ЖЕЛАТИНОВЫЕ КАПСУЛЫ НА ОСНОВЕ 3,3-ДИИНДОЛИЛМЕТАНА И ЭПИКАТЕХИН-3-ГАЛЛАТА И СПОСОБ ИХ ПОЛУЧЕНИЯ

Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности, в частности к технологии получения новой лекарственной формы биологически активных субстанций, а именно фармацевтической композиции в виде капсул, содержащей в качестве действующих веществ 3,3¹-дииндолилметан и эпикатехин-3-галлат, и способу получения этой композиции.

В настоящее время ведется активный поиск новых компонентных смесей, обладающих широкими внутриклеточными регуляторными механизмами с возможностью воздействия на все звенья этиопатогенеза заболевания. Одной из таких композиций является компонентная смесь 3,3¹-дииндолилметана (дииндолилметан, ДИМ) и эпикатехин-3-галлата (EGCG).

3,3¹-дииндолилметан и эпикатехин-3-галлат являются уникальными биологически активными веществами, уже вошедшими в клиническую практику в Европе и в США. Показана способность этих веществ блокировать молекулярные механизмы, приводящие к патологической клеточной пролиферации, опухолевому неоангиогенезу и повышению инвазивной активности трансформированных клеток. Известна также их антиметастатическая активность.

Так, в патенте US 6086915 А, 11.07.2000, обсуждается применение многокомпонентной смеси для нормализации метаболизма стероидных гормонов. В состав комбинации наряду с другими веществами входят ДИМ и экстракт зеленого чая, содержащий в качестве основного вещества эпикатехин-3-галлат (EGCG) - самый активный из катехинов зеленого чая.

Известны также фармацевтические композиции (патенты RU 2328282 С1, 10.07.2008, 2276993 С1, 27.05.2006, 2377984 С1, 10.01.2010), состоящие из индол-3 карбинола и эпикатехин-3-галлата, также используемые для лечения и профилактики пролиферативных заболеваний.

Соединение индол-3-карбинол обладает широким спектром противоопухолевой активности, однако является нестабильным соединением.

Более стабилен при хранении и перспективен для применения в качестве лекарственного средства 3,3¹-дииндолилметан, представляющий собой димер, образующийся из индол-3-карбинола под действием различных факторов (влаги, температуры, pH, света). Экспериментально доказано, что практически все механизмы, индуцируемые индол-3-карбинолом in vitro и in vivo, характерны и для 3,3¹-дииндолилметана.

Из патента RU 2318508 С1Б 10.08.2008 известно получение фармацевтической композиции, включающей дииндолилметан, тамоксифен и вспомогательные вещества. Композиция используется для лечения пролиферативных заболеваний молочной железы.

Известна фармацевтическая композиция, содержащая в качестве действующих веществ 3,3¹-дииндолилметан и эпиактехин-3-галлат, катализатор ингибирующей активности в отношении метилтрансаминаз в виде солей магния, поливинилпирролидон, бутилгидроксианизол и липофильную основу - твердый жир.

Фармацевтическая композиция выполнена в виде вагинальных и ректальных суппозиториев (RU 2395281 С2, 27.07.2010).

Однако в данной композиции невозможно использовать в полной мере потенциальные возможности 3,3¹-дииндолилметана из-за его низкой биодоступности, напрямую связанной с его растворимостью. Кроме того, композиция содержит высокие дозы действующих веществ.

Наиболее близким техническим решением к заявленной группе изобретений является фармацевтическая композиция для лечения и профилактики аденомиоза, выполненная в виде капсул или таблетки, содержащая в качестве действующих веществ 3,3¹-дииндолилметан и эпикатехин-3-галлат и приемлемый носитель. В качестве последнего могут быть использованы фармацевтический крахмал, лактоза, стеарат магния (RU 2406497 С1, 20.12.2010).

Недостатком известной композиции является низкая биодоступность 3,3¹-дииндолилметана (20-30%) и, как следствие, высокое содержание действующих веществ в капсуле.

Из фармацевтических факторов основное значение при оценке биодоступности лекарственного вещества имеют его химические и физико-химические свойства, лекарственная форма, в которой оно назначается, природа используемых для изготовления лекарственной формы вспомогательных веществ, особенности технологии производства лекарственной формы и др. (Лакин К.М., Крылов Ю.Ф., Биотрансформация лекарственных веществ, М., 1981).

