Результат интеллектуальной деятельности: Набор синтетических олигонуклеотидов для выявления ДНК Gardnerella vaginalis в слизистой оболочке влагалища

Изобретение относится к области лабораторной диагностики, молекулярной биологии и эпидемиологии, и касается синтетических олигонуклеотидов для выявления ДНК Gardnerella vaginalis. Изобретение предназначено для исследования биологического материала человека, полученного от лиц с подозрением на наличие бактериального вагиноза вне зависимости от формы и наличия манифестации заболевания с целью выявления ДНК Gardnerella vaginalis. Олигонуклеотиды могут быть использованы для создания набора реагентов для выявления ДНК маркера бактериального вагиноза методом полимеразной цепной реакции. Изобретение позволяет проводить обнаружение указанной бактерии в биологическом материале с высокой точностью.

В последнее время разрабатываются различные специфические олигонуклеотиды для идентификации последовательностей ДНК инфекционных агентов и биологических материалах, в частности ДНК Gardnerella vaginalis.

Известен способ молекулярной диагностики, включающий специфический захват однонитевой целевой нуклеотидной последовательности, который может быть изготовлен из встречающихся в природе нуклеотидов или которые могут быть изготовлены из нуклеотидов, которые не встречаются в природе или любую их смесь, например, ДНК и/или РНК, с помощью дополнительного зонда, содержащего один или более молекулы интеркалятора (US 2013/0230856, (Quantibact A/S, DK), 05.09.2013). Заявленный способ подходит для выявления таких микроорганизмов, как Gardnerella vaginalis, Ureaplasma urealyticum, Mycoplasma hominis, Atopobium vaginae и Candida albicans.

Известны дифференцирующие и специфические олигонуклеотиды для идентификации последовательностей ДНК инфекционных агентов в биологических материалах, способ видовой идентификации инфекционных агентов, биочип и набор для осуществления этого способа (Патент России №2348695, опубл. 10.03.2009 г., Бюл. №7, (ЗАО Молекулярно-медицинские технологии, RU). Для идентификации возбудителя используют следующие последовательности: спейсер между генами 16S-23S рРНК (16S-23S ITS) и ген белка 60 теплового шока (hsp60). В способе видовой идентификации инфекционных агентов проводят мультиплексную полимеразную цепную реакцию в присутствии специфических олигонуклеотидов в качестве праймеров с последующей гибридизацией ПЦР-продуктов с дифференцирующими олигонуклеотидами на микрочипе и определяют урогенитальную инфекцию по наличию гибридизационных комплексов. Указанные специфические олигонуклеотиды входят в набор для видовой идентификации урогенитальной инфекции.

Также известен способ мультиплексного определения вульвовагинального кандидоза (VVC), трихомониаза и бактериального вагиноза (BV) (WO 2016/172204 А1, Becton, Dickinson And Company, US, опубл. 27.10.2016 г.). Способ включает постановку полимеразной цепной реакции с набором специфических праймеров из 16S рРНК «HINGVFW», «HINGVRV», «GV1FW», «GV3RV» и определение продуктов реакции. Перечень микроорганизмов включает, но не ограничивается Gardnerella vaginalis. Данный способ видовой идентификации микроорганизмов является ближайшим аналогом заявленного изобретения. Недостатком известного решения является недостаточная чувствительность применения метода детекции для выявления ДНК Gardnerella vaginalis в биологическом материале.

Техническим результатом, на достижение которого направлено предлагаемое изобретение, является расширение арсенала средств выявления ДНК Gardnerella vaginalis в биологическом материале.

Указанный результат достигается путем использования при постановке ПЦР набора синтетических олигонуклеотидов для выявления ДНК Gardnerella vaginalis в области амплификации - 16s rRNA, включающего в себя праймеры следующих последовательностей Seq. N1 и Seq. N2, также используется зонд с флуоресцентной меткой, интенсивность флуоресценции которой свидетельствует о количестве образующегося продукта, Seq.N3:

AGGGCGTATTGGTTGGATGC Seq. N1

CCTCGGATCAAAGCCCACTC Seq. N2

CGGGCTGCGATATGCCTCGG Seq. N3

Существенным отличием работы с данными праймерами является:

1) Высокая специфичность и чувствительность праймеров в области 16s рибосомальной РНК позволяет выявить ДНК Gardnerella vaginalis в биологическом материале при низкой концентрации возбудителя.

2) Для снижения вероятности образования неспецифических продуктов реакции использовали праймеры с высокой температурой отжига.

3) Использование данных праймеров для ПЦР совместимо с образцами ДНК, выделенных с применением коммерческих наборов, таких как «АмплиПрайм^® ДНК-сорб-АМ», «МагноПрайм ЮНИ» и «МагноПрайм ФАСТ» (ООО «НекстБио» Россия).

Указанный набор синтетических олигонуклеотидов может являться составной частью многосоставных реакционных смесей, реакционных смесей раскапаных под прослойку парафина и лиофильно высушенных реакционных смесей.

Синтетические олигонуклеотиды могут являться составной частью наборов реагентов, предназначенных для определения ДНК Gardnerella vaginalis, в состав которых входят:

1. ПЦР-смесь, включающая в состав указанные праймеры и зонд, специфические к участку ДНК Gardnerella vaginalis, смесь дезоксинуклеозидтрифосфатов (дНТФ).

2. ПЦР-буфер.

