продуктивность при культивировании на клетках МДСК - максимальная концентрация вируса 6,5 lg ТЦД₅₀/мл. Штамм предназначен для производства профилактических и диагностических препаратов и исходя из представленных данных о патогенности для культур клеток и отсутствия данных о патогенности для животных, в т.ч. мышей, может быть использован для оценки противовирусной активности различных соединений только на культуре клеток.

Наиболее близким штаммом (прототипом) является штамм А/БАК/РОССИЯ/05 (субтип H5N1) вируса гриппа птиц (Патент RU 2300564, МПК С12N 7/00, опубл. 10.06.2007 г.). Однако указанный штамм может быть использован только для получения антигена и создания вакцинных и диагностических препаратов. Данных о патогенных свойствах штамма для лабораторных животных, в т.ч. мышей, нет.

Техническим результатом предлагаемого изобретения является получение нового штамма A/Goose/Krasnoozerskoye/627/05 вируса гриппа птиц (субтип H5N1) для создания панели антигенов и гипериммунных сывороток, необходимой при типировании новых вирусных вариантов, а также моделирования инфекции, вызываемой вирусом гриппа птиц субтипа H5N1, на мышах и хорьках в экспериментах по изучению биологии вируса гриппа и оценке активности противовирусных препаратов и эффективности вакцин.

Указанный технический результат достигается получением нового штамма вируса гриппа птиц A/Goose/Krasnoozerskoye/627/05 субтип H5N1 для изучения активности лечебных и профилактических препаратов против вируса гриппа на модели беспородных белых мышей и хорьков, депонированный в Коллекции культур микроорганизмов Федерального государственного учреждения науки «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Роспотребнадзора под регистрационным номером № V-371.

Заявляемый штамм нарабатывается на РКЭ в титрах 9,2±0,2 lg ЭИД₅₀/мл. Штамм вызывает заболевание с летальным исходом у мышей при интраназальном и любой из разновидностей парентерального пути введения, при этом следует отметить стабильное, закономерное проявление клинических признаков заболевания. Кроме этого, вирус патогенен для хорьков, при инфекции животные длительно выделяют вирус во внешнюю среду при кашле и чихании в инфекционных титрах, а также с мочой. Изучено течение и патологоанатомические, гистологические изменения, вызываемые при инфицировании данным штаммом, для разных видов птиц и млекопитающих.

Характеристика заявляемого штамма. Штамм A/Goose/Krasnoozerskoye/627/05 является типичным представителем вирусов гриппа птиц род Influenzavirus А семейство Orthomyxoviridae. Заявляемый штамм выделен от больного гуся при эпизоотии на гусеводческой птицеферме ЗАО Краснозерское Краснозерского района НСО. Штамм депонирован в коллекцию культур микроорганизмов Федерального государственного учреждения науки Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» (ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор») Роспотребнадзора под регистрационным номером № V-371.

Источник получения. Из патологического материала, полученного от больной птицы из гусеводческой птицефермы в НСО (селезенка, легкое, тонкий кишечник, головной мозг), был выделен изолят вируса гриппа птиц, который получил название A/Goose/Krasnoozerskoye/627/05. Вирус был выделен на РКЭ на первом пассаже, гибель РКЭ наблюдалась через 1,5-2 суток с момента инфицирования. Индикация вируса была проведена в РГА с эритроцитами петуха. Вирус агглютинировал эритроциты человечка и петуха: показатели гемагглютинирующей активности составляли 1:64-1:128 ГАЕ/0,2 мл. Инфекционная активность выделенного вируса составляла 9,2 lg ЭИД₅₀/мл.

Идентификация вируса. Первичная идентификация изолированного вируса гриппа А осуществлялась методом ОТ-ПЦР с использованием праймеров, специфичных к консервативным участкам NP-гена вируса гриппа А согласно [Lee MS], а также с помощью ПЦР тест-системы «АмплиСенс Influenza virus H5» (ФГУН ЦНИИЭ).

Генетический и филогенетический анализ: Экстракцию РНК из суспензии вирусов проводили с использованием набора реагентов «Рибо-золь» (ФГУН ЦНИИЭ), реакцию обратной транскрипции проводили с концевого, универсального для всех сегментов праймера Uni 12 с помощью фермента М-MLV (ФГУН ЦНИИЭ).

