СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЖЕЛАТИНОВЫХ КАПСУЛ НА ОСНОВЕ 3,3- ДИИНДОЛИЛМЕТАНА

Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности, в частности к технологии получения новой лекарственной формы 3,3¹-дииндолилметана, а именно к получению желатиновых капсул на основе 3,3¹-дииндолилметана.

3,3¹-дииндолилметан (дииндолилметан, ДИМ) - пероральный препарат, обладающий выраженным противоопухолевым действием. Ингибирует экспрессию онкогенов ВГ⁴, Е₆ и Е₇), останавливая таким образом процесс канцерогенеза. Эффективен при лечении и профилактике дисплазий и рака шейки матки, опухолей молочной железы, папилломатоза гортани.

Дииндолилметан - кристаллический порошок от белого до белого с кремовым оттенка с характерным запахом.

Легко растворим в ацетоне, мало в спирте 95%, очень мало растворим в хлороформе, практически нерастворим в воде.

Нерастворимость дииндолилметана в воде является одной из причин низкой биодоступности препарата.

При внутривенном введении биодоступность различных биологически активных веществ оказывается максимальной, т.е. равной 100%. При любых других путях введения она никогда не достигает максимума, поскольку полнота и скорость всасывания зависят от многих факторов биологического и фармацевтического характера.

К биологическим факторам относят индивидуальные особенности организма больного. Из фармацевтических факторов основное значение имеют химические и физико-химические свойства лекарственного вещества, лекарственная форма, в которой оно назначается, природа используемых для изготовления лекарственной формы вспомогательных веществ, особенности технологии производства лекарственной формы и др. (Лакин К.М., Крылов Ю.Ф. Биотрансформация лекарственных веществ, М., 1981).

Поступление лекарственного вещества в системный кровоток происходит путем освобождения его из лекарственной формы и последующего всасывания через биологические мембраны. Освобождение биологически активного вещества определяется скоростью дезинтеграции лекарственной формы и временем растворения вещества в биологических жидкостях. Оценка биодоступности является одним из важнейших этапов процесса разработки и внедрения новых лекарственных форм биологически активных соединений.

Главное внимание при создании лекарственных форм дииндолилметана сосредоточено на создании условий, обеспечивающих увеличение биодоступности препарата.

Биодоступность дииндолилметана мала, и она учитывается при выборе режима терапии.

Доза (внутрь)=Ссредн × (Биодоступность/Интервал), где Интервал - интервал между введениями лекарственного средства определяется количеством действующего вещества, содержавшегося во вводимом препарате, которое попадает в системный кровоток в неизмененном виде. Ее величину измеряют отношением количества действующего вещества в крови к введенной дозе и выражают в процентах.

Известны различные твердые лекарственные формы дииндолилметана (WO 2005107747 А2, 17.11.2005). Для повышения растворимости и биодоступности дииндолилметана в этом случае использовали цетостеариловый спирт, который нагревали с дииндолилметаном, добавляли церамиды или их производные, охлаждали и смешивали с триглицеридами.

Но длительное воздействие триглицеридной основы оказывало негативное действие на слизистую оболочку желудка.

Известен также способ получения различных лекарственных форм дииндолилметана с использованием крахмальной матрицы, на которую его наносят (US 6689387 B1, 10.02.2004). Такой прием позволяет несколько увеличить биодоступность и растворимость препарата, но значительно снижает его стабильность при хранении.

В заявке WO 2009032699 А1, 12.03.2009, описывается получение различных лекарственных форм дииндолилметана с повышенной биодоступностью. Дииндолилметан присутствует в микрокристаллической форме. Однако и в данном изобретении не удалось достичь значительного улучшения растворимости, т.к. смеси для заполнения лекформ представляют собой дисперсные системы в основном гетерогенной структуры.

Известно лекарственное средство на основе 3,3¹-дииндолилметана в виде суппозитория (патент RU 2318510 С1, 10.03.2008).

Способ приготовления указанного средства заключается в том, что расплавляют компоненты липофильной основы, часть ее отдельно растирают с 3,3¹-дииндолилметаном до получения гомогенной взвеси, к охлажденной оставшейся части основы добавляют поливинилпирролидон и антиоксидант, полученную взвесь перемешивают до однородного состояния и формуют свечи методом выливания в формы заданных размеров.

