Результат интеллектуальной деятельности: Способ идентификации осмотолерантных дрожжей Zygosaccharomyces rouxii на основе ПЦР в реальном времени

Настоящее изобретение относится к микробиологии и касается способов измерения, использующих микроорганизмы, а именно, нуклеиновые кислоты. Данное изобретение может быть использовано в пищевой промышленности, в особенности кондитерской, при идентификации дрожжей Zygosaccharomyces rouxii как во входящем сырье пищевого предприятия, так и на разных этапах производства, включая конечную продукцию.

Zygosaccharomyces rouxii являются осмотолерантными дрожжами. Осмотолерантные дрожжи - организмы, которые способны расти и размножаться в среде с низкой активность воды (Aw) й высоким соотношением углерод-азот (Tilbury R.H. Xerotolerant yeasts at high sugar concentrations. Microbial Growth and Survival in Extremes of Environment ed. Gould, G. W. and Corry J.E.L.. 1980, pp. 103-128). Осмотолерантные дрожжи являются основными организмами, вызывающими порчу таких продуктов как мед, различные виды сиропов, конфеты, джемы, желе (Walker H.W. and Ayres J.C. Yeasts as spoilage organisms. The yeasts, vol. 3. Academic Press, London, ed. Rose A.H. and Harrison J.S. 1970, pp. 463-527), концентрированные фруктовые соки (Combina M. et al. Yeast identification in grape juice concentrates from Argentina. Lett Appl Microbiol. 2007, 46(2): 192-197), сухофрукты (Martorell P. et al. Molecular monitoring of spoilage yeasts during the production of candied fruit nougats to determine food contamination sources. Int J Food Microbiol. 2005, 101(3): 293-302) и т.д. Дрожжи Zygosaccharomyces rouxii являются самыми осмотолератными дрожжами и наиболее часто обнаруживается в пищевых продуктах с высоким содержанием Сахаров (Leandro, MJ. et al. The osmotolerant fructophilic yeast Zygosaccharomyces rouxii employs two plasma-membrane fructose uptake systems belonging to a new family of yeast sugar transporters. Microbiology. 157(2): 601-608) и, соответственно, являются самыми опасными представителями группы осмотолерантных дрожжей, в особенности для кондитерской промышленности. Размножение этого микроорганизма приводит к порче произведенной продукции и ее не соответствию требованиям СанПина.

На данный момент идентификацию дрожжей рода Zygosaccharomyces rouxii в большинстве случаев проводят по морфологическим признакам, что является сложной задачей, которую способен решить только высококвалифицированный микробиолог.

Также, вывить данный организм можно с помощью секвенирования консервативных участков генома. Зачастую необходимо быстро выявить присутствие Zygosaccharomyces rouxii ввиду их быстрого роста в продуктах с высоким содержанием Сахаров, чтобы выявить продукцию, а также входящее сырье, содержащие данный вид дрожжей для дальнейшей ее отбраковки.

Известен способ определения наличия определенных микроорганизмов в биологическом образце (патент RU 2435865, МПК C12Q 1/68, G01N 33/569, G01N 33/543, опубл. 10.12.2011), взятый за прототип, включающий иммобилизацию биологического организма и его ДНК с последующей идентификацией на основе ПНР с генотипирующими праймерами. Недостатком данного способа является низкая видоспецифичность ввиду того, что одни лишь праймеры не обеспечивают высокой специфичности анализа, что может привести к ложноположительным результатам.

Задачей настоящего изобретения является разработка высокоспецифичного и оперативного способа идентификации присутствия дрожжей Zygosaccharomyces rouxii.

Технический результат заключается в разработке высокочувствительного способа и сокращении времени анализа присутствия дрожжей Zygosaccharomyces rouxii с 5 суток до 1 суток (в 5 раз).

