Набор синтетических олигонуклеотидов для количественного определения ДНК возбудителей вульвовагинального кандидоза в слизистой оболочке влагалища

Изобретение относится к области лабораторной диагностики, молекулярной биологии и эпидемиологии и касается синтетических олигонуклеотидов для выявления ДНК Candida albicans, Candida glabrata, Candida krusei, Candida tropicalis и Candida parapsilosis. Изобретение предназначено для исследования биологического материала человека, полученного от лиц с подозрением на наличие вульвовагинального кандидоза вне зависимости от формы и наличия манифестации заболевания с целью выявления ДНК Candida albicans, Candida glabrata, Candida krusei, Candida tropicalis и Candida parapsilosis. Олигонуклеотиды могут быть использованы для создания набора реагентов для выявления ДНК возбудителей вульвовагинального кандидоза методом полимеразной цепной реакции. Изобретение позволяет проводить обнаружение указанных микроорганизмов в биологическом материале с высокой точностью.

В последнее время разрабатываются различные специфические олигонуклеотиды для идентификации последовательностей ДНК инфекционных агентов и биологических материалах, в частности ДНК Candida albicans, Candida glabrata, Candida krusei, Candida tropicalis и Candida parapsilosis.

Из уровня техники известны дифференцирующие и специфические олигонуклеотиды для идентификации последовательностей ДНК инфекционных агентов в биологических материалах, способ видовой идентификации инфекционных агентов, биочип и набор для осуществления этого способа [Патент России №2348695 (ЗАО Молекулярно-медицинские технологии, RU), опубл. 10.03.2009 г.]. В способе видовой идентификации инфекционных агентов проводят мультиплексную полимеразную цепную реакцию в присутствии специфических олигонуклеотидов в качестве праймеров с последующей гибридизацией ПЦР-продуктов с дифференцирующими олигонуклеотидами на микрочипе и определяют урогенитальную инфекцию по наличию гибридизационных комплексов. Отдельные специфические олигонуклеотиды и дифференцирующие олигонуклеотиды формируют композиции для идентификации Human herpesvirus 5, Human herpesvirus 4, herpesvirus 1 и/или Human herpesvirus 2, Human Streptococcus agalactiae и/или Streptococcus pyogenes, Streptococcus agalactiae, Gardnerella vaginalis, Mycoplasma hominis, Mycoplasma genitalium, Candida albicans, Ureaplasma urealyticum и/или Ureaplasma parvum, Trichomonas vaginalis, Neisseria gonorrhoeae, Chlamydia trachomatis. Указанные специфические олигонуклеотиды и микрочип с дифференцирующими олигонуклеотидами входят в набор для видовой идентификации урогенитальной инфекции.

Также известен способ проведения количественной ПЦР в режиме реального времени. Также описаны наборы специфических праймеров для ПЦР. При описании способа заявитель приводит наиболее оптимальные параметры для ПЦР [Заявка WO 02/070751 А1, (University Of Pittsburg Of The Commonwealth System Of Higher Education, US), опубл. 12.09.2002 г.].

Также известны способы и аппараты для высокочувствительного выявления наличия или отсутствия в биологическом образце микроорганизмов. Способ также включает диагностическую мультиплексную панель для единовременного определения множества микрорганизмов [Заявка на патент США на изобретение US 2016/0108467, (Rochester Investment Partners, GB), опубл. 21.04.2016]. Перечень микроорганизмов включает, но не ограничивается, следующие микрорганизмы: Mycoplasma spp., Chlamydia spp., Ureaplasma spp, Neisseria spp., Gardnerella spp., Trichomonas spp., Treponema spp., Candida albicans: или вирусные патогены, такие как цитомегаловирус (CMV), вирус гепатита (HAV. HBV и HCV и т.д.), вирус гепатита Е (HEV), вирусы гепатита G и GB (GBV-C), вирус иммунодефицита человека (HIV, HIV-1, HIV-2), вирус папилломы человека (HPV), вирус простого герпеса (HSV, HSV-1, HSV-2), и вирус Варицелла-Зостер (VZV). Диагностическая панель может содержать один или более праймеров. Другими заболеваниями, которые можно диагностировать с помощью данной панели являются пищевые отравления, туберкулез, вирус-индуцированные опухоли, энцефалит, малярия, гепатиты, менингиты, лейшманиоз, Африканский трипаносомоз; пневмония; ОРВИ; бешенство; лихорадка долины Рифт, инфекции, вызванные патогенами туляремии; шигелл; ботулизма; желтой лихорадкой; лихорадкой ку; эболой; лихорадкой денге, лихорадкой Западного Нила: дизентерией, кори и тифа. Наиболее предпочтительно диагностическая панель предназначена для совместного выявления Candida albicans, Chlamydia trachomatis, Gardnerella vaginalis, Mycoplasma genitalium, Mycoplasma homittis, Neisseria gonorrhoeae, Trichomonas vaginalis, Treponema pallidum, Ureaplasma urealyticum.