В качестве липофильной основы предпочтительно использовать твердый кондитерский жир, такой как твердый жир типа «А» или «Б», но возможно введение дополнительных эмульгаторов, эфиров фталевой кислоты, спирта, восков, парафина, ланолина, кулинарного жира и т.д.

Недостатком указанного средства является сложность состава, трудоемкость процесса приготовления состава, невысокая биодоступность (20-30%), а также ограниченное применение средства - для лечения генитальных кондилом и неопластических заболеваний репродуктивных органов.

Задачей настоящей группы изобретений является повышение биодоступности 3,3¹-дииндолилметана, снижение его дозы без снижения эффективности, а также упрощение способа приготовления лекарственного средства и возможность его использования для более широкого круга заболеваний.

Поставленная задача решается за счет того, что разработана новая лекарственная форма лекарственного средства в виде желатиновых капсул на основе 3,3¹-дииндолилметана и способ ее получения.

Способ получения желатиновых капсул на основе 3,3¹-дииндолилметана, согласно изобретению отличается тем, что смешивают 3,3¹-дииндолилметан с жидким жировым наполнителем, добавляют солюбилизатор, при перемешивании нагревают полученную смесь до 35-45°C до получения раствора, затем охлаждают полученный раствор до 21-23°C и наполняют им желатиновые капсулы при следующем соотношении компонентов, г/капсулу:

Рекомендуется в качестве жидкого жирового наполнителя использовать растительное масло или рыбий жир.

Из растительных масел можно использовать подсолнечное, кукурузное, оливковое, соевое или касторовое масла.

Целесообразно в качестве солюбилизатора использовать твин-80.

Полученные по описанному способу желатиновые капсулы, содержащие, г/капс.:

являются самостоятельном объектом изобретения.

Техническим результатом заявленной группы изобретений является то, что экспериментально подобранное соотношение жидкого жирового наполнителя, солюбилизатора и режимов температурной обработки позволило получить раствор 3,3¹-дииндолилметана, в результате чего его биодоступность повысилась на порядок.

Полученное лекарственное средство нетоксично, безопасно при длительном (90 дней) ежедневном внутрижелудочном введении экспериментальным теплокровным животным, не обладает местно-раздражающим действием, не оказывает токсического воздействия на иммунную и репродуктивную системы.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1.

50 мг 3,3¹-дииндолилметана смешивают со 100 мг рыбьего жира, при перемешивании в смесь добавляют 400 мг твина-80. Полученную смесь нагревают до температуры 38°C, перемешивают до получения раствора, после чего охлаждают до температуры 22°C и вводят в мягкую желатиновую капсулу.

Таким образом получают желатиновую капсулу, содержащую, г/капс.:

Пример 2.

100 мг 3,3¹-дииндолилметана смешивают со 100 мг подсолнечного масла, при перемешивании добавляют 450 мг твина-80. Полученную смесь нагревают до температуры 40°C, охлаждают до температуры 23°C и используют для заполнения мягких желатиновых капсул.

Получают желатиновую капсулу, содержащую, г/капс.:

Пример 3.

90 мг 3,3¹-дииндолилметана смешивают со 100 мг оливкового масла, при перемешивании добавляют 450 мг твина-80. Полученную смесь нагревают до температуры 42°C, охлаждают раствор до температуры 22°C и используют для заполнения мягких желатиновых капсул.

Получают желатиновую капсулу, содержащую, г/капс.:

Пример 4.

25 мг 3,3¹-дииндолилметана смешивают со 50 мг кукурузного масла, при перемешивании добавляют 400 мг твина-80. Полученную смесь нагревают до температуры 40°C, охлаждают раствор до температуры 23°С и наполняют им мягкую желатиновую капсулу. Получают желатиновую капсулу, содержащую, г/капс.:

Пример 5.

30 мг 3,3¹-дииндолилметана смешивают с 90 мг соевого масла, при перемешивании в смесь добавляют 400 мг твина-80. Полученную смесь нагревают до температуры 37°C, перемешивают до получения раствора, после чего охлаждают до температуры 21°C и вводят в мягкую желатиновую капсулу. Получают желатиновую капсулу, содержащую, г/капс.:

Пример 6.

