СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ И МОНИТОРИРОВАНИЯ ТЕЧЕНИЯ ЦЕРЕБРАЛЬНЫХ ГЛИОМ

Изобретение относится к медицине, а именно к онкологии, и может быть использовано при диагностике и мониторировании течения церебральных глиом.

Известны способы диагностики церебральных глиом с помощью нейровизуализационных методик - магнитно-резонансной томографии (МРТ) головного мозга с контрастным усилением и позитронно-эмиссионной томографии (ПЭТ) с использованием в качестве контраста углерода [¹¹C] (Brandsma, D. Pseudoprogression and pseudoresponse in the treatment of gliomas / D. Brandsma, M.J. van den Bent // Curr. Opin. Neurol. - 2009. - Vol. 22. - P. 633-638). Однако использование лучевых методик имеет большое количество противопоказаний: беременность, наличие имплантатов, кардиостимуляторов и т.д., их эффективность может быть снижена различными послеоперационными изменениями, лучевым некрозом, кровоизлияниями, воспалением и т.д. Ввиду повышенной лучевой нагрузки на организм пациента подобный метод контроля не всегда доступен для регулярного динамического наблюдения больных в ходе их комплексного лечения.

Известен способ диагностики церебральных глиом с помощью выявления мутаций в генах PTEN (10q23.3), р53, EGFR, р16 (Ohgaki Н., Kleihues P. Population-based studies on incidence, survival rates, and genetic alterations in astrocytic and oligodendroglial gliomas // J Neuropathol Exp Neurol. 2005 Jun; 64(6):479-89; Kita D., Yonekawa Y., PIK3CA alterations in primary (de novo) and secondary glioblastomas // Acta Neuropathol. 2007 Mar; 113(3):295-302. Epub 2007 Jan 18). Однако данные мутации встречаются у пациентов редко, менее чем в 30% случаев, что снижает их диагностическую значимость.

Известны исследования уровней экспрессии различных генов микроРНК в крови для диагностики церебральных глиом (Roth Р. et al. A specific miRNA signature in the peripheral blood of glioblastoma patients // J Neurochem. 2011 Aug; 118(3):449-57), оценки стадии патологического процесса (Visani М, et al. Expression of 19 microRNAs in glioblastoma and comparison with other brain neoplasia of grades I-III // Mol Oncol. 2014 Mar; 8(2):417-30), влияния на специфическую терапию (Zhang KL, et al. Blockage of a miR-21/EGFR regulatory feedback loop augments anti-EGFR therapy in glioblastomas Cancer Lett. 2014 Jan 1; 342(1):139-49) и т.д.

Однако большинство работ отражают только некоторые аспекты значимости различных микроРНК, не давая общей клинической характеристики церебральных глиом. Результаты работ имеют выраженный этнических характер: азиатские и центральноевропейские популяции. Использование в качестве исследуемого материала крови пациентов свидетельствует об инвазивности методик.

Техническим результатом изобретения является комплексная оценка состояния патологического процесса при церебральных глиомах, включающая диагностику, активность, чувствительность к химиопрепаратам, мониторирование пациентов на фоне проводимой терапии и оценку эффекта от оперативного вмешательства, проводимые неинвазивными средствами.

Технический результат достигается в способе диагностики и мониторирования течения церебральных глиом (ЦГ), включающем определение уровней экспрессии генов микроРНК, в котором определяют уровни экспрессии генов микроРНК-21, -128 и -342 в слюне и при повышении экспрессии гена микроРНК-21 и снижении экспрессии генов микроРНК-128 и -342 по сравнению с референтными значениями диагностируют ЦГ, причем степень изменения экспрессии генов по сравнению с референтными значениями соответствует степени прогрессии глиомы.

Целесообразно в реакции приготовления копийной ДНК гена микроРНК-128 использовать последовательность праймера для обратной транскрипции GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACAAAGAG, а для гена микроРНК-342 - GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACACGGGT.

В заявленном изобретении предложены уникальные последовательности праймеров для обратной транскрипции генов микроРНК-128 и -342. Подобранные термодинамические характеристики этих праймеров полностью соответствуют характеристикам праймеров для обратной транскрипции гена микроРНК-21 и референц-гена U6. Это позволяет получать копийную ДНК и проводить ПЦР в одних и тех же температурных условиях, что крайне важно для стандартизации исследования.

Для разработки способа были проведены клинические исследования. В проведенных исследованиях основную группу составили 90 пациентов (46 мужчин и 44 женщины) в возрасте от 24 до 75 лет (средний возраст 49,5 лет) с подозрением на прогрессию ЦГ в процессе комплексного лечения.