Поступление лекарственного вещества в системный кровоток происходит путем высвобождения его из лекарственной формы и последующего всасывания через биологические мембраны. Высвобождение биологически активного вещества определяется скоростью дезинтеграции лекарственной формы и временем растворения вещества в биологических жидкостях. Оценка биодоступности является одним из важнейших этапов процесса разработки и внедрения новых лекарственных форм биологически активных соединений.

Главное внимание при создании лекарственных форм дииндолилметана сосредоточено на создании условий, обеспечивающих увеличение биодоступности препарата.

Биодоступность дииндолилметана мала, и она учитывается при выборе режима терапии.

Доза (внутрь)=Ссредн×(Биодоступность/Интервал), где Интервал - интервал между введениями лекарственного средства, определяется количеством действующего вещества, содержавшегося во вводимом препарате, которое попадает в системный кровоток в неизмененном виде. Ее величину измеряют отношением количества действующего вещества в крови к введенной дозе и выражают в процентах.

Задачей настоящей группы изобретений является повышение биодоступности действующих веществ, снижение их дозы без снижения эффективности, а также упрощение способа приготовления лекарственного средства и возможность его использования для более широкого круга заболеваний.

Поставленная задача решается за счет того, что разработана новая лекарственная форма лекарственного средства в виде желатиновых капсул на основе 3,3¹-дииндолилметана и эпикатехин-3-галлата и способ ее получения.

Способ получения желатиновых капсул на основе 3,3¹-дииндолилметана и эпикатехин-3-галлата, согласно изобретению, отличается тем, что смешивают 3,3¹-дииндолилметан и эпикатехин-3-галлат с жидким жировым наполнителем, добавляют солюбилизатор, при перемешивании нагревают полученную смесь до 35-45°C до получения раствора, затем охлаждают полученный раствор до 22-25°C и наполняют им желатиновые капсулы при следующем соотношении компонентов, г/капсулу:

Рекомендуется в качестве жидкого жирового наполнителя использовать растительное масло или рыбий жир.

Из растительных масел можно использовать подсолнечное, кукурузное, оливковое, соевое или касторовое масла.

Целесообразно в качестве солюбилизатора использовать твин-80.

Полученные по описанному способу желатиновые капсулы, содержащие, г/капс.:

являются самостоятельным объектом изобретения.

Техническим результатом заявленной группы изобретений является то, что экспериментально подобранное соотношение жидкого жирового наполнителя, солюбилизатора и режимов температурной обработки позволило получить раствор 3,3¹-дииндолилметана и эпикатехин-3-галлата, в результате чего его биодоступность повысилась на порядок.

Полученное лекарственное средство нетоксично, безопасно при длительном (90 дней) ежедневном внутрижелудочном введении экспериментальным теплокровным животным, не обладает местно-раздражающим действием, не оказывает токсического воздействия на иммунную и репродуктивную системы.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1

50 мг 3,3¹-дииндолилметана и 20 мг эпикатехин-3-галлата смешивают со 100 мг рыбьего жира, в смесь добавляют 400 мг твина-80. Полученную смесь при перемешивании нагревают до температуры 40°C до получения раствора, после чего охлаждают до температуры 22°C и вводят в мягкую желатиновую капсулу.

Таким образом, получают желатиновую капсулу, содержащую (г/капс.):

Пример 2

20 мг 3,3¹-дииндолилметана смешивают с 20 мг эпикатехин-3-галлата, добавляют 80 мг подсолнечного масла и 450 мг твина-80. Полученную смесь при перемешивании нагревают до температуры 40°C до получения раствора, охлаждают до температуры 23°C и используют для заполнения мягких желатиновых капсул.

Получают желатиновую капсулу, содержащую (г/капс.):

Пример 3

90 мг 3,3¹-дииндолилметана смешивают с 25 мг эпикатехин-3-галлата, при перемешивании добавляют 90 мг оливкового масла и 430 мг твина-80. Полученную смесь при перемешивании нагревают до температуры 43°C до получения раствора, охлаждают полученный раствор до температуры 22°C и используют для заполнения мягких желатиновых капсул.

Получают желатиновую капсулу, содержащую (г/капс.):

Пример 4

10 мг 3,3¹-дииндолилметана смешивают с 40 мг эпикатехин-3-галлата, при перемешивании добавляют 60 мг соевого масла и 400 мг твина-80. Полученную смесь при перемешивании нагревают до температуры 39°C до получения раствора, охлаждают полученный раствор до температуры 24°C и используют для заполнения мягких желатиновых капсул.

