Способ оценки лекарственной чувствительности Mycobacnerium tuberculosis на основе результатов определения иммунологических показателей крови у больного туберкулезом легких человека

Изобретение относится к медицине, а именно к клинической лабораторной диагностике, и может быть использовано для оценки чувствительности к лекарственным препаратам без проведения длительных бактериологических тестов, основанных на изучении задержки роста культуры в присутствии тестируемых лекарственных средств или проведения молекулярно-генетических тестов, ограниченных узким кругом выявляемых мутаций, определяющих устойчивость патогена. Важность разработки способа определяется необходимостью скорейшего назначения стандартной схемы лекарственной терапии с учетом установленной чувствительности возбудителя для достижения оптимального результата лечения, что позволит экономить бюджетные деньги, выделяемые на восстановление здоровья у данной категории больных.

Известно, что лекарственная чувствительность - свойство, характеризующее микроорганизм. Определение лекарственной чувствительности - это выявление «возможности применения стандартной химиотерапии показанным препаратом для лечения заболевания, вызванного выделенным штаммом» [1]. Противоположное понятие - устойчивость - «предсказывает неудачу лечения тестируемым химиопрепаратом». Существующие в настоящее время способы определения лекарственной чувствительности основываются на непосредственном изучении особенностей возбудителя и делятся на 2 категории: культуральные и молекулярно-генетические [2].

Культуральные методы дифференцируются на виды прямого и непрямого определения. Прямое определение может осуществляться культивированием на плотных или жидких питательных средах. Возможны автоматизированные и неавтоматизированные способы проведения анализа.

При прямом определении исследуемый материал с высевают на среду, содержащую / не содержащую лекарственный препарат, инкубируют в изотермических условиях, результат фиксируют путем подсчета количества колоний с последующим расчетом лекарственной чувствительности. Недостатками способа являются: высокий риск контаминации, невозможность получения результата в случае отсутствия роста культуры, низкая воспроизводимость результатов, необходимость предварительной подготовки образца - гомогенизация, обеззараживание, недозированный посев (повышает риск инфицирования исследователя), длительность исследования (2-3 недели).

При непрямом определении (метод пропорций, метод коэффициента устойчивости, метод абсолютных концентраций) проводится предварительный этап культивирования образца на бульоне с последующим высевом на среды, как в прямом определении. Недостатками являются: значительное удлинение времени получения результата (в некоторых случаях до 40 суток), необходимость большего количества расходных материалов для выполнения исследования и вышеописанные ограничения.

Одним из примеров использования культуральных методов является способ определения чувствительности микроорганизмов с множественной лекарственной устойчивостью к сочетаниям антибактериальных препаратов (Пат. №2388827, авторы: Панина Т.А., Ефанова Л.И., Давыдова В.В.), включающий посев в пробирку с мясопептонным бульоном исследуемой культуры микроорганизмов, внесение антибактериальных препаратов, инкубирование в течение 12-18 ч в термостате при температуре 36±1°С, последующую визуальную оценку прозрачности содержимого пробирки, отличающийся тем, что для исследования используются пропитанные антибактериальным препаратом стандартные бумажные диски, для каждого сочетания берется одна пробирка с мясопептонным бульоном, после инкубирования при визуальном отсутствии мутности в исследуемой пробирке делают вывод о чувствительности микроорганизмов к сочетанию антибактериальных препаратов. Недостатком данного способа является применимость его для микроорганизмов с множественной лекарственной устойчивостью, не показана его применимость для микроорганизмов с неустановленной лекарственной чувствительностью.

Другим примером использования культурального метода определения лекарственной чувствительности является применение автоматизированных и полуавтоматизированных систем типа ВАСТЕС 460ТВ и др. Существенным недостатком их употребления являются высокая стоимость расходных материалов, необходимость контроля качества каждой серии пробирок, длительность исследования - до 2-3 недель, а также необходимость предварительной подготовки образцов (разведение, деконтаминация, концентрация).