50 мг 3,3¹-дииндолилметана смешивают со 100 мг касторового масла, при перемешивании в смесь добавляют 400 мг твина-80. Полученную смесь нагревают до температуры 38°C, перемешивают до получения раствора, после чего охлаждают до температуры 22°C и вводят в мягкую желатиновую капсулу.

Получают желатиновую капсулу, содержащую, г/капс.:

Было проведено изучение сравнительной фармакокинетики и биодоступности субстанции 3,3¹-дииндолилметана и полученных по заявленному способу желатиновых капсул при внутрижелудочном введении крысам.

Исследуемый препарат:

1. Субстанция дииндолилметана.

2. Мягкие желатиновые капсулы.

Состав на 1 капсулу, г:

Субстанция является 3,3-дииндолилметаном и представляет собой порошок, практически не растворимый в воде. Препараты обладают антиандрогенным и противоопухолевым действием. Дииндолилметан связывается с андрогенными рецепторами, подавляя стимулирующее влияние андрогенов. В результате этого происходит регрессия гиперплазии предстательной железы.

Антиандрогенное и вазопротекторное действия способствуют уменьшению симптомов доброкачественной гипертрофии предстательной железы. Он показан при доброкачественной гиперплазии предстательной железы (аденоме) и миоме матки.

Исследования проведены на 200 крысах массой 0.23±0.02 кг. Животные содержались в стандартных клетках при 12-часовом режиме освещения и свободном доступе к корму и воде.

Длительность карантина (акклиматизационного периода) животных составляла четырнадцать (14) дней. В течение карантина проводили ежедневный осмотр каждого животного (поведение и общее состояние).

Образцы вводили с утра натощак внутрижелудочно. Стандартное питание животные получали через 2 часа после начала эксперимента. Забор крови проводился после декапитации животных через: 0.25; 0.5; 1.0; 2.0; 4.0; 6.0; 8.0; и 12.0 часов после введения препарата.

Пробы крови центрифугировали 15 минут при 3000 об/мин, отбирали по 1.5-2.0 мл плазмы, замораживали и хранили при -20°C до анализа.

Анализ содержания дииндолилметана в плазме крови производили по специально разработанной методике количественного определения с применением высокоэффективной жидкостной хроматографии с предварительной экстракцией из биоматериала (Соловьев В.Н., Фирсов А.А., Филов В.А. Фармакокинетика. М.: Медицина, 1980, 423 стр).

Для проведения хроматографического анализа и экстракции препарата из взятых проб использовали следующие реактивы и органические растворители: ацетонитрил, этилацетат, додецилсульфат, кислый фосфорнокислый калий, фосфорная кислота, дистиллированная и деионизированная вода.

Центрифугирование образцов проводили на центрифуге ОПн-8 УХЛ4.2 (Россия).

Анализ проб с целью определения концентрации дииндолилметана в образцах плазмы крови осуществляли методом ВЭЖХ на жидкостном хроматографе, «LC-20 Prominence» (Beckman, США) с УФ-детектором с диодной матрицей SPD M20A, фирмы Шимадзу.

Хроматографические характеристики методики количественного определения дииндолилметана в плазме крови экспериментальных животных представлены в таблице 1.

Во все образцы плазмы крови в объеме 1 мл добавляли 5 мл этилацетата. встряхивали пробирку в течение 2 минут и затем центрифугировали 10 мин при 4000 об/мин. Отбирали надосадочный слой, упаривали, добавляли 200 мкл ацетонитрила и аликвоту вводили в хроматограф.

Аналогично проводили анализ проб плазмы крови с внесенными стандартными количествами дииндолилметана.

Количественное определение дииндолилметана в плазме крови проводили методом ВЭЖХ на жидкостном хроматографе «LC-20 Prominence» (Beckman, США) с УФ-детектором с диодной матрицей SPD M20A, фирмы Шимадзу, длина волны 230 нм.

Колонка Ascentis, С18, 5 мкм (4.6×25 мм). Элюент: 70% ацетонитрила, 30% водного буфера, содержащего 6 мг додецилсульфата, 0.6 мг кислого фосфорнокислого калия на 1 л H₂O, закисленного до pH 5 фосфорной кислотой.

Скорость элюирования - 1.0 мл/мин. Хроматографирование проводили при комнатной температуре (22-24°C). Перед хроматографированием подвижную фазу дегазировали и фильтровали. Объем вводимой в хроматограф пробы составил 5 мкл. Время удерживания дииндолилметана в данных условиях - 5.07 мин.

