Набор синтетических олигонуклеотидов для выявления ДНК Lactobacillus spp. в слизистой оболочке влагалища

Изобретение относится к области лабораторной диагностики, молекулярной биологии и эпидемиологии, и касается синтетических олигонуклеотидов для выявления ДНК Lactobacillus spp. Изобретение предназначено для исследования биологического материала человека, полученного от лиц с подозрением на наличие бактериального вагиноза вне зависимости от формы и наличия манифестации заболевания с целью выявления ДНК Lactobacillus spp. Олигонуклеотиды могут быть использованы для создания набора реагентов для выявления ДНК маркера бактериального вагиноза методом полимеразной цепной реакции. Изобретение позволяет проводить обнаружение указанной бактерии в биологическом материале с высокой точностью.

В последнее время разрабатываются различные специфические олигонуклеотиды для идентификации последовательностей ДНК инфекционных агентов и биологических материалах, в частности ДНК Lactobacillus spp.

Из уровня техники известны следующие патенты по данному направлению:

Известен способ мультилексного определения вульвовагинального кандидоза (VVC), трихомониаза и бактериального вагиноза (BV) [Заявка WO 2016/172204 А1 (Becton, Dickinson And Company, US), опубл. 27.10.2016 г.]. Способ включает постановку полимеразной цепной реакции с набором специфических праймеров и определение продуктов реакции. Перечень микроорганизмов включает, но неограничивается Lactobacillus crispatus, Lactobacillus jensenii., Gardnerella vaginalis, Atopobium vaginae, Megasphaera Type 1, и BVAB2. В документе приведены последовательности праймеров для определения патогенных микроорганизмов и составы неселективных смесей праймеров (таблицы 6а, 6б, 7а и 7б).

Также известен способ проведения количественной ПЦР в режиме реального времени [Заявка WO 02/070751 А1 (University Of Pittsburg Of The Commonwealth System Of Higher Education, US), опубл. 12.09.2002 г.]. В способе используются наборы специфических праймеров для ПЦР. При описании способа заявитель приводит наиболее оптимальные параметры для ПЦР.

Техническим результатом, на достижение которого направлено предлагаемое изобретение, является расширение арсенала средств выявления ДНК Lactobacillus spp.в биологическом материале (отделяемое слизистой оболочки влагалища).

Указанный результат достигается путем использования при постановке ПЦР набора синтетических олигонуклеотидов для выявления ДНК Lactobacillus spp.в области амплификации - 16s rRNA, включающего в себя праймеры следующих последовательностей Seq.N1 и Seq.N2, также используется зонд с флуоресцентной меткой, интенсивность флуоресценции которой свидетельствует о количестве образующегося продукта, Seq.N3:

TTAGCTGCAGCACTGAGAGG Seq.N1

AGGCTCGAAAGCATGGGTAG Seq.N2

ACGGCATGGACTACCAGGGT Seq.N3

Существенным отличием работы с данными праймерами является:

1) Высокая специфичность и чувствительность праймеров в области 16s рибосомальной РНК позволяет выявить ДНК Lactobacillus spp.в биологическом материале при низкой концентрации возбудителя.

2) Для снижения вероятности образования неспецифических продуктов реакции использовали праймеры с высокой температурой отжига.

3) Использование данных праймеров для ПЦР совместимо с образцами ДНК, выделенных с применением коммерческих наборов, таких как «АмплиПрайм^® ДНК-сорб-АМ», «МагноПрайм Юни» и «МагноПрайм Фаст» (ООО «НекстБио» Россия).

Указанный набор синтетических олигонуклеотидов может являться составной частью многосоставных реакционных смесей, реакционных смесей раскапаных под прослойку парафина и лиофильновысушенных реакционных смесей.

Синтетические олигонуклеотиды могут являться составной частью наборов реагентов, предназначенных для определения ДНК Lactobacillus spp., в состав которых входят:

1. ПЦР-смесь, включающая в состав указанные праймеры и зонд, специфические к участку ДНК Lactobacillus spp., смесь дезоксинуклеозидтрифосфатов (дНТФ).

2. ПЦР - буфер.

3. Набор контрольных образцов (положительный контрольный образец (ПК) и отрицательный контрольный образец):

3.1. Положительный контрольный образец (ПК) - смесь бактериофагов λ и плазмид со вставками специфических последовательностей. Положительный контрольный образец вносится в отдельную пробирку с реакционной смесью. Результат амплификации ПК демонстрирует эталонное положительное прохождение реакции, с которым сравниваются результаты амплификации исследуемых образцов.

3.2. Отрицательный контрольный образец - образец, который вводится в эксперимент для контроля возможного загрязнения реактивов продуктами ранее проведенных реакций. Отрицательный контрольный образец вносится в отдельную пробирку с реакционной смесью. Положительный результат в этом образце свидетельствует о необходимости заменить реагенты и переставить эксперимент.