Также известен способ молекулярной диагностики, включающий специфический захват однонитевой целевой нуклеотидной последовательности, который может быть изготовлен из встречающихся в природе нуклеотидов или которые могут быть изготовлены из нуклеотидов, которые не встречаются в природе или любую их смесь, например, ДНК и/или РНК, с помощью дополнительного зонда, содержащего один или более молекулы интеркалятора. Подходит для выявления таких микроорганизмов, как Gardnerella vaginalis, Ureaplasma urealyticum, Mycoplasma hominis, Atopobium vaginae и Candida albicans [US 20130230856, правообладатель Quantibact A/S, DK, от 05.09.2013].

Также известны способы использования образца с множеством аналитических компонентов в диагностике, прогнозе или мониторирования заболеваний, или состояний [US 20150275298, (Stylli Harry, US), от 01.10.2015]. Изобретение относится к способам идентификации маркеров заболеваний или состояний и предназначено для выявления Gardnerella vaginalis, Candida albicans.

Также известны материалы и методы для выявления уникальных сайтов в бактериальной 16S и 23 S rDNA, а также конкретных уникальных последовательностей rDNA 16S в выборе бактерий [ЕР 1473370, (Bio Merieux Inc., US), от 03.11.2004]. Отличительные фрагменты позволят быстро различить семейства, роды, группы, виды, сорта, подвиды и штаммы микроорганизмов. Такая дифференциация может осуществляться с помощью быстрого экранирующих комплектов в сочетании с в silico анализа для диагностических, прогнозтических, эпидемиологических, филогенетических и прочих целей. Предназначено для выявления Gardnerella vaginalis, Candida albicans.

Техническим результатом, на достижение которого направлено предлагаемое изобретение, является расширение арсенала средств выявления ДНК грибов рода Candida, а именно: Candida albicans, Candida glabrata, Candida krusei, Candida tropicalis и Candida parapsilosis в биологическом материале (отделяемое слизистой оболочки влагалища).

Указанный результат достигается путем использования при постановке ПЦР набора синтетических олигонуклеотидов для количественного определения ДНК возбудителей вульвовагинального кандидоза Candida albicans, Candida glabrata, Candida krusei (в области амплификации - ITS-2), Candida tropicalis и Candida parapsilosis (в области амплификации - ITS-1), включающие в себя праймеры следующих последовательностей Seq.N1 - Seq.N6, также используются зонды с флуоресцентной меткой, интенсивность флуоресценции которых свидетельствует о количестве образующегося продукта, Seq.N7 - Seq.N12:

ATTCCGGAGGGCATGCCT Seq.N1

CGATCCCGCCTTACCACTAC Seq.N2

CCATTGTCAAAGCGATCCCG Seq.N3

TCAAAGCGATCCCGCCTTAC Seq.N4

CGTCTGCGGATGGAGAGTGCAA Seq.N5

GAAGTCCGTCAATAGGCCCACAC Seq.N6

ACCGCTGGGTTTGGTGTTGAGC Seq.N7

ACCGCTGGGTTTGGTGTTGAGC Seq.N8

AGGTGTTTTATCACACGACTCGACA Seq.N9

CGTTGGGGGAAAGCTCTCTT Seq.N10

AGTGTAGACACTCAGGAGGCTCCT Seq.N11

CTAGCTGGGCGTCAGGAATCCCAGG Seq.N12

Существенными отличиями работы с данными праймерами являются:

1) Высокая специфичность и чувствительность праймеров в областях амплификации (ITS-2 и ITS-1) позволяет выявить ДНК возбудителей вульвовагинального кандидоза в биологическом материале при низкой концентрации возбудителя.

2) Для снижения вероятности образования неспецифических продуктов реакции использовали праймеры с высокой температурой отжига.

3) Использование данных праймеров для ПЦР совместимо с образцами ДНК, выделенных с применением коммерческих наборов, таких как «АмплиПрайм^® ДНК-сорб-АМ», «МагноПрайм ЮНИ» и «МагноПрайм ФАСТ» (ООО «НекстБио» Россия).

Указанный набор синтетических олигонуклеотидов может являться составной частью многосоставных реакционных смесей, реакционных смесей раскапаных под прослойку парафина и лиофильновысушенных реакционных смесей.

Указанный набор синтетических олигонуклеотидов является составной частью набора следующих веществ:

1. ПЦР-смесь, включающая в состав указанные праймеры и зонды, специфические к участкам ДНК Candida albicans, Candida glabrata, Candida krusei, Candida tropicalis и Candida parapsilosis, смесь дезоксинуклеозидтрифосфатов (дНТФ).

2. ПЦР - буфер.

3. Набор контрольных образцов (положительный контрольный образец и отрицательный контрольный образец):

3.1. Положительный контрольный образец (ПК) - смесь бактериофагов λ и плазмид со вставками специфических последовательностей. Положительный контрольный образец вносится в отдельную пробирку с реакционной смесью. Результат амплификации ПК демонстрирует эталонное положительное прохождение реакции, с которым сравниваются результаты амплификации исследуемых образцов.