Установлена линейная зависимость между концентрациями дииндолилметана и площадями хроматографических пиков в диапазоне 0.03-2.0 мкг/мл. Концентрацию лекарственного вещества в пробах определяли по калибровочному графику. Минимальная чувствительность метода анализа составила 0.03 мкг/мл.

Достоверность результатов количественного определения дииндолилметана в плазме крови оценивали, рассчитывая метрологические характеристики данной методики по результатам 5 параллельных измерений концентраций в трех образцах плазмы крови, которые представлены в таблице 2.

Как следует из данных таблицы 2, показатель, характеризующий точность методики (относительная погрешность среднего значения), составляет 8.36, 0.89, 0.14%. Показатель, характеризующий воспроизводимость методики - относительное стандартное отклонение, составляет 7.27, 0.77, 0.12% для концентрации дииндолилметана 0.03, 0.30 и 2.0 мкг/мл плазмы соответственно.

Содержание препарата в пробах находится в рассчитанных доверительных границах, а методики количественного определения дииндолилметана в плазме крови не зависят от систематических ошибок. Полученные результаты удовлетворяют критериям и нормативам, отраженным в регуляторных требованиях FDA (Analytical Methods Validation: Bioavailability, Bioequivalence and Pharmacokinetic Studies Conference Report - Pharmaceutical Research, Vol.9, №4, 1992).

Для описания фармакокинетики препарата в плазме крови были привлечены следующие показатели (в их условных обозначениях, принятых в литературе (Лабораторный контроль лекарственной терапии. Аналитические процедуры (Под ред. В.В.Меньшикова) Клиническая лабораторная аналитика. М., 1999, т.2. стр.323-346):

β - постоянная убывания на хвосте распределения (ч^-1);

T_max - время максимума концентрации (ч);

C_max - максимальная концентрация (мкг/мл);

AUC₁₂ - площадь под кривой в интервале 0-12 часов (ч·мкг/мл);

AUC_∞ - полная площадь под кривой (ч·мкг/мл);

MRT - среднее время удерживания (присутствия) (ч);

Cl - общий клиренс (мл/ч/кг);

V_ss - стационарный объем распределения (мл/кг);

T_1/2=0.693/β - период полувыведения (ч);

T_эфф = AUC_∞/C_max - эффективная длительность (ч).

Показатели T_max, C_max и β оцениваются из вида кривой концентрации. Исходные формулы для расчета остальных показателей следующие:

где D - введенная доза препарата.

Расчет показателей выполнялся модельно-независимым способом с помощью метода интегральных моментов (Методические рекомендации по проведению качественных клинических исследований биоэквивалентности лекарственных препаратов. Москва. 2004). Используемый метод не опирается ни на какие предположения о внутренних механизмах, лежащих в основе кинетики препаратов, кроме самых общих, и в этом смысле является наиболее устойчивым.

Для расчета использовалась оригинальная программа, разработанная в Институте токсикологии.

Результаты измерения концентрации субстанции дииндолилметана в плазме крови крыс при внутрижелудочном введении представлены в таблице 3.

На рис.1 изображена усредненная динамика концентрации дииндолилметана в плазме крови экспериментальных животных при внутрижелудочном введении субстанции дииндолилметана, 200.0 мг/кг (в линейных координатах), а на рис.2 в логарифмических координатах.

После введения дииндолилметан начинал определяться в системном кровотоке через 15 минут, максимум концентрации наблюдался около 1 часа (0.13-0.17 мкг/мл). Далее концентрация дииндолилметана начинала плавно снижаться и через 12 часов после введения дииндолилметан определялся в крови в минимальных количествах (менее 0.03 мкг/мл). Разброс индивидуальных значений умеренный: коэффициент вариации CV составил 8-22%.

Результаты измерения концентрации дииндолилметана в плазме крови крыс при внутрижелудочном введении капсулы - 1 состав представлены в таблице 4. На рис.3 отображена усредненная динамика концентрации дииндолилметана в плазме крови экспериментальных животных при внутрижелудочном введении капсул 0.10 мг/кг (в линейных координатах), а на рис.4 - в логарифмических координатах.

