Набор синтетических олигонуклеотидов для выявления ДНК Atopobium vaginae в слизистой оболочке влагалища

Изобретение относится к области лабораторной диагностики, молекулярной биологии и эпидемиологии. Раскрыты синтетические олигонуклеотиды для выявления ДНК Atopobium vaginae. Изобретение предназначено для исследования биологического материала человека, полученного от лиц с подозрением на наличие бактериального вагиноза вне зависимости от формы и наличия манифестации заболевания с целью выявления ДНК Atopobium vaginae. Олигонуклеотиды могут быть использованы для создания набора реагентов для выявления ДНК маркера бактериального вагиноза - анаэробной бактерии Atopobium vaginae методом полимеразной цепной реакции. Изобретение позволяет проводить обнаружение указанной бактерии в биологическом материале с высокой точностью.

Из уровня техники известны следующие патенты по данному направлению:

Известен способ мультилексного определения вульвовагинального кандидоза (VVC), трихомониаза и бактериального вагиноза (BV) [Заявка WO 2016/172204 А1, (Becton, Dickinson And Company, US) опубл. 27.10.2016 г.], включающий постановку полимеразной цепной реакции с набором специфических праймеров и определение продуктов реакции. Перечень микроорганизмов включает, но неограничивается Lactobacillus crispatus, Lactobacillus jensenii., Gardnerella vaginalis, Atopobium vaginae, Megasphaera Type 1, и BVAB2. В документе приведены последовательности праймеров для определения патогенных микроорганизмов и составы неселективных смесей праймеров (таблицы 6а, 6б, 7а и 76).

Также известен способ проведения количественной ПЦР в режиме реального времени [Заявка WO 02/070751 А1, (University Of Pittsburg Of The Commonwealth System Of Higher Education, US), опубл. 12.09.2002 г.]. Метод включает балансировку двух или более мультиплексированных методов ПЦР. В известном способе последовательные временные стадии ПЦР используются для эффективного разделения двух или более реакций ПЦР в одной пробирке в качестве альтернативы праймеру, ограничивающему модуляцию относительной скорости образования первого ампликона с помощью первого набора праймеров и второго ампликона вторым набором праймеров во время первой и второй ступеней амплификации. Также предлагаются быстрые методы ОТ-ПЦР, которые полезны при интраоперационных диагнозах и прогнозах, например, при диагностике злокачественной аденокарценомы пищевода путем определения уровней экспрессии карциноэмбрионального антигена (СБА) в дозорных лимфатических узлах. Также описаны наборы специфических праймеров для ПЦР. При описании способа заявитель приводит наиболее оптимальные параметры для ПЦР.

Также известен способ молекулярной диагностики, включающий специфический захват однонитевой целевой нуклеотидной последовательности который может быть изготовлен из встречающихся в природе нуклеотидов или которые могут быть изготовлены из нуклеотидов, которые не встречаются в природе или любую их смесь, например, ДНК и/или РНК, с помощью дополнительного зонда, содержащего один или более молекулы интеркалятора [US 20130230856, правообладатель Quantibact A/S, DK, от 05.09.2013]. Способ подходит для выявления таких микроорганизмов, как Gardnerella vaginalis, Ureaplasma urealyticum, Mycoplasma hominis, Atopobium vaginae и Candida albicans.

Также известны методы и олигонуклеотиды для выявления Neisseria gonorrhoeae, а также для выявления Atopobium vaginae [WO/2016/086305, (University of Saskatchewan, CA), от 09.06.2016] Предпочтительные олигонуклеотиды приведены в таблице 2 патентного документа.

Техническим результатом, на достижение которого направлено предлагаемое изобретение, является расширение арсенала средств выявления ДНК Atopobium vaginae в биологическом материале.

Указанный результат достигается путем использования при постановке ПЦР набора синтетических олигонуклеотидов для выявления ДНК Atopobium vaginae в области амплификации - 16s rRNA, включающего в себя праймеры следующих последовательностей Seq.N1 и Seq.N2, также используется зонд с флуоресцентной меткой, интенсивность флуоресценции которой свидетельствует о количестве образующегося продукта, Seq.N3:

AACCCCTATCCGCTCCTGAT Seq.N1

CAGTCATGGCCCAGAAGACC Seq.N2

AGAACACCGGTGGCGAAGGC Seq.N3

Существенным отличием работы с данными праймерами является:

1) Высокая специфичность и чувствительность праймеров в области 16s рибосомальной РНК позволяет выявить ДНК Atopobium vaginae в биологическом материале при низкой концентрации возбудителя.

2) Для снижения вероятности образования неспецифических продуктов реакции использовали праймеры с высокой температурой отжига.

3) Использование данных праймеров для ПЦР совместимо с образцами ДНК, выделенных с применением коммерческих наборов, таких как «АмплиПрайм^® ДНК-сорб-АМ», «МагноПрайм Юни» и «МагноПрайм Фаст» (ООО «НекстБио» Россия).

Указанный набор синтетических олигонуклеотидов может являться составной частью многосоставных реакционных смесей, реакционных смесей раскапаных под прослойку парафина и лиофильновысушенных реакционных смесей.

Синтетические олигонуклеотиды могут являться составной частью наборов реагентов, предназначенных для определения ДНК Atopobium vaginae, в состав которых входят:

1. ПЦР-смесь, включающая в состав указанные праймеры и зонд, специфические к участку ДНК Atopobium vaginae, смесь дезоксинуклеозидтрифосфатов (дНТФ).