Существует модификация культурального метода исследования для оценки лекарственной чувствительности с использованием реактива Грисса. Она заключается в определении нитратредуктазной активности , результатом которой становится изменение цвета реактива, содержащей питательную среду с патогеном. Недостатками метода являются длительность получения результатов (8-12 суток), необходимость большого количества реагентов, значительное количество манипуляций при выполнении исследования [3].

В целом, бактериальная диагностика имеет следующие недостатки [4]: необходимость использования для работы специализированного оборудования - шкафов биологической безопасности 2 класса, обеспечивающих защиту оператора и сохранность биообразца от контаминации, необходимость использования чистых субстанций противотуберкулезных препаратов (риск аллергических реакций у оператора), вариабельность активности лекарственного препарата в разных сериях производителя, зависимость результатов тестирования от качества питательной среды и стабильности растворов лекарственных препаратов, вероятность инактивации некоторых лекарственных препаратов под воздействием ряда компонентов сред, нестабильность лекарственных препаратов как соединений в результате стерилизации и хранения, необходимость перерасчета концентрации лекарственного вещества в соединениях солей, так как активные субстанции составляют только часть изучаемой массы (сульфаты, гидрохлориды), влияние на результат концентрации вносимых микроорганизмов (увеличение числа стимулирует лекарственную устойчивость), зависимость результата от возраста культуры, длительности инкубации, необходимость дополнительного пересева культуры в случае ее невыраженного роста.

Другая группа способов выявления лекарственной чувствительности основана на использовании молекулярно-генетических методов, которые дают возможность устанавливать субстрат изменений, приводящих к возникновению устойчивости, а именно определять мутации в геноме микроорганизма. Известны четыре основных типа вышеупомянутой технологии: использование картриджей, стриповый метод, применение биочипов и рутинная ПЦР (полимеразная цепная реакция). Недостатками данной группы методов являются отсутствие перечня всех известных существующих мутаций, что ограничивает применение технологии в клинике, необходимость организационно-пространственного оформления лаборатории для выполнения исследований такого вида, наличие обученного персонала, дорогостоящего оборудования, реагентов и одноразовых расходных материалов. Кроме того, эта группа методов не может быть использована при отсутствии у больного бактериовыделения, что в клинической практике не является редкостью. Такое состояние может встречаться, например, при снижении дренажа бронхов. Последнее может приводить к получению ложно-отрицательных результатов и необходимости хирургического или эндоскопического вмешательства для получения материала исследования.

Примером использования молекулярно-генетических методов является имеющаяся тест-система «ТБ-Биочип», позволяющая обнаруживать лекарственную устойчивость штаммов возбудителя туберкулеза к рифампицину и изониазиду менее, чем за сутки [5]. Недостатками данного метода являются необходимость наличия полного комплекса условий для проведения ПЦР-анализа.

Другим примером является метод Xpert MTB/RIF, представляющий автоматизированный молекулярный тест на определение рифампициновой устойчивости. Достоинства: скорость исследования - менее 2 часов, высокая чувствительность и специфичность. Недостатки метода: высокая стоимость анализов, «закрытая система» - невозможность использования расходных материалов другого производителя, невозможность определения множественной лекарственной устойчивости.

Существует способ, основанный на использовании рутинной ПЦР для выявления лекарственной устойчивости микроорганизма [6]. Исследуемый образец клинического материала при этом становится источником ДНК-мишени для реакции, а откопированный ПЦР-продукт подвергается анализу с целью выявления мутаций, связанных с антибиотикорезистентностъю. Достоинствами способа являются высокая скорость проведения анализа (1 сутки). Недостатки: необходимость специальных помещений, оборудования и материалов для проведения ПЦР-анализа, высокий риск заражения оператора туберкулезом.