После введения дииндолилметан начинал определяться в системном кровотоке через 15 минут, максимум концентрации наблюдался около 30 минут (1.6-1.8 мкг/мл), далее концентрация снижалась в 8-9 раз и через 2 часа после введения наблюдался повторный максимум концентрации (0.9-1.2 мкг/мл).

Далее концентрация дииндолилметана начинала плавно снижаться и через 12 часов после введения дииндолилметан определялся в крови в минимальных количествах (около 0.1 мкг/мл). Разброс индивидуальных значений умеренный: коэффициент вариации CV составил 6-30%.

Расчет фармакокинетических показателей выполнен модельно-независимым (прямым) способом на основе метода интегральных моментов. Рассчитанные значения показателей приведены в таблицах 5-7.

Полученные оценки позволяют сделать ряд выводов о фармакокинетике субстанции дииндолилметана при внутрижелудочном введении.

Концентрация дииндолилметана начинает определяться в системном кровотоке через 15 минут. Максимум концентрации C_max достигается через 1 час и составляет порядка 0.15 мкг/мл (0.15±0.01 мкг/мл). Последующее снижение концентрации характеризуется временем половинного убывания Т1/2 порядка 2 часов (2.11±0.04 час). Общее среднее время присутствия препарата в организме - показатель MRT составляет порядка 4.5 часов (4.46±0.16 час). Величина кажущегося стационарного объема распределения - показатель V_ss - составляет порядка 1300 л/кг.

Концентрация дииндолилметана начинает определяться в системном кровотоке через 15 минут. Максимум концентрации C_max достигается через 0.5 час порядка 1.6 мкг/мл (1.56±0.06 мкг/мл) и 2 часа порядка 1.0 мкг/мл (0.98±0.05 мкг/мл). Последующее снижение концентрации характеризуется временем половинного убывания Т1/2 порядка 4 часов (3.89±0.09 час). Общее среднее время присутствия препарата в организме - показатель MRT составляет порядка 6 часов (5.99±0.14 час). Величина кажущегося стационарного объема распределения - показатель Vss - составляет порядка 108 мл/кг.

Результаты исследования сравнительной фармакокинетики и биодоступности субстанции дииндолилметана при внутрижелудочном введении у крыс показали (табл.7):

Субстанция дииндолилметана.

Концентрация дииндолилметана начинает определяться в системном кровотоке через 15 минут. Максимум концентрации Cmax достигается через 1 час и составляет порядка 0.15 мкг/мл (0.15±0.01 мкг/мл). Последующее снижение концентрации характеризуется временем половинного убывания Т1/2 порядка 2 часов (2.11±0.04 час). Общее среднее время присутствия препарата в организме - показатель MRT составляет порядка 4.5 часов (4.46±0.16 час). Величина кажущегося стационарного объема распределения - показатель Vss - составляет порядка 1300 л/кг.

Мягкие желатиновые капсулы.

Концентрация дииндолилметана начинает определяться в системном кровотоке через 15 минут. Максимум концентрации Cmax достигается через 0.5 часа порядка 1.6 мкг/мл (1.52±0.06 мкг/мл) и 2 часа порядка 1.0 мкг/мл (0.98±0.05 мкг/мл). Последующее снижение концентрации характеризуется временем половинного убывания Т1/2 порядка 4 часов (3.89±0.09 час). Общее среднее время присутствия препарата в организме - показатель MRT составляет порядка 6 часов (5.99±0.14 час). Величина кажущегося стационарного объема распределения - показатель Vss - составляет порядка 108 мл/кг.

Полученные результаты свидетельствуют о минимальной биодоступности при внутрижелудочном введении субстанции дииндолилиметана, что, по-видимому, связано с ее практической нерастворимостью в воде, а также с инактивацией активного соединения химической средой ЖКТ. Введение активного вещества в мягких желатиновых капсулах в виде раствора в жидких маслах растительного и животного происхождения не только предохраняет его от воздействия кислой желудочной среды, но и обеспечивает практически 100% биодоступность.

Как видно из представленных данных, поставленная задача решена.

Получено лекарственное средство в виде мягких желатиновых капсул, содержащих 3,3¹-дииндолилметан в виде раствора, позволяющих на порядок увеличить биодоступность действующего вещества, и, как следствие, снизить его дозу. Полученное лекарственное средство нетоксично, безопасно при длительном введении, не обладает местно-раздражающим действием, не оказывает токсического воздействия на иммунную и репродуктивную системы.