2. ПЦР-буфер.

3. Набор контрольных образцов (положительный контрольный образец (ПК) и отрицательный контрольный образец):

3.1. Положительный контрольный образец (ПК) - смесь бактериофагов X и плазмид со вставками специфических последовательностей. Положительный контрольный образец вносится в отдельную пробирку с реакционной смесью. Результат амплификации ПК демонстрирует эталонное положительное прохождение реакции, с которым сравниваются результаты амплификации исследуемых образцов.

3.2. Отрицательный контрольный образец - образец, который вводится в эксперимент для контроля возможного загрязнения реактивов продуктами ранее проведенных реакций. Отрицательный контрольный образец вносится в отдельную пробирку с реакционной смесью. Положительный результат в этом образце свидетельствует о необходимости замены реагентов и необходимости переставить эксперимент.

Возможность осуществления заявленного изобретения подтверждается следующими примерами.

Пример 1. Определение наличия ДНК Atopobium vaginae в биологическом образце с помощью набора синтетических олигонуклеотидов в составе многосоставной реакционной смеси.

Биологический материал (отделяемое слизистой оболочки влагалища) перед проведением ПЦР с помощью предлагаемого набора реагентов проводится через процедуру пробоподготовки с использованием набора реагентов для пробоподготовки, который не является предметом данного патента. В ходе этой процедуры из биологического материала выделяется ДНК, которую, в свою очередь, используют для проведения ПЦР. Вместе с образцами биологического материала процедуру экстракции проходят контрольные образцы - отрицательный контроль и положительный контроль.

Предварительно готовится реакционная смесь путем смешивания ПЦР-смеси, содержащей специфические синтетические олигонуклеотидные праймеры и зонд, и ПЦР-буфера в объемах, необходимых для исследования образцов биологического материала и контрольных образцов (отрицательный и положительный контроли).

В предварительно подготовленные маркированные пробирки вносится приготовленная реакционная смесь.

В пробирки с реакционной смесью, промаркированные для образцов биологического материала, вносится проба ДНК, полученная на этапе экстракции.

В специально промаркированную пробирку вносится проба ДНК, полученная на этапе экстракции из отрицательного контроля.

В специально промаркированную пробирку вносится проба ДНК, полученная на этапе экстракции из положительного контроля.

Установить пробирки в ячейки реакционного модуля прибора, провести амплификацию и выполнить анализ результатов.

Предложенный набор синтетических олигонуклеотидов позволяет определять наличие Atopobium vaginae с высокой точностью.

Пример 2. Определение наличия ДНК Atopobium vaginae в биологическом образце с помощью набора синтетических олигонуклеотидов в составе реакционной смеси раскапаной под прослойку парафина.

Биологический материал (отделяемое слизистой оболочки влагалища) перед проведением ПЦР проводится через процедуру пробоподготовки с использованием набора реагентов для пробоподготовки. В ходе этой процедуры из биологического материала выделяется ДНК, которую, в свою очередь, используют для проведения ПЦР. Вместе с образцами биологического материала процедуру экстракции проходят контрольные образцы - отрицательный контроль и положительный контроль.

Отобрать необходимое количество пробирок с ПЦР-смесью для амплификации ДНК исследуемых и контрольных образцов. Убедиться, что парафин полностью покрывает раствор на дне пробирок.

На поверхность парафина внести буферный раствор с полимеразой, при этом он не должен проваливаться под парафин и смешиваться с ПЦР-смесью.

Внести в подготовленные маркированные пробирки пробы ДНК, полученные в результате экстракции из исследуемых образцов. В специально промаркированную пробирку вносится проба ДНК, полученная на этапе экстракции из отрицательного контроля.

В специально промаркированную пробирку вносится проба ДНК, полученная на этапе экстракции из положительного контроля.

Установить пробирки в ячейки реакционного модуля прибора, провести амплификацию и выполнить анализ результатов.

Предложенный набор синтетических олигонуклеотидов позволяет определять наличие ДНК Atopobium vaginae с высокой точностью.

Пример 3. Определение наличия ДНК Atopobium vaginae в биологическом образце с помощью набора синтетических олигонуклеотидов в составе лиофильновысушенной реакционной смеси.

Биологический материал (отделяемое слизистой оболочки влагалища) перед проведением ПЦР проводится через процедуру пробоподготовки с использованием набора реагентов для пробоподготовки. В ходе этой процедуры из биологического материала выделяется ДНК, которую, в свою очередь, используют для проведения ПЦР. Вместе с образцами биологического материала процедуру экстракции проходят контрольные образцы - отрицательный контроль и положительный контроль.

Отобрать необходимое количество пробирок или достать 96-луночный планшет для амплификации с готовой лиофилизированной реакционной смесью для амплификации ДНК исследуемых и контрольных образцов.

В подготовленные пробирки или лунки планшета внести по пробу ДНК, полученную в результате экстракции из исследуемых образцов.

Поставить контрольные реакции:

а) в пробирку или лунку планшета с реакционной смесью внести контрольный образец.

б) в пробирку или лунку планшета с реакционной смесью внести контрольный образец.

в) отрицательный контроль экстракции (ОК) - в пробирку или лунку планшета с реакционной смесью внести пробы, экстрагированной из ОКО.

Установить пробирки или планшет в ячейки реакционного модуля прибора, провести амплификацию и выполнить анализ результатов.

Предложенный набор набор синтетических олигонуклеотидов позволяет определять наличие ДНК Atopobium vaginae с высокой точностью.