Получают желатиновую капсулу, содержащую (г/капс.):

Пример 5

100 мг 3,3¹-дииндолилметана смешивают с 40 мг эпикатехин-3-галлата, при перемешивании добавляют 100 мг кукурузного масла и 450 мг твина-80. Полученную смесь при перемешивании нагревают до температуры 45°C до получения раствора, охлаждают полученный раствор до температуры 24°C и используют для заполнения мягких желатиновых капсул.

Получают желатиновую капсулу, содержащую (г/капс.):

Пример 6

50 мг 3,3¹-дииндолилметана смешивают с 40 мг эпикатехин-3-галлата и 100 мг касторового масла, при перемешивании в смесь добавляют 400 мг твина-80. Полученную смесь нагревают до температуры 40°C, перемешивают до получения раствора, после чего охлаждают до температуры 23°C и вводят в мягкую желатиновую капсулу.

Получают желатиновую капсулу, содержащую (г/капс.):

Было проведено изучение сравнительной фармакокинетики и биодоступности субстанции 3,3¹-дииндолилметана и полученных по заявленному способу желатиновых капсул при внутрижелудочном введении крысам.

Исследуемый препарат:

1. Субстанция дииндолилметана.

2. Мягкие желатиновые капсулы.

Состав на 1 капсулу:

Субстанция является 3,3-дииндолилметаном и представляет собой порошок, практически нерастворимый в воде. Препараты обладают антиандрогенным и противоопухолевым действием. Дииндолилметан связывается с андрогенными рецепторами, подавляя стимулирующее влияние андрогенов. В результате этого происходит регрессия гиперплазии предстательной железы. Антиандрогенное и вазопротекторное действия способствуют уменьшению симптомов доброкачественной гипертрофии предстательной железы. Он показан при доброкачественной гиперплазии предстательной железы (аденоме) и миоме матки.

Исследования проведены на 200 крысах массой 0.23±0.02 кг. Животные содержались в стандартных клетках при 12-часовом режиме освещения и свободном доступе к корму и воде.

Длительность карантина (акклиматизационного периода) животных составляла четырнадцать (14) дней. В течение карантина проводили ежедневный осмотр каждого животного (поведение и общее состояние).

Образцы вводили с утра натощак внутрижелудочно: субстанция - в дозе 200 мг/кг, содержимое капсул - 0,69 мг/кг, что в пересчете на дозу дииндолилметана составило 0,1 мг/кг.

Стандартное питание животные получали через 2 часа после начала эксперимента. Забор крови проводился после декапитации животных через: 0.25; 0.5; 1.0; 2.0; 4.0; 6.0; 8.0 и 12.0 часов после введения препарата.

Пробы крови центрифугировали 15 минут при 3000 об/мин, отбирали по 1.5-2.0 мл плазмы, замораживали и хранили при -20°C до анализа.

Анализ содержания дииндолилметана в плазме крови производили по специально разработанной методике количественного определения с применением высокоэффективной жидкостной хроматографии с предварительной экстракцией из биоматериала (Соловьев В.Н., Фирсов А.А., Филов В.А. Фармакокинетика. М.: «Медицина», 1980, 423 стр.).

Для проведения хроматографического анализа и экстракции препарата из взятых проб использовали следующие реактивы и органические растворители: ацетонитрил, этилацетат, додецилсульфат, кислый фосфорнокислый калий, фосфорную кислоту, дистиллированную и деионизированную воду.

Центрифугирование образцов проводили на центрифуге ОПн - 8 УХЛ4.2 (Россия).

Анализ проб с целью определения концентрации дииндолилметана в образцах плазмы крови осуществляли методом ВЭЖХ на жидкостном хроматографе «LC-20 Prominence» (Beckman, США) с УФ-детектором с диодной матрицей SPD М20А фирмы Шимадзу.

Хроматографические характеристики методики количественного определения дииндолилметана в плазме крови экспериментальных животных представлены в таблице 1.

Во все образцы плазмы крови в объеме 1 мл добавляли 5 мл этилацетата, встряхивали пробирку в течение 2 минут и затем центрифугировали 10 мин при 4000 об/мин. Отбирали надосадочный слой, упаривали, добавляли 200 мкл ацетонитрила и аликвоту вводили в хроматограф.