Для секвенирования протяженных участков всех сегментов вируса гриппа H5N1 были выбраны праймеры, образующие в процессе амплификации набор перекрывающихся фрагментов ДНК. ПЦР проводили на приборах «Терцик» (ДНК-технология) с использованием реагентов производства ФГУН ЦНИИЭ. Секвенирование фрагментов амплификации выполняли на базе ФГУН ЦНИИЭ методом "cycle sequence" с набором ABI PRISM Big Dye™ v.1.1 (Applied Biosystems, USA), согласно инструкции изготовителя с использованием капиллярного автоматического секвенатора ABI-3100 PRISM™ Genetic Analyzer (Applied Biosystems, США). Выравнивание нуклеотидных последовательностей выполнялось с использованием блока программ DNASTAR по алгоритму Clustal.

Полученные последовательности нуклеотидов депонированы в Gen Bank под номерами DQ840518 - DQ840533. Филогенетический анализ проводился с помощью программы MEGA 3.1 методом Neighbor Joining по алгоритму Kimura 2-parameter с выполнением Bootstrap Test of Phylogeny (1000 повторов) [Kumar S.].

Все полученные первичные последовательности были депонированы в базу GenBank. Номера депонирования генов вируса гриппа штамм A/Goose/Krasnoozerskoye/627/05 представлены в таблице 1.

Филогенетический анализ нуклеотидной последовательности генов показал принадлежность штамма A/Goose/Krasnoozerskoye/627/05 к субтипу H5N1. Штамм наиболее близок к цинхайской группе субтипов H5N1 вируса гриппа.

Культуральные свойства. Штамм A/Goose/Krasnoozerskoye/627/05 при культивировании на монослое клеток МДСК вызывает цитопатическое действие (ЦПД) на 2-4 сутки (температура культивирования 37°С, в атмосфере 5% CO₂).

Патогенность для человека. Штаммы вируса гриппа птиц субтипа H5N1 являются патогенными для человека: летальность для человека составляет около 60%.

Патогенность для птицы. Штамм A/Goose/Krasnoozerskoye/627/05 относится к высокопатогенным вариантам вируса гриппа птиц: интравенозный индекс патогенности = 2.9.

Патогенность для млекопитающих. Штамм A/Goose/Krasnoozerskoye/627/05 относится к вариантам вируса гриппа, патогенным для мышей, хорьков: вызывает гибель беспородных белых мышей и мышей линии BALBc, а также тяжелое заболевание у беспородных хорьков при интраназальном инфицировании. При этом хорьки способны длительно выделять вирус во внешнюю среду при кашле и чихании в титрах, соответствующих инфицирующей дозе.

Для длительного хранения штамм необходимо лиофилизировать с использованием в качестве защитной среды раствора желатина и сахарозы (САЖ). Лиофилизация с добавлением САЖ в соотношении 1:4 позволяет сохранить стабильную инфекционную активность вируса в течение не менее 2 лет при хранении на -70°С.

Для культивирования штамма используют следующие питательные среды: Игла МЭМ, Игла МЭМ×2АВК, среда 199, ДМЭМ, содержащие 2 мкг/мл трипсина, 2 ммоль/л глютамина, 100 мкг/мл пенициллина и 100 МЕ/мл стрептомицина.

Для дополнительной характеристики заявляемого штамма на чертеже приведены филогенетические отношения генов Р5 гемагглютинина разных штаммов вируса гриппа птиц. Вирусы, вызывавшие эпизоотии на территории России, и филогенетически близкие к ним изоляты выделены фигурной скобкой. Значения в основании ветвей - бутстреп индекс.

Пример 1. Изучение молекулярно-биологических и антигенных свойств штамма A/Goose/Krasnoozerskoye/627/05 вируса гриппа для создания панели антигенов

Серологическое типирование гемагглютинина было выполнено с помощью реакции торможения гемагглютинации эритроцитов петуха с использованием типоспецифических сывороток согласно (National Training Course). Серологическое типирование нейраминидазы проводили методом ингибирования нейраминидазной активности специфическими сыворотками (National Training Course). В качестве диагностической панели использовали антисыворотки, любезно предоставленные доктором Вебстером («Центр ВОЗ по экологии вируса гриппа птиц и животных», Мемфис, США) (National Training Course). Кроме этого, проводили дополнительное подтверждение подтипа гемагглютинина выделенных изолятов методом секвенирования после ОТ-ПЦР с использованием субтип-специфичных праймеров для H1-H15 подтипов (Lee MS) и с использованием ПЦР тест-системы «АмплиСенс Influenza virus H5» (ФГУН ЦНИИЭ).