Таким образом, в настоящее время ведущим в оценке лекарственной чувствительности остается культуральный метод исследования [7]. Однако, имея информацию о том, что лекарственная чувствительность является свойством микроорганизма и, опираясь на данные о длительном существовании патогена в организме человека после его проникновения внутрь, можно утверждать, что взаимоотношения возбудителя заболевания и макроорганизма имеют эволюционно-сформированный устойчивый характер. Результатом последнего становится факт ухода из-под контроля иммунной системы, в том числе, с отбором лекарственно устойчивых форм для пребывания внутри организма в течение значительного временного промежутка. Исходя из вышеизложенного, можно утверждать, что лекарственную чувствительность патогена можно оценить, изучая данные реакции иммунологической системы инфицированного человека.

В настоящее время существует достаточно сведений, характеризующих нарушения деятельности иммунной системы при наличии лекарственно устойчивых [8, 9], вместе с тем, технические решения, формулирующие способы оценки чувствительности возбудителя, полагающиеся на данные иммунологических исследований, ограничены.

Существует иммунологический метод оценки лекарственной чувствительности на основании определения уровня стимулированной продукции IL-2 (при лекарственно чувствительном туберкулезе легких уровень IL-2 выше), и IL-2-секретирующей реактивности лимфоцитов крови (повышается при лекарственно устойчивом туберкулезе) [10]. Недостатками метода является отсутствие четких критериев изменения показателей, необходимость культивирования лейкоцитов, необходимость работы с белковым и липидным антигеном, выделенным из , вакцинным штаммом БЦЖ, сложности стандартизации метода, трудности в использовании способа лабораториями лечебных учреждений (необходим квалифицированный персонал).

Известен способ оценки лекарственной чувствительности, заключающийся в определении уровня липополисахарид (ЛПС) - стимулированной продукции NO у впервые выявленных больных распространенным деструктивным туберкулезом с последующим расчетом формулы прогноза по уравнению у = ехр (10,4271+(-96,495)*х)/(1+ехр(10,4271+(-96,495)*х)) [11], позволяющий прогнозировать вероятность наличия туберкулеза с множественной лекарственной устойчивостью (МЛУ). В частности, вероятность наличия туберкулеза с МЛУ, равная 80%, отмечается при ЛПС-стимулированной продукции NO-мононуклеарами крови ≤0,1 моль/мл, равная 100% - при ЛПС-активированной выработке радикала ≤0,05 моль/л.

Недостатками данного метода являются: необходимость предварительного выделения мононуклеаров крови на градиенте плотности, которое не гарантирует отсутствия тромбоцитов и нейтрофилов (являются значительными продуцентами NO, что может искажать результат исследования в зависимости от их количества в пробе, снижается точность исследования). Оксид азота быстро окисляется до нитритов/нитратов кислородом (период его полураспада составляет от менее 1 секунды в присутствии гемоглобина до 30 секунд [12], следовательно, его концентрация существенно зависит от времени выполнения анализа после взятия крови (снижает точность исследования); высокая вероятность расхождения в полученных результатах, так как реакция Грисса является двухступенчатой, сложности в стандартизации ЛПС разных серий производителя; необходимость самостоятельного приготовления реагентов, увеличивающая погрешность исследования (в частности, готовится питательная среда, содержащая RPMI-1640, инактивированную эмбриональную телячью сыворотку, L-глутамин, гентамицин, HEPES); невысокая диагностическая специфичность способа - 79%.

Наиболее близким аналогом, принятым за прототип, является способ оценки лекарственной чувствительности Mycobacterium tuberculosus на основе результатов определения иммунологических показателей крови у больного туберкулезом легких человека, включающий исследование с определением уровня спонтанной продукции TNF-α in vitro. Величина более 165 пг/мл позволяет прогнозировать наличие МЛУ Mycobacterium tuberculosus (http://www.dissercat.com/content/faktorv-riska-assotsiirovannye-s-mnozhestvenno-lekarstvenno-ustoichivym-tuberkulezom).

Известный способ имеет следующие недостатки:

- длительность получения супернатанта для непосредственного определения TNF;

- трудоемкость преаналитического этапа (получения супернатанта);

- необходимость специального оборудования для культивирования (СО₂-инкубатор);

- необходимость использования одноразовой посуды и расходных материалов;

- необходимость использования большого количества дополнительных реагентов (соли, среды, сыворотки);

- отсутствует информация о стандартизации супернатантов из разных образцов (в автореферате на стр. 30 упоминается о значительной вариабельности («показатель относительного риска развития МЛУ ТБ на фоне увеличения продукции TNF c выше 165 пг/мл был высоким, однако имел значительный разброс»).