Аналогично проводили анализ проб плазмы крови с внесенными стандартными количествами дииндолилметана.

Количественное определение дииндолилметана в плазме крови проводили методом ВЭЖХ на жидкостном хроматографе «LC-20 Prominence» (Beckman, США) с УФ-детектором с диодной матрицей SPD М20А фирмы Шимадзу, длина волны 230 нм.

Колонка Ascentis, С18, 5 мкм (4.6×25 мм). Элюент: 70% ацетонитрила, 30% водного буфера, содержащего 6 мг додецилсульфата, 0.6 мг кислого фосфорнокислого калия на 1 л Н₂O, закисленного до pH 5 фосфорной кислотой.

Скорость элюирования - 1.0 мл/мин. Хроматографирование проводили при комнатной температуре (22-24°C). Перед хроматографированием подвижную фазу дегазировали и фильтровали. Объем вводимой в хроматограф пробы составил 5 мкл. Время удерживания дииндолилметана в данных условиях - 5.07 мин.

Установлена линейная зависимость между концентрациями дииндолилметана и площадями хроматографических пиков в диапазоне 0.03-2.0 мкг/мл. Концентрацию лекарственного вещества в пробах определяли по калибровочному графику. Минимальная чувствительность метода анализа составила 0.03 мкг/мл.

Достоверность результатов количественного определения дииндолилметана в плазме крови оценивали, рассчитывая метрологические характеристики данной методики по результатам 5 параллельных измерений концентраций в трех образцах плазмы крови, которые представлены в таблице 2.

Как следует из данных таблицы 2, показатель, характеризующий точность методики (относительная погрешность среднего значения), составляет 8.36, 0.89, 0.14%. Показатель, характеризующий воспроизводимость методики (относительное стандартное отклонение), составляет 7.27, 0.77, 0.12% для концентрации дииндолилметана 0.03, 0.30 и 2.0 мкг/мл плазмы соответственно.

Содержание препарата в пробах находится в рассчитанных доверительных границах, а методики количественного определения дииндолилметана в плазме крови не зависят от систематических ошибок. Полученные результаты удовлетворяют критериям и нормативам, отраженным в регуляторных требованиях FDA (Analytical Methods Validation: Bioavailability, Bioequivalence and Pharmacokinetic Studies Conference Report - Pharmaceutical Research, Vol.9, №4, 1992).

Для описания фармакокинетики препарата в плазме крови были привлечены следующие показатели (в их условных обозначениях, принятых в литературе (Лабораторный контроль лекарственной терапии. Аналитические процедуры/Под ред. В.В.Меньшикова. Клиническая лабораторная аналитика. М., 1999, т.2, стр.323-346)):

Показатели T_max, C_max и β оцениваются из вида кривой концентрации. Исходные формулы для расчета остальных показателей следующие:

где D - введенная доза препарата.

Расчет показателей выполнялся модельно-независимым способом с помощью метода интегральных моментов (Методические рекомендации по проведению качественных клинических исследований биоэквивалентности лекарственных препаратов. Москва. 2004). Используемый метод не опирается ни на какие предположения о внутренних механизмах, лежащих в основе кинетики препаратов, кроме самых общих, и в этом смысле является наиболее устойчивым.

Для расчета использовалась оригинальная программа, разработанная в Институте токсикологии.

Результаты измерения концентрации субстанции дииндолилметана в плазме крови крыс при внутрижелудочном введении представлены в таблице 3.

Усредненные фармакокинетические кривые отображены на рисунках 1, 2.

После введения дииндолилметан начинал определяться в системном кровотоке через 15 минут, максимум концентрации наблюдался около 1 часа (0.13-0.17 мкг/мл). Далее концентрация дииндолилметана начинала плавно снижаться, и через 12 часов после введения дииндолилметан определялся в крови в минимальных количествах (менее 0.03 мкг/мл). Разброс индивидуальных значений умеренный: коэффициент вариации CV составил 8-22%.

Результаты измерения концентрации дииндолилметана в плазме крови крыс при внутрижелудочном введении капсулы представлены в таблице 4. Усредненные фармакокинетические кривые отображены на рисунках 3-4.