Всем больным основной группы на начальном этапе было выполнено хирургическое вмешательство в рамках стандарта комплексного лечения ЦГ. Согласно данным операционных протоколов, у 51,6% выполнено тотальное и субтотальное удаление ткани новообразования (не менее 75% объема опухолевой ткани), а у 30,4% - парциальное (не менее 50% объема опухоли). Стереотаксическая биопсия применена у 12% больных. Стереотаксическая биопсия и селективная криодеструкция - у 6%. В 2-х случаях наблюдали опухоли субтенториальной локализации, а в остальных 88 - супратенториальной.

Данные клиники, ЭЭГ, ПЭТ и нейровизуализационных исследований, уровней экспрессии микроРНК-21, -128, -342 в процессе адъювантного лечения заболевания изучены во всех группах больных.

Группу контроля составили 30 человек, из них: 25 потенциально здоровых волонтеров и 5 нейрохирургических больных с опухолями не глиального ряда: с кавернозной ангиомой (N=1), коллоидной кистой III желудочка мозга (N=1), базальными менингиомами (N-2), менингоматозом (N-1). Всем пациентам в контрольной группе также проведено исследование уровня экспрессии микроРНК-21, -128, -342.

ПЭТ-исследования проведены на позитронно-эмиссионном томографе «Scanditronix PC 2048» (Швеция) с использованием радиофармпрепарата (РФП) L-[метил-¹¹С]-метионин (¹¹С-метионин). Полученные ПЭТ-изображения исследовались на наличие очага/очагов повышенного накопления ¹¹С-метионина соответственно локализации опухоли.

Нейровизуализацию осуществляли с помощью прибора MRT Achieva 3Т.

ЭЭГ исследования проводили при стандартной схеме расположения электродов "10-20" с использованием моно- и биполярной регистрации (компьютерный электроэнцефалограф «Neurotravel» и 21-канальный электроэнцефалограф «Мицар»), в ходе которой для уточнения локализации патологических очагов применяли функциональные пробы, проводили визуальный метод анализа ЭЭГ, а при необходимости - спектральный и частотный.

Исследование относительной экспрессии микроРНК-21, -128 и -342 проводили по полуколичественному протоколу, используя в качестве референц-гена малую РНК U6.

Исследуемые группы больных были статистически сопоставимы. Полученную в процессе исследования информацию обрабатывали с использованием компьютерной программной системы STATISTICA for Windows (версия 5.5). Массив исходных данных для большинства испытуемых содержал: клинические, генетические, нейровизуализационные характеристики и данные ПЭТ с ¹¹С метионином. Оценку частотных и качественных показателей проводили с помощью непараметрических методов, χ², поправки Йетса (для малых групп) и критерия Фишера. Сравнение количественных параметров в исследуемых группах осуществляли по критериям Манна-Уитни, Вальда, медианного χ² и модуля ANOVA. Критерием статистической достоверности получаемых выводов считали общепринятую в медицине величину p<0,05.

В контрольной группе экспрессия микроРНК-21 в плазме составляла 0,055±0,041 относительных единиц экспрессии гена микроРНК (ОЕ), в слюне - 0,050±0,039 ОЕ. Уровень экспрессии микроРНК-128 в крови был 2,330±0,033 ОЕ, в слюне - 0,100±0,014 ОЕ; микроРНК-342 в крови был 1,32±0,02 ОЕ, в слюне - 0,090±0,018 ОЕ. Показатели ЭЭГ, нейровизуализации и ПЭТ были в норме.

На основании полученных результатов исследования контрольной группы были определены референтные уровни экспрессии генов микроРНК:

- микроРНК-21 в крови <0,05 ОЕ, в слюне <0,05 ОЕ;

- микроРНК-128 в крови >2,33 ОЕ, в слюне >0,10 ОЕ;

- микроРНК-342 в крови >1,32 ОЕ, в слюне >0,09 ОЕ.

В основной группе (90 человек) уровень экспрессии микроРНК-21 превосходил значения референта и составлял 3,56±0,27 ОЕ в крови и 2,45±0,17 ОЕ в слюне. Экспрессия микроРНК-128 и -342 была сниженной у пациентов с подтвержденной прогрессией заболевания (в 32% случаев наблюдений). Уровень экспрессии микроРНК-128 в крови составлял 0,0080±0,0004 ОЕ и 0,040±0,004 ОЕ в слюне, а для микроРНК-342 в крови 0,0080±0,0004 ОЕ и 0,04±0,004 ОЕ в слюне.

Таким образом, различия по экспрессии микроРНК между контрольной и основной группой были статистически достоверными: p<0,001.

Распределение значений экспрессии микроРНК-21 коррелировало со степенью злокачественности глиом: r=+0,97, а микро РНК-128 и -342: r=+0,65. При церебральных глиомах с высокой степенью злокачественности (Grade II-III, III и IV) корреляция экспрессии микроРНК-21 с индексом Карновского достигала значительного уровня: r=+0,89, а экспрессии микроРНК-128, -342: r=+0,38.