Задачей и техническим результатом заявляемого изобретения является снижение времени на получение результата исследования при оценке чувствительности к лекарственным препаратам, снижение трудоемкости (упрощение способа), уменьшение вариабельности данных между образцами.

Для решения поставленной задачи в способе оценки лекарственной чувствительности Mycobacterium tuberculosus на основе результатов определения иммунологических показателей крови у больного туберкулезом легких человека, включающем исследование крови, согласно изобретению устанавливают абсолютное количество фагоцитирующих гранулоцитов и Т-лимфоцитов, экспрессирующих маркер поздней активации HLA-DR-Ag с подсчетом результата по формуле Y=1,76-5,08X1-0,17X2, где X1 - CD3⁺HLA-DR⁺(10⁹/лист), Х2 - количество фагоцитирующих гранулоцитов (10⁹/литр) и при значении Y<1 делают заключение о наличии лекарственно чувствительных изолятов возбудителя туберкулеза, a Y≥1 – изолятов, не имеющих лекарственной чувствительности (устойчивые изоляты).

Заявляемый способ осуществляют следующим образом. У пациента, имеющего , утром, натощак, до начала лечения и проведения физиотерапевтических процедур берут венозную кровь из локтевой вены в пробирку с антикоагулянтом (гепарин) с соблюдением правил асептики и антисептики. Достаточное для исследования количество биологической жидкости составляет 1 мл. Определение количества фагоцитирующих гранулоцитов проводят методом проточной цитофлюориметрии, применяя тест-систему любого производителя, например - Phagotest (Glycotope Biotechnology, Germany). Популяцию Т-лимфоцитов, экспрессирующих маркер поздней активации HLA-DR-Ag (CD3+HLA-DR+), используя проточный цитофлюориметр и моноклональные антитела любой доступной марки, например, Beckman Coulter (USA). Полученные значения количества CD3⁺HLA-DR⁺ и числа фагоцитирующих гранулоцитов включают в выражение Y=1,76-5,08X1-0,17X2, где X1 - CD3⁺HLA-DR⁺(10⁹/л), Х2 - фагоцитирующие гранулоциты (10⁹/л). Значение Y<1 свидетельствует о наличии лекарственно чувствительных изолятов возбудителя туберкулеза, а Y≥1 - не имеющих лекарственной чувствительности (устойчивые изоляты).