Технический результат достигается тем, что в способе идентификации дрожжей Zygosaccharomyces rouxii в продуктах с высоким содержанием Сахаров на основе ПЦР в реальном времени, включающем предварительное обогащение дрожжей, осаждение их центрифугированием, выделение ДНК с проведением ПЦР в реальном времени, согласно изобретению, для амплификации используются праймеры ZygRux-f GACGTGAACTCTTAACGGAG и ZygRux-r GAGAGCAGAACCCTCCC, а также Taqman зонд ZygRux-p FAM CGGAGGAGATTAAAAACAGCCGCGCA BHQ1, где логарифмическое повышение уровня флюоресценции свидетельствует о наличии штамма дрожжей Zygosaccharomyces rouxii.

Предварительно проведен анализ нуклеотидной последовательности участка ДНК, включающего гены 18S рРНК, 5.8Si рРНК и 28S рРНК и межгенные участки ITS1 и ITS2 для дрожжей Zygosaccharomyces rouxii. Установлены консервативные участки для данного таксона, которые позволяют разработать метод экспресс-идентификации дрожжей на основе ПНР в реальном времени с использованием Taqman зонда, представляющего собой олигонуклеотид, к которому присоединены молекула флуорофора и молекула гасителя флуоресценции. При проведении ПЦР гибридизованный с ДНК зонд расщепляется ДНК-полимеразой (вследствие ее экзонуклеазной активности) и высвобождается флуоресцентная метка. Таким образом, наблюдается повышение уровня флуоресценции.

На чертеже приведены кривые флуоресценции ДНК из 8 проб 60%-ого сахарного сиропа, используемого для выращивания колоний шмелей и подкормки медоносных пчел, полученные в ходе проведения ПЦР в реальном времени.

Способ идентификации дрожжей Zygosaccharomyces rouxii с помощью проведения ПЦР в реальном времени с использованием Taqman зонда в представленном способе реализуется следующим образом:

1. Производится сбор биологического материала (сироп, джемы, входящее сырье предприятия и др.). Для анализа используется 1-5 мл биологического материала.

2. Проводится предварительное 18-часовое обогащение образца в среде для культивирования дрожжей и плесени (например, бульон Сабуро). Объемное соотношение пищевой субстрат: среда обогащения составляет не менее 1:10.

3. Проводится осаждение клеток дрожжей с помощью центрифугирования (например, 10000 g, 5 мин), супернатант удаляется.

4. Производится выделение ДНК из осажденных клеток, выделение ДНК можно осуществлять как с помощью коммерческих наборов, так и методами органической экстракции.

5. Проводят ПЦР. Используют следующие температурные циклы: 94°С 4 мин, 35 циклов (94°С 30 сек, 58°С 30 сек, 72°С 30 сек.)

Используются следующие праймеры и зонд:

Прямой GACGTGAACTCTTAACGGAG

Зонд FAM CGGAGGAGATTAAAAACAGCCGCGCA BHQ1

Обратный GAGAGCAGAACCCTCCC

Данные праймеры амплифицируют продукт ПЦР, который содержит нуклеотидные полиморфизмы, характерные только для Zygosaccharomyces rouxii, с которыми взаимодействует Taqman зонд.

6. В случае, если наблюдается логарифмическое повышение уровня флуоресценции в канале FAM амплификатора, это означает, что продукт обсеменен дрожжами Zygosaccharomyces rouxii.

Предлагаемый способ является высокочувствительным, хорошо воспроизводимым и экономичным. Анализ можно проводить в лабораториях, имеющих амплификатор в реальном времени, центрифугу, сопутствующие реактивы и расходные материалы.

Способ поясняется примером:

После предварительного обогащения и выделения ДНК из 8 проб 60% сахарного сиропа был проведен ПЦР в реальном времени (чертеж) В двух пробах (№2 и №5) наблюдался логарифмическое повышения уровня флуоресценции в канале FAM амплификатора, при этом в других пробах (№1, 3, 4, 6-8) не наблюдалось повышение флуоресценции. Следовательно, пробы сиропа №2 и №5 обсеменены дрожжами Zygosaccharomyces rouxii.