3.2. Отрицательный контрольный образец - образец, который вводится в эксперимент для контроля возможного загрязнения реактивов продуктами ранее проведенных реакций. Отрицательный контрольный образец вносится в отдельную пробирку с реакционной смесью. Положительный результат в этом образце свидетельствует о необходимости заменить реагенты и переставить эксперимент.

Пример 1. Определение наличия ДНК возбудителей вульвовагинального кандидоза в биологическом образце с помощью набора синтетических олигонуклеотидов в составе многосоставной реакционной смеси

Биологический материал (отделяемое слизистой оболочки влагалища) перед проведением ПЦР с помощью предлагаемого набора реагентов проводится через процедуру пробоподготовки с использованием набора реагентов для пробоподготовки, который не является предметом данного патента. В ходе этой процедуры из биологического материала выделяется ДНК, которые, в свою очередь, используют для проведения ПЦР. Вместе с образцами биологического материала процедуру экстракции проходят контрольные образцы - отрицательный контроль и положительный контроль.

Предварительно готовиться реакционная смесь путем смешивания ПЦР-смеси, содержащей специфические синтетические олигонуклеотидные праймеры и зонды, и ПЦР-буфера в объемах, необходимых для исследования образцов биологического материала и контрольных образцов (отрицательный и положительный контроли).

В предварительно подготовленные маркированные пробирки вносится приготовленная реакционная смесь.

В пробирки с реакционной смесью, промаркированные для образцов биологического материала, вносятся пробы ДНК, полученные на этапе экстракции.

В специально промаркированную пробирку вносятся пробы ДНК, полученные на этапе экстракции из отрицательного контроля.

В специально промаркированную пробирку вносятся пробы ДНК, полученные на этапе экстракции из положительного контроля.

Установить пробирки в ячейки реакционного модуля прибора, провести амплификацию и выполнить анализ результатов.

Предложенный набор синтетических олигонуклеотидов позволяет определять наличие возбудителей вульвовагинального кандидоза с высокой точностью.

Пример 2. Определение наличия ДНК возбудителей вульвовагинального кандидоза в биологическом образце с помощью набора синтетических олигонуклеотидов в составе реакционной смеси раскапанной под прослойку парафина

Биологический материал (отделяемое слизистой оболочки влагалища) перед проведением ПЦР проводится через процедуру пробоподготовки с использованием набора реагентов для пробоподготовки. В ходе этой процедуры из биологического материала выделяется ДНК, которую, в свою очередь, используют для проведения ПЦР. Вместе с образцами биологического материала процедуру экстракции проходят контрольные образцы - отрицательный контроль и положительный контроль.

Отобрать необходимое количество пробирок с ПЦР-смесью для амплификации ДНК исследуемых и контрольных образцов. Убедиться, что парафин полностью покрывает раствор на дне пробирок.

На поверхность парафина внести буферный раствор с полимеразой, при этом он не должен проваливаться под парафин и смешиваться с ПЦР-смесью.

Внести в подготовленные маркированные пробирки пробы ДНК, полученные в результате экстракции из исследуемых образцов. В специально промаркированную пробирку вносится проба ДНК, полученная на этапе экстракции из отрицательного контроля.

В специально промаркированную пробирку вносятся пробы ДНК, полученные на этапе экстракции из положительного контроля.

Установить пробирки в ячейки реакционного модуля прибора, провести амплификацию и выполнить анализ результатов.

Предложенный набор синтетических олигонуклеотидов позволяет определять наличие возбудителей вульвовагинального кандидоза с высокой точностью.

Пример 3. Определение наличия ДНК возбудителей вульвовагинального кандидоза в биологическом образце с помощью набора синтетических олигонуклеотидов в составе лиофильновысушенной реакционной смеси.

Биологический материал (отделяемое слизистой оболочки влагалища) перед проведением ПЦР проводится через процедуру пробоподготовки с использованием набора реагентов для пробоподготовки. В ходе этой процедуры из биологического материала выделяется ДНК, которую, в свою очередь, используют для проведения ПЦР. Вместе с образцами биологического материала процедуру экстракции проходят контрольные образцы - отрицательный контроль и положительный контроль.

Отобрать необходимое количество пробирок или достать 96-луночный планшет для амплификации с готовой лиофилизированной реакционной смесью для амплификации ДНК исследуемых и контрольных образцов.

В подготовленные пробирки или лунки планшета внести по пробу ДНК, полученную в результате экстракции из исследуемых образцов.

Поставить контрольные реакции:

а) в пробирку или лунку планшета с реакционной смесью внести контрольный образец.

б) в пробирку или лунку планшета с реакционной смесью внести контрольный образец.

в) отрицательный контроль экстракции (ОК) - в пробирку или лунку планшета с реакционной смесью внести пробы, экстрагированные из ОКО.

Установить пробирки или планшет в ячейки реакционного модуля прибора, провести амплификацию и выполнить анализ результатов.

Предложенный набор синтетических олигонуклеотидов позволяет определять наличие возбудителей вульвовагинального кандидоза с высокой точностью.