Возможность осуществления заявленного изобретения подтверждается следующими примерами.

Пример 1. Определение наличия ДНК Lactobacillus spp.в биологическом образце с помощью набора синтетических олигонуклеотидов в составе многосоставной реакционной смеси.

Биологический материал (отделяемое слизистой оболочки влагалища) перед проведением ПЦР с помощью предлагаемого набора реагентов проводится через процедуру пробоподготовки с использованием набора реагентов для пробоподготовки, который не является предметом данного патента. В ходе этой процедуры из биологического материала выделяется ДНК, которую, в свою очередь, используют для проведения ПЦР. Вместе с образцами биологического материала процедуру экстракции проходят контрольные образцы - отрицательный контроль и положительный контроль.

Предварительно готовиться реакционная смесь путем смешивания ПЦР-смеси, содержащей специфические синтетические олигонуклеотидные праймеры и зонд, и ПЦР-буфера в объемах, необходимых для исследования образцов биологического материала и контрольных образцов (отрицательный и положительный контроли).

В предварительно подготовленные маркированные пробирки вносится приготовленная реакционная смесь.

В пробирки с реакционной смесью, промаркиованные для образцов биологического материала, вноситься проба ДНК, полученная на этапе экстракции.

В специально промаркированную пробирку вносится проба ДНК, полученная на этапе экстракции из отрицательного контроля.

В специально промаркированную пробирку вносится проба ДНК, полученная на этапе экстракции из положительного контроля.

Установить пробирки в ячейки реакционного модуля прибора, провести амплификацию и выполнить анализ результатов.

Предложенный набор синтетических олигонуклеотидов позволяет определять наличие ДНК Lactobacillus spp.с высокой точностью.

Пример 2. Определение наличия ДНК Lactobacillus spp. в биологическом образце с помощью набора синтетических олигонуклеотидов в составе многосоставной реакционной смеси.

Биологический материал (отделяемое слизистой оболочки влагалища) перед проведением ПЦР проводится через процедуру пробоподготовки с использованием набора реагентов для пробоподготовки. В ходе этой процедуры из биологического материала выделяется ДНК, которую, в свою очередь, используют для проведения ПЦР. Вместе с образцами биологического материала процедуру экстракции проходят контрольные образцы - отрицательный контроль и положительный контроль.

Предварительно готовиться реакционная смесь путем смешивания ПЦР-смеси, содержащей специфические синтетические олигонуклеотидные праймеры и зонд, и ПЦР-буфера в объемах, необходимых для исследования образцов биологического материала и контрольных образцов (отрицательный и положительный контроли).

В предварительно подготовленные маркированные пробирки вносится приготовленная реакционная смесь.

В пробирки с реакционной смесью, промаркированные для образцов биологического материала, вноситься проба ДНК, полученная на этапе экстракции.

В специально промаркированную пробирку вносится проба ДНК, полученная на этапе экстракции из отрицательного контроля.

В специально промаркированную пробирку вносится проба ДНК, полученная на этапе экстракции из положительного контроля.

Установить пробирки в ячейки реакционного модуля прибора, провести амплификацию и выполнить анализ результатов.

Предложенный набор синтетических олигонуклеотидов позволяет определять наличие ДНК Lactobacillus spp.с высокой точностью.

Пример 3. Определение наличия ДНК Lactobacillus spp.в биологическом образце с помощью набора синтетических олигонуклеотидов в составе лиофильновысушенной реакционной смеси

Биологический материал (отделяемое слизистой оболочки влагалища) перед проведением ПЦР проводится через процедуру пробоподготовки с использованием набора реагентов для пробоподготовки. В ходе этой процедуры из биологического материала выделяется ДНК, которую, в свою очередь, используют для проведения ПЦР. Вместе с образцами биологического материала процедуру экстракции проходят контрольные образцы - отрицательный контроль и положительный контроль.

Отобрать необходимое количество пробирок или достать 96-луночный планшет для амплификации с готовой лиофилизированной реакционной смесью для амплификации ДНК исследуемых и контрольных образцов.

В подготовленные пробирки или лунки планшета внести по пробу ДНК, полученную в результате экстракции из исследуемых образцов.

Поставить контрольные реакции:

а) в пробирку или лунку планшета с реакционной смесью внести контрольный образец.

б) в пробирку или лунку планшета с реакционной смесью внести контрольный образец.

в) отрицательный контроль экстракции (ОК) - в пробирку или лунку планшета с реакционной смесью внести пробы, экстрагированной из ОКО.

Установить пробирки или планшет в ячейки реакционного модуля прибора, провести амплификацию и выполнить анализ результатов.

Предложенный набор синтетических олигонуклеотидов позволяет определять наличие ДНК Lactobacillus spp.c высокой точностью.