После введения дииндолилметан начинал определяться в системном кровотоке через 15 минут, максимум концентрации наблюдался около 30 минут (1.4-1.8 мкг/мл), далее концентрация снижалась в 8-9 раз, и через 2 часа после введения наблюдался повторный максимум концентрации (0.8-1.1 мкг/мл). Далее концентрация дииндолилметана начинала плавно снижаться, и через 12 часов после введения дииндолилметан определялся в крови в минимальных количествах (около 0.1 мкг/мл). Разброс индивидуальных значений умеренный: коэффициент вариации CV составил 9-35%.

Расчет фармакокинетических показателей выполнен модельно-независимым (прямым) способом на основе метода интегральных моментов. Рассчитанные значения показателей приведены в таблицах 5-7.

Полученные оценки позволяют сделать ряд выводов о фармакокинетике субстанции дииндолилметана при внутрижелудочном введении.

Концентрация дииндолилметана начинает определяться в системном кровотоке через 15 минут. Максимум концентрации Cmax достигается через 1 час и составляет порядка 0.15 мкг/мл (0.15±0.01 мкг/мл). Последующее снижение концентрации характеризуется временем половинного убывания Т1/2 порядка 2 часов (2.11±0.04 ч). Общее среднее время присутствия препарата в организме - показатель MRT - составляет порядка 4.5 часов (4.46±0.16 ч). Величина кажущегося стационарного объема распределения - показатель Vss - составляет порядка 1300 л/кг.

Концентрация дииндолилметана начинает определяться в системном кровотоке через 15 минут. Максимум концентрации Cmax достигается через 0.5 ч порядка 1.6 мкг/мл (1.52±0.06 мкг/мл) и 2 часа порядка 1.0 мкг/мл (0.93±0.05 мкг/мл). Последующее снижение концентрации характеризуется временем половинного убывания Т1/2 порядка 4 часов (4.07±0.09 ч). Общее среднее время присутствия препарата в организме - показатель MRT - составляет порядка 6 часов (6.20±0.10 ч). Величина кажущегося стационарного объема распределения - показатель Vss - составляет порядка 112 мл/кг.

Результаты исследования сравнительной фармакокинетики и биодоступности субстанции дииндолилметана при внутрижелудочном введении у крыс показали (табл.7):

Субстанция дииндолилметана

Концентрация дииндолилметана начинает определяться в системном кровотоке через 15 минут. Максимум концентрации Cmax достигается через 1 час и составляет порядка 0.15 мкг/мл (0.15±0.01 мкг/мл). Последующее снижение концентрации характеризуется временем половинного убывания Т1/2 порядка 2 часов (2.11±0.04 ч). Общее среднее время присутствия препарата в организме - показатель MRT - составляет порядка 4.5 часов (4.46±0.16 ч). Величина кажущегося стационарного объема распределения - показатель Vss - составляет порядка 1300 л/кг.

Мягкие желатиновые капсулы

Концентрация дииндолилметана начинает определяться в системном кровотоке через 15 минут. Максимум концентрации Cmax достигается через 0.5 ч порядка 1.6 мкг/мл (1.52±0.06 мкг/мл) и 2 часа порядка 1.0 мкг/мл (0.98±0.05 мкг/мл). Последующее снижение концентрации характеризуется временем половинного убывания Т1/2 порядка 4 часов (3.89±0.09 ч). Общее среднее время присутствия препарата в организме - показатель MRT - составляет порядка 6 часов (5.99±0.14 ч). Величина кажущегося стационарного объема распределения - показатель Vss - составляет порядка 108 мл/кг.

Полученные результаты свидетельствуют о минимальной биодоступности при внутрижелудочном введении субстанции дииндолилиметана, что, по-видимому, связано с ее практической нерастворимостью в воде, а также с инактивацией активного соединения химической средой ЖКТ.

Введение активного вещества в мягких желатиновых капсулах в виде раствора в жидких маслах растительного и животного происхождения не только предохраняет его от воздействия кислой желудочной среды, но и обеспечивает практически 100% биодоступность.

Как видно из представленных данных, поставленная задача решена.

Получено лекарственное средство в виде мягких желатиновых капсул, содержащих 3,3¹-дииндолилметан в виде раствора, позволяющих увеличить биодоступность действующего вещества, и в результате снизить его дозу. Полученное лекарственное средство нетоксично, безопасно при длительном введении, не обладает местно-раздражающим действием, не оказывает токсического воздействия на иммунную и репродуктивную системы.