Для выявления предлагаемой закономерности проводилось исследование крови у 12 больных инфильтративным туберкулезом легких с лекарственно устойчивыми изолятами и 17 больных, не имеющих лекарственной чувствительности (изоляты с множественной лекарственной устойчивостью). Средний возраст обследованных составил 35,6±2,0 года. Из них было 18(61,0%) мужчин и 11(39,0%) женщин. Контрольную группу составили 25 практически здоровых доноров со средним возрастом 36,0±2,8 лет. Из них было 15(60,0%) мужчин и 10(40,0%) женщин. Установлено, что при наличии лекарственной чувствительных изолятов фагоцитарная активность гранулоцитов увеличивается, на Т-лимфоцитах наблюдается повышение экспрессии маркеров активации (HLA-DR), туберкулез, вызванный изолятами , не имеющими лекарственной чувствительности (с множественной лекарственной устойчивостью), характеризуется снижением фагоцитарной активности гранулоцитов и экспрессии HLA-DR на Т-лимфоцитах. Используя регрессионный метод, было проведено статистическое исследование для поиска взаимосвязи иммунологических показателей с наличием лекарственной чувствительности возбудителя. Сравнение данных пациентов с лекарственно чувствительными изолятами и пациентов, у которых туберкулез был вызван с изолятами, не имеющими лекарственной чувствительности (с множественной лекарственной устойчивостью), было получено регрессионное уравнение Y=1,76-5,08X1-0,17X2, где X1 - CD3⁺HLA-DR⁺(10⁹/л), Х2 - фагоцитирующие гранулоциты (10⁹/л). Значение Y<1 ассоциировано с наличием лекарственной чувствительности изолятов возбудителя туберкулеза, a Y≥1 - изолятов в отсутствие лекарственной чувствительности (с множественной лекарственной устойчивостью). В частности, снижение на 5,08% количества CD3⁺HLA-DR⁺-лимфоцитов увеличивает на 1% вероятность обнаружения инфильтративного туберкулеза с возбудителем, не имеющим лекарственной чувствительности (с множественной лекарственной устойчивостью). Достоверность коэффициентов регрессии и свободного члена уравнения составила менее 0,05, коэффициент детерминации на обучающей выборке - 0,81 (R₂=0,82), F(4, 23)=6,41, р<0,001. Для оценки возможности использования данного теста в клинической практике нами были рассчитаны стандартные статистические показатели диагностической чувствительности (82,6%) и диагностической специфичности (82,4%) по общепринятым формулам (http://pubhealth.spb.ru/EBM/Epid /EpidRusG04.htm). Способ апробирован в ФГБУ «Уральский НИИ фтизиопульмонологии» Минздрава России на 36 пациентах тестовой группы, имевших M.tuberculosis, распределение пациентов по лекарственной чувствительности и устойчивости возбудителя было сопоставимо с группой, позволившей выявить установленную закономерность.

В доступной научно-медицинской и патентной литературе авторами не обнаружено сведений об известности способа оценки лекарственной чувствительности представленными иммунологическими методами. Таким образом, заявляемое изобретение соответствует критерию «новизна».

Исследованиями авторов впервые было доказано, что экспрессия HLA-DR-Ag⁺ на Т-лимфоцитах (маркер поздней активации клеточного звена иммунитета) и фагоцитарная активность гранулоцитов крови больных туберкулезом отражают лекарственную чувствительность Таким образом, заявляемое изобретение соответствует критерию «изобретательский уровень».

Заявляемый способ может быть воспроизведен в условиях медицинского учреждения (поликлиника, стационар), имеющего среди лабораторного оборудования проточный цитофлюориметр. Таким образом, заявляемое изобретение соответствует критерию «промышленная применимость».

Заявляемый способ иллюстрируется следующими клиническими примерами.

1. Больной М., 1971 г. р., находился на лечении в ФГБУ «УНИИФ» Минздрава России в 2012 году. Ds: инфильтративный туберкулез легких, поражение трех долей, фаза рассасывания. Сопутствующая патология: хронический гастрит, хронический холецистит. Дата первичной постановки диагноза 01.12.2011 при появлении клинических признаков, подтвержденных рентгенологическим методом. С 2010 года выявлялась анасарка без лихорадки (плеврит, перикардит, асцит, периферические отеки), с 2011 года - снижение работоспособности, подъемы температуры, потливость, кашель с мокротой. Социально адаптирован: житель города, имеет жену, ребенка, занимаемая должность - директор, туберкулезный контакт отрицает, не курит. обнаружены 23.03.12 в мокроте и промывных водах бронхов методом люминесцентной микроскопии (26.12.13). В общем анализе крови (29.02.12): лейкоцитоз - 9,9*10⁹/л, гранулоцитов - 6,99*10⁹/л, базофилов - 0,10*10⁹/л, эозинофилов - 2,87*10⁹/л, лимфоцитов - 1,73*10⁹/л, моноцитов - 1,18*10⁹/л. Фагоцитирующих гранулофитов - 5,9*10⁹/л, CD3+HLA-DR+ - 0,066*10⁹/л, Y=0,4, сделано заключение о лекарственной чувствительности изолята Терапия: канамицин, рифампицин, пиразинамид, этамбутол, изониазид, левофлоксацин, режим терапии IA(-). Длительность лечения в стационаре составила 145 суток. Исход заболевания - выздоровление.