Результаты антигенного анализа высокопатогенных вирусов, циркулирующих в 2005 году на территории Юга Западной Сибири, показали, что гемагглютинация, вызванная изолятами A/Black head dk/Chany/222-3/05, A/Coot/Chany/204-4/05, тормозилась только диагностической сывороткой, полученной на штамм A/Ck/Hidalgo/28159-32/95 (группа 1). Изоляты A/Tk/Suzdalka/1-12/05, A/Ck/Suzdalka/2-6/05, A/Gs/Suzdalka/6-10/05, A/Gs/Krasnoozerskoye/624/05, A/Ck/Omsk/108-14/05, A/Gray dk/Omsk/105-16/05 можно отнести к одной серологической группе (группа 2). Таким образом, штамм A/Gs/Krasnoozerskoye/624/05 по анигенным свойствам является типичным представителем высокопатогенных вирусов субтипа H5N1, циркулирующих на территории ЮЗС в 2005 году.

Антигены вирусов, относящиеся к группе 1, не проявили сродства к сывороткам, полученным на вирусы, циркулирующие в Юго-Восточной Азии, и относятся к непатогенным (данные молекулярно-генетического анализа и биопробы не показаны) Н5 серотипам, циркулирующим в Западной Сибири и Дальнем Востоке. Вирусы, относящиеся к группе 2, проявили сродство к сывороткам, полученным на штаммы A/Gs/HK/99, A/HK/213/03, A/VN/1203/04. A/Read head dk/Dovolnoye/5-26/05 антигенно ближе к штаммам А/HK/213/03, A/VN/1203/04.

Филогенетический анализ генов гемагглютинина изолятов вирусов гриппа, выделенных в период эпизоотии птичьего гриппа в 2005 г., показал их принадлежность к одному кластеру. В этот кластер также вошли нуклеотидные последовательности генов гемагглютинина ранее выделенных на территории центрального Китая (оз.Цинхай) и Монголии изолятов высокопатогенного вируса «птичьего» гриппа H5N1. Однако Вирус A/Gs/Krasnoozerskoye/627/05 можно выделить в отдельный кластер. На основании анализа можно сказать, что Вирус A/Gs/Krasnoozerskoye/627/05 обладает уникальными свойствами, что позволяет ставить вопрос о необходимости его использования для создания панели антигенов и гипериммунных диагностических сывороток.

Пример 2. Изучение патогенных свойств штамма A/Goose/Krasnoozerskoye/627/05 вируса гриппа на домашней птице

Для изучения патогенных свойств вируса гриппа A/Goose/Krasnoozerskoye/627/05 на домашней птице были использованы домашние птицы 6-недельного возраста следующих видов: куры пород белый леггорн и РодАйланд кросса Изобраун, гуси и утки. Инфицирование кур было проведено внутривенно в объеме 0,2 см² и перорально в объеме инфицирующей жидкости 1 см². Для определения летальных доз для птиц был использован вируссодержащий материал с титром 9,2 lg ЭИД₅₀/мл. Наблюдение за инфицированными животными проводили в течение 14 суток. Титр вируса был рассчитан по методу Рида-Менча.

Титр вируса при внутривенном заражении кур породы Леггорн составляет 8,6 lg ЛД₅₀/мл, при пероральном инфицировании 3,5 lg ЛД₅₀/мл. Для гусей этот показатель составляет lg ЛД₅₀/мл, для уток lg ЭИД₅₀/мл. Результаты экспериментов приведены в таблице 2.

При этом было выявлено, что профилактика вакцинами, которые используются в настоящее время в птицеводстве на территории России, предотвращает заболевание только при инфицировании дозой ниже 2 lg ЛД₅₀/мл, при получении дозы вируса более 2 lg ЛД₅₀/мл у птиц развивается заболевание, при этом у них не наблюдается выделения вируса в течение 10 суток с момента инфицирования. У вакцинированных гусей при инфицировании дозами 3-4 lg ЛД₅₀/мл развивается заболевание, которое сопровождается нарушениями центральной нервной системы, проявляющееся нарушением координации движений, и катаральные, а затем гнойные поражения слизистых оболочек конъюнктивы, дыхательных путей. Такие птицы по окончании срока наблюдения оставались живы, однако у них наблюдалось задержка в росте и развитии, через 1,5-2 месяца после выздоровления у них развивалась потеря зрения, такие птицы в дальнейшем погибали.