3. Набор контрольных образцов (положительный контрольный образец (ПК) и отрицательный контрольный образец):

3.1. Положительный контрольный образец (ПК) - смесь бактериофагов λ и плазмид со вставками специфических последовательностей. Положительный контрольный образец вносится в отдельную пробирку с реакционной смесью. Результат амплификации ПК демонстрирует эталонное положительное прохождение реакции, с которым сравниваются результаты амплификации исследуемых образцов.

3.2. Отрицательный контрольный образец - образец, который вводится в эксперимент для контроля возможного загрязнения реактивов продуктами ранее проведенных реакций. Отрицательный контрольный образец вносится в отдельную пробирку с реакционной смесью. Положительный результат в этом образце свидетельствует о необходимости замены реагентов и необходимости переставить эксперимент.

Возможность осуществления заявленного изобретения подтверждается следующими примерами.

Пример 1. Определение наличия ДНК Gardnerella vaginalis в биологическом образце с помощью набора синтетических олигонуклеотидов в составе многосоставной реакционной смеси.

Биологический материал (отделяемое слизистой оболочки влагалища) перед проведением ПЦР проводится через процедуру пробоподготовки с использованием набора реагентов для пробоподготовки. В ходе этой процедуры из биологического материала выделяется ДНК, которую, в свою очередь, используют для проведения ПЦР. Вместе с образцами биологического материала процедуру экстракции проходят контрольные образцы - отрицательный контроль и положительный контроль.

Предварительно готовится реакционная смесь путем смешивания ПЦР-смеси, содержащей специфические синтетические олигонуклеотидные праймеры и зонд, и ПЦР-буфера в объемах, необходимых для исследования образцов биологического материала и контрольных образцов (отрицательный и положительный контроли).

В предварительно подготовленные маркированные пробирки вносится приготовленная реакционная смесь.

В пробирки с реакционной смесью, промаркированные для образцов биологического материала, вносится проба ДНК, полученная на этапе экстракции.

В специально промаркированную пробирку вносится проба ДНК, полученная на этапе экстракции из отрицательного контроля.

В специально промаркированную пробирку вносится проба ДНК, полученная на этапе экстракции из положительного контроля.

Установить пробирки в ячейки реакционного модуля прибора, провести амплификацию и выполнить анализ результатов.

Предложенный набор синтетических олигонуклеотидов позволяет определять наличие Gardnerella vaginalis с высокой точностью.

Пример 2. Определение наличия ДНК Gardnerella vaginalis в биологическом образце с помощью набора синтетических олигонуклеотидов в составе реакционной смеси раскапаной под прослойку парафина.

Биологический материал (отделяемое слизистой оболочки влагалища) перед проведением ПЦР проводится через процедуру пробоподготовки с использованием набора реагентов для пробоподготовки. В ходе этой процедуры из биологического материала выделяется ДНК, которую, в свою очередь, используют для проведения ПЦР. Вместе с образцами биологического материала процедуру экстракции проходят контрольные образцы - отрицательный контроль и положительный контроль.

Отобрать необходимое количество пробирок с ПЦР-смесью для амплификации ДНК исследуемых и контрольных образцов. Убедиться, что парафин полностью покрывает раствор на дне пробирок.

На поверхность парафина внести буферный раствор с полимеразой, при этом он не должен проваливаться под парафин и смешиваться с ПЦР-смесью.

Внести в подготовленные маркированные пробирки пробы ДНК, полученные в результате экстракции из исследуемых образцов. В специально промаркированную пробирку вносится проба ДНК, полученная на этапе экстракции из отрицательного контроля.

В специально промаркированную пробирку вносится проба ДНК, полученная на этапе экстракции из положительного контроля.

Установить пробирки в ячейки реакционного модуля прибора, провести амплификацию и выполнить анализ результатов.

Предложенный набор синтетических олигонуклеотидов позволяет определять наличие ДНК Gardnerella vaginalis с высокой точностью.

Пример 3. Определение наличия ДНК Gardnerella vaginalis в биологическом образце с помощью набора синтетических олигонуклеотидов в составе лиофильновысушенной реакционной смеси

Биологический материал (отделяемое слизистой оболочки влагалища) перед проведением ПЦР проводится через процедуру пробоподготовки с использованием набора реагентов для пробоподготовки. В ходе этой процедуры из биологического материала выделяется ДНК, которую, в свою очередь, используют для проведения ПЦР. Вместе с образцами биологического материала процедуру экстракции проходят контрольные образцы - отрицательный контроль и положительный контроль.

Отобрать необходимое количество пробирок или достать 96-луночный планшет для амплификации с готовой лиофилизированной реакционной смесью для амплификации ДНК исследуемых и контрольных образцов.

В подготовленные пробирки или лунки планшета внести по пробу ДНК, полученную в результате экстракции из исследуемых образцов.

Поставить контрольные реакции:

а) в пробирку или лунку планшета с реакционной смесью внести контрольный образец.

б) в пробирку или лунку планшета с реакционной смесью внести контрольный образец.

в) отрицательный контроль экстракции (ОК) - в пробирку или лунку планшета с реакционной смесью внести пробы, экстрагированной из ОКО.

Установить пробирки или планшет в ячейки реакционного модуля прибора, провести амплификацию и выполнить анализ результатов.

Предложенный набор синтетических олигонуклеотидов позволяет определять наличие ДНК Gardnerella vaginalis с высокой точностью.