2. Больной П., 1962 г. р. Ds: инфильтративный туберкулез, поражение 1 доли, фаза рассасывания, экссудативный плеврит. Дата первичной постановки диагноза 27.11.2011 при появлении клинических признаков, подтвержденных рентгенологическим методом. Сопутствующая патология: язва желудка, хронический пиелонефрит, хронический гастрит. Госпитализирован 01.2012, заболел остро, боль в лев. боку при дыхании, одышка при дыхании, t до 38°С. Социальный статус: женат, 2 детей, алкоголь не употребляет, инвалид 2 группы, житель города, туберкулезный контакт отрицает, не курит. обнаружены 11.01.12 в мокроте методом люминесцентной микроскопии, 20.01.12 в плевральном экссудате методом ПЦР. В общем анализе крови (29.02.12): лейкоцитоз - 6,1*10⁹/л, гранулоцитов - 3,29*10⁹/л, базофилов - 0,18*10⁹/л, эозинофилов - 0,37*10⁹/л, лимфоцитов - 2,26*10⁹/л, моноцитов - 0,55*10⁹/л. Фагоцитирующих гранулофитов - 5,9*10⁹/л, CD3+HLA-DR+ - 0,066*10⁹/л, Y=0,4, сделано заключение о лекарственной чувствительности изолята Терапия: канамицин, рифампицин, пиразинамид, этамбутол, изониазид, левофлоксацин, режим терапии IA(-). Длительность лечения в стационаре составила 145 суток. Исход заболевания - выздоровление.

3. Больная Ш., 1987 г. р., Ds: инфильтративный туберкулез легких, формирующаяся туберкулема с обсеменением. Впервые диагноз был установлен в 2012 году. Сопутствующая патология: остеохондроз позвоночника, нейросенсорная тугоухость. Клинические признаки заболевания: фебрильная температура, слабость, кашель с мокротой, снижение массы тела. Социальный статус: замужем, житель города, инвалид 2 группы, не работает, не курит, сын и мать умерли от туберкулеза. обнаружены неоднократно методом люминесцентной микроскопии, методом световой микроскопии по Циль-Нильсену, при посеве на плотные среды. В общем анализе крови (10.12.13): лейкоцитоз - 5,3*10⁹/л, гранулоцитов - 3,3*10⁹/л, базофилов - 0,05*10⁹/л, эозинофилов - 0,16*10⁹/л, лимфоцитов - 1,50*10⁹/л, моноцитов - 0,47*10⁹/л. Фагоцитирующих гранулофитов - 2,29*10⁹/л, CD3+HLA-DR+ - 0,012*10⁹/л, Y=1,3, сделано заключение об отсутствии лекарственной чувствительности изолята установлена множественная лекарственная устойчивость изолята. Резистентность выявлена в 2012: изониазид, рифампицин, этамбутол, канамицин, фторхинолоны, ПАСК в 2013: стрептомицин, изониазид, рифампицин, этионамид, циклосерин, канамицин, капреомицин, ПАСК, офлоксацин. Терапия: пиразинамид, левофлоксацин, амоксициллин, клофазимин, протионамид, режим терапии индивидуальный, пневмоперитонеум. Длительность лечения в стационаре составила 231 сутки. Исход заболевания - улучшение.

4. Больная С., 1986 г. р., Ds: инфильтративный туберкулез легких, фаза распада. Впервые диагноз был установлен в 2010 году. Сопутствующая патология несахарный диабет, эмфизема, аномалия Киари I. Клиническая картина: в 2010 году отмечалась боль в правой половине грудной клетки, одышка, спонтанный пневмоторакс справа, 2011 - повторный пневмоторакс. Социальный статус: житель города, продавец, туберкулезный контакт отрицает. обнаружены при посеве на плотные среды (11.02.14). В общем анализе крови (10.12.13): лейкоцитоз - 6,4*10⁹/л, гранулоцитов - 4,52*10⁹/л, лимфоцитов - 1,43*10⁹/л, моноцитов - 0,45*10⁹/л. Фагоцитирующих гранулофитов - 3,74*10⁹/л, CD3+HLA-DR+ - 0,003*10⁹/л, Y=1,1, сделано заключение об отсутствии лекарственной чувствительности изолята , установлена множественная лекарственная устойчивость. Резистентность: стрептомицин, рифампицин, канамицин, этионамид. 01.09.2011 выполнена атипичная краевая резекция легкого. Терапия: изониазид, капреомицин, пиразинамид, рифадин. Режим терапии: 2Б. Длительность лечения в стационаре составила 230 суток. Исход заболевания - улучшение.