Следует заметить, что ранее полученные данные о патогенности других штаммов вирусов гриппа содержат лишь сведения о патогенности для кур, таким образом, штамм вируса гриппа A A/Goose/Krasnoozerskoye/627/05 является наиболее полно охарактеризованным штаммом, определены не только патогенные свойства в отношении неиммунных птиц, но и в отношении вакцинированных вакцинами, которые используются в настоящее время в птицеводстве на территории России.

Пример 3. Изучение патогенности штамма A/Goose/Krasnoozerskoye/627/05 на беспородных белых мышах и хорьках при интраназальном заражении

Изучение патогенеза гриппозной инфекции, вызванной штаммом вируса гриппа A/Gs/Krasnoozerskoye/627/05, проводили на беспородных белых мышах при интраназальном заражении дозой 10 ЛД₅₀ в объеме 50 мкл/животное. На 6-7 сутки после инфицирования у мышей наблюдали признаки общей интоксикации (снижение активности, отказ от пищи и воды), выраженную дыхательную недостаточность. Смерть наступала на 7-10 сутки. В органах погибших животных были определены титры вируса. Было выявлено, что наиболее вирус способен размножаться эффективно в легких и головном мозге. При этом следует отметить, что вирус был выделен из ткани почки, что свидетельствует о его способности выделяться с мочой. В таблице 3 приведены титры в органах мышей при экспериментальной инфекции заявляемым штаммом вируса гриппа A/Goose/Krasnoozerskoye/627/05. Данные о стандартном отклонении при титровке органов получены на основании результатов 5 мышей.

Далее патогенность вирусов A/Tk/Suzdalka/1-12/05, A/Gs/Krasnoozerskoye/627/05 была исследована на хорьках. Инфицирование проводили интраназально в дозе 6 lg ЭИД₅₀. Ежедневно, начиная с первых суток после заражения, проводили измерение температуры тела, оценивали общее состояние и брали мазок из носоглотки.

Заболевание хорьков сопровождалось анорексией, гипертермией, тремором, кашлем, чиханием, кратковременным поносом, выделением фекалий от белого до светло-желтого цвета, что свидетельствует о поражении печени. Выделение хорьками вируса A/Tk/Suzdalka/5/05 наблюдалось с первых до шестых суток, в титрах от Lg ЭИД₅₀ = 2,4 до 0,7. Выделение хорьками вируса A/Gs/Krasnoozerskoye/627/05 наблюдалось с первых до десятых суток, в титрах от Lg ЭИД₅₀ => 6 до 1,75. Полученные данные свидетельствуют о способности изолята A/Gs/Krasnoozerskoye/627/05 выделяться в значительных титрах с мокротой.

В таблице 4 приведены титры в органах хорьков при эспериментальной инфекции исследуемыми штаммами вируса гриппа. Данные о стандартном отклонении при титровке органов получены на основании результатов 3 животных.

В таблице 5 приведены титры вирусов гриппа в мазках из зева хорьков. Титры вирусов гриппа в мазках выражены в LogИЭД₅₀. Стандартное отклонение получено при анализе результатов титровки мазков, взятых от 3 животных.

Вирус A/Gs/Krasnoozerskoye/627/05, обладая инфекционностью и выраженной патогенностью для млекопитающих, эффективно выделяется с мокротой, что при не прекращаемом чихании и кашле может приводить к кросс-инфицированию и развитию эпизоотического процесса.

Таким образом, заявляемый штамм A/Goose/Krasnoozerskoye/627/05 вируса гриппа птиц (субтип H5N1) необходим для создания панели антигенов и гипериммунных сывороток, необходимой при типировании новых вирусных вариантов, а также моделирования инфекции, вызываемой вирусом гриппа птиц субтипа H5N1, на мышах и хорьках в экспериментах по изучению биологии вируса гриппа, и оценки активности противовирусных препаратов и эффективности вакцин.