Экспериментальная модель лечения асептического бисфосфонатного остеонекроза нижней челюсти у лабораторных белых крыс

Изобретение относится к экспериментальной медицине и может быть использовано для создания модели лечения асептического аминобисфосфонатного остеонекроза нижней челюсти при исследовании восстановительных процессов в нижнечелюстных костях.

Известен способ создания модели лечения остеонекроза нижней челюсти, который построен на введении 66 мг/кг золендроновой кислоты и 5 мг дексаметазона 3 раза в неделю на протяжении 4 недель, извлечении первых правых верхних моляров и введении через две недели в удаленные лунки пласта мезенхимальных стромальных клеток MSC (1,5×10⁶ клеток). [N. Kaibuchi. Т. Iwata, М. Yamato et al. / Multipotent mesenchymal stromal cell sheet therapy for bisphosphonate-related osteonecrosis of the jaw in a rat model // Acta Biomaterialia. 2016;42:400-410]

Недостаток аналога заключается в том, что исследуемый орган подвергается оперативному вмешательству, исходом которого является открытая рана в полости рта, создающая условия для течения остеонекротических процессов в септических условиях, а также низкая частота и длительность введения аминобисфосфонатного препарата, используемого в описываемой модели, и иммуносупресора (дексаметазона) при предварительном лекарственном воздействии, что затрудняет трактовку изменений, вызываемых золендроновой кислотой, а, следовательно, и результатов лечения. Сложность и дороговизна методики приготовления культуры мезенхимальных стромальных клеток также могут быть отнесены к недостаткам аналога.

В качестве ближайшего аналога выбран метод, который построен на предварительном введении беспородным белым крысам золендроновой кислоты в дозе 0.2 мг/кг три раза в неделю на протяжении 6 недель, экстракции 1 левого моляра нижней челюсти под кетами новым наркозом и подкожном введении после 4-х недельного периода после экстракции терипаратида (30 мкг/в 0,1 мл стерильного физиологического раствора ежедневно в течение 28 дней). [N. Ersan, L.J. van Ruijven, A.L. Bronckers et al. / Teriparatide and the treatment of bisphosphonate-related osteonecrosis of the jaw: a rat model // Dentomaxillofac Radiol. 2014; 43(1): 20130144]

Недостатком ближайшего аналога является то, что золендроновая кислота используется в терапевтических дозах, при использовании которых не всегда возможны остеонекротические изменения. Экстракция моляра, проводимая под кетаминовым наркозом, сама по себе создает локальные остеонекротические повреждения с возможностью инфицирования, в результате чего операции экстракция может закончиться смертью животного. Следует отметить большой промежуток между сформированной моделью остеонекроза и назначением тирепаратида (4 недели), что не позволяет оценить, связан ли процесс заживления ран с действием терипаратида или происходит спонтанно. Также нужно отметить, что тирепаратид является гормональным препаратом, использование которого может сопровождаться побочными эффектами.

В основу предлагаемого способа поставлена задача создания модели лечения асептического остеонекроза нижней челюсти без использования травмирующих методов и гормональных препаратов.

Поставленная задача решается тем, что экспериментальная модель лечения асептического бисфосфонатного остеонекроза нижней челюсти у лабораторных белых крыс, включающая введение аминобисфосфонатного препарата, после создания модели остеонекроза нижней челюсти, вызванного памидроновой кислотой в дозе от 60 до 150 мг/кг 1 раз в сутки в течение 3-х месяцев, производится внутрижелудочное ежедневное введение водного раствора Трилона Б в дозе 250 мг в течение 1 месяца..

Экспериментальная модель нивелирования асептического остеонекроза нижней челюсти у лабораторных белых крыс создается путем 3-х месячного внутрибрюшинного введения памидроновой кислоты в дозе от 60 до 150 мг/кг 1 раз в сутки. После этого животным внутрижелудочно водили водный раствор Трилона Б в дозе 250 мг/кг (максимально возможная разовая доза, определенная экспериментальным путем). Животных выводили из эксперимента под кетаминовым наркозом из расчета 4,4 мг/кг на 30 и 90 сутки путем декапитации в соответствии с международными правилами проведения работ с экспериментальными животными. Материалом для исследования служили скелетированные нижние челюсти крыс, фиксированные более 72 часов в 10% нейтральном забуференном формалине, декальцинированные в 14% водном растворе Трилона Б в буферном растворе при рН=7,0. Контроль конечной точки декальцинации выполняли гравиметрическим методом. Далее осуществляли гистологическую проводку с использованием изопропанола и минерального масла и заливали ткани парафином. Парафиновые срезы толщиной 3 мкм получали на ротационном микротоме Leica RM2245 (Германия) лезвиями Surgipath DB80LX (США). Срезы окрашивали гематоксилином и эозином по Романовскому-Гимзе и Массон-Голднеру, а также альциановым синим с рН 2,5 + Шифф - иодной кислотой (ШИК). Морфометрическое исследование проводили на компьютерном морфометрическом комплексе, в состав которого входят микроскоп Olympus СХ-31, цифровая камера Olympus C5050Z (КНР) и объективы 10x, 40х, 100х.

Общим с прототипом признаком является введение аминобисфосфонатного препарата.

Отличительными признаками являются:

введение памидроновой кислоты в дозе от 60 до 150 мг/кг 1 раз в сутки в течение 3-х месяцев,

внутрижелудочное ежедневное введение водного раствора Трилона Б в дозе 250 мг в течение 1 месяца.

Совокупность существенных признаков экспериментальной модели лечения асептического бисфосфонатного остеонекроза нижней челюсти у лабораторных белых крыс обеспечивает нормализацию процессов ремоделирования костной ткани, что в итоге приводит к нивелированию остеонекротических изменений, характеризуется отсутствием травм и гормональных веществ, дешевизной и простотой метода.

При исследовании гистологических препаратов у животных после трехмесячного воздействия памидроновой кислоты и месячной терапии с помощью Трилона Б отмечены клеточные и неклеточные резорбционные процессы в ремоделировании костного матрикса и инволюции миелофиброза с преобладанием последних. Это проявлялось в уменьшении размеров костных фрагментов, образовавшихся в участках интенсивного осаждения базофильного крапа; отслаивании фрагментов в глубине костного матрикса, свидетельствующего об ослаблении молекулярных связей неорганического компонента кости в результате деминерализации. При окраске альциановым синим с рН 2,5 + ШИК минеральная основа таких фрагментов давала интенсивную темно-синюю кайму по краям с переходом в полосы голубого цвета, примыкающие со стороны костномозговых пространств. Это свидетельствует об интенсивной последовательной резорбции минеральной и органической составляющей кости преимуществен по внеклеточными механизмами.

Таким образом, использование Трилона Б в предложенной модели лечения остеонекротических повреждений, вызванных памидроновой кислотой, приводит к нормализации процессов ремоделирования костной ткани и, в конечном итоге, к уменьшению избыточно образованного костного вещества и инволюции миелофибротических процессов в костномозговых пространствах с преобладанием течения резорбционных процессов неклеточными механизмами. Техническое решение характеризуется дешевизной метода, отсутствием травмы, отсутствием использования гормональных веществ, обеспечивает нивелирование остеонекротических повреждений.