Использованная литература

1. Фтизиатрия: нац. рук./ В.А. Аксенова, А.С. Апт, В.С. Баринов и др. / Под ред. М.И. Перельмана. - М.: ГОЭТАР-Медиа, 2010. - 521 с. (Серия «Национальные руководства»). - Гл. 5. - Стр. 87.

2. Культуральные методы диагностики туберкулеза: учебное пособие для проведения базового курса обучения специалистов бактериологических лабораторий учреждений противотуберкулезной службы / Под ред. В.В. Ерохина. - М.: Триада. - 2008. - 208 с. - Стр. 125.

3. Культуральные методы диагностики туберкулеза: учебное пособие для проведения базового курса обучения специалистов бактериологических лабораторий учреждений противотуберкулезной службы / Под ред. В.В. Ерохина. - М.: Триада. - 2008. - 208 с. - Стр. 135.

4. Культуральные методы диагностики туберкулеза: учебное пособие для проведения базового курса обучения специалистов бактериологических лабораторий учреждений противотуберкулезной службы / Под ред. В.В. Ерохина. - М.: Триада. - 2008. - 208 с. - Стр. 123.

5. Патент РФ №2562866 Способ обнаружения ДНК возбудителя туберкулеза с одновременным установлением его генотипа и определением генетических детерминант множественной и широкой лекарственной устойчивости, олигонуклеотидный микрочип, набор праймеров и набор олигонуклеотидных зондов, используемые в способе / Д.А. Грядунов, Д.В. Зименков. - заявл. 11.11.2014, опубл. 10.09.2015.

6. Интернет-ресурс http://www.activestudy.info/dragie-metody-opredeleniya-chuvstvitelnosti-mikroorganizmov-k-antibiotikam/.

7. Федеральные клинические рекомендации по диагностике и лечению туберкулеза органов дыхания с МЛУ и ШЛУ возбудителем. - М., 2015. - С. 7.

8. Гариб Ф.Ю. Взаимодействия патогенных бактерий с врожденными иммунными реакциями хозяина / Ф.Ю. Гариб, А.П. Ризопулу // Инфекция и иммунитет. - СПб.: НИИЭМ имени Пастера. - 2012. - №3. - С. 581-596.

9. Писаренко М.С. Особенности секреции интерферона гамма при лекарственно-устойчивом туберкулезе легких / М.С. Писаренко // Фундаментальные исследования. - М.: Издательский Дом «Академия Естествознания». - 2013. - №9. - С. 444-447.

10. Хасанова P.P. Реактивность лимфоцитов крови при туберкулезе легких / Р.Р. Хасанова, О.В. Воронкова, О.И. Уразова, В.В. Новицкий, А.К. Стрелис, Ю.В. Стамбула, А.Е. Колосова, В.А. Серебрякова, И.О. Наследникова, О.В. Колоколова, Т.Е. Будкина, Н.П. Пирогова // Медицинская иммунология. - 2009. - Т. 11. - №1. - С. 35-40.

11. Земляная Н.А. Клинико-иммунологические особенности туберкулеза легких с множественной лекарственной устойчивостью [Текст]: автореф. дис. … канд. мед. наук / Наталия Александровна Земляная. - Томск, 2007. - 24 с.

12. Sun J. Measurement of Nitric Oxide Production in Biological Systems by Using Griess Reaction Assay / Jie Sun, Xueji Zhang, Mark Broderick, Harry Fein // Sensors. - 2003. - №3. - P. 276-284.