Следует отметить, что прогрессия глиом коррелировала со степенью экспрессии микроРНК-21, -128 и -342 (r=+0,89).

Вышеописанные показатели микроРНК-21 значимо коррелировали с данными ПЭТ с [¹¹С] метионином. Так, при убедительной ремиссии опухоли экспрессия микроРНК-21, -128 и -342 не выходили за рамки референтных значений, высоко коррерировали со стабилизацией роста глиомы (r=+0,77) и при ее прогрессировании (r=+0,96).

Таким образом, развитие церебральных глиом сопровождается убедительным ростом экспрессии гена микроРНК-21 и снижением экспрессии генов микроРНК-128 и -342. Доступность способа определения динамики микроРНК в ходе наблюдения за больными ЦГ позволяет обосновать показания к проведению ПЭТ исследования.

Предлагаемый способ позволяет проводить эпигенетическую диагностику и мониторирование течения церебральных глиом на момент диагностики и на любом сроке развития опухоли, включая проведение химиотерапии. Отсутствие нормализации экспрессии гена микроРНК-21 на фоне проводимой терапии указывает на отсутствие эффективности последней.

Способ заключается в определении относительного количества копий микроРНК в слюне, поэтому исследование является неинвазивным и не имеет противопоказаний.

Способ осуществляют, например, следующим образом.

Исследование относительной экспрессии микроРНК-21, -128 и -342 проводят по полуколичественному протоколу, используя в качестве референц-гена малую РНК U6. Тотальную РНК выделяют из слюны с помощью фенольного реактива Trireagent-LS с последующей ее экстракцией хлороформом.

Копийную ДНК (кДНК) получают по технологии StemLoop со специфическими праймерами, раздельно для каждой микроРНК с использованием набора для обратной транскрипции «ОТ-1» (Синтол, Москва) согласно инструкции. Последовательности праймеров для обратной транскрипции представлены в таблице 1.

Амплификацию проводят в режиме RealTime на приборе TLite (Россия) по стандартной двухпраймерной схеме по полуколичественному протоколу с использованием 2,5х Реакционная смесь для проведения ПЦР-РВ в присутствии красителя EVA Green (Синтол, Москва). ПЦР-смеси для микроРНК-21, -128, 342 и U6 содержат один общий праймер и специфические праймеры согласно таблице 2.

Программа амплификации: 95°С - 5 минут, затем 45 циклов (60°С - 30 секунд и 95°С - 1 минута). После амплификации прибор в автоматическом режиме рассчитывает цикл выхода пробы на логарифмическую кривую (Ct). Определение относительного уровня экспрессии гена микроРНК-21 проводят по протоколу ΔΔCt и рассчитывают по формуле 2^(-(А-В)), где А - Ct гена микроРНК, а В - Ct гена U6 (Rao X, et al. An improvement of the 2^{^}(-delta delta CT) method for quantitative real-time polymerase chain reaction data analysis // Biostat Bioinforma Biomath. 2013 Aug; 3(3):71-85). Расчет относительных уровней экспрессии генов микроРНК-128 и -342 проводят аналогичным образом.

При повышении экспрессии гена микроРНК-21 и снижении экспрессии генов микроРНК-128 и -342 по сравнению с референтными значениями диагностируют церебральную глиому, причем степень изменения экспрессии генов по сравнению с референтными значениями соответствует степени прогрессии глиомы.

Способ подтверждается клиническими примерами.

1. Больная Д., 36 лет, обратилась в клинику с жалобами на периодические интенсивные диффузные головные боли, приходящую общую слабость. Состояние средней тяжести, слизистые и кожные покровы сухие, пульс до 68 уд. в мин, А/Д до 115/70 мм Hg, температура 36,7°С, дыхание 16 в мин. Манифестация заболевания за 2 месяца до госпитализации сомато-моторным ирритативным синдромом. В неврологическом статусе: сознание ясное, астенизирована, афатических расстройств нет. Движения глазных яблок в полном объеме, анизокории нет, имеет место левосторонний рефлекторный гемипарез, брюшные рефлексы вялые с легким акцентом справа, координация сохранна, выпадений чувствительности и патологических стопных знаков нет. На глазном дне застойных явлений не отмечается, поля зрения - без выпадений.

До госпитализации выполнено исследование микроРНК:

При госпитализации. ЭЭГ: определяется наличие медленной патологической и эпилептиформной активности в отведениях от правого полушария головного мозга, дисфункция срединных стволовых структур, косвенные признаки внутричерепной гипертензии.

МРТ-исследование головного мозга - выявлен объемный процесс правой лобной доли с зоной перифокального отека. На серии ПЭ томограмм при исследовании с ¹¹С-метионином в коре передней половины правой лобной доли и субкортикально регистрируется крупный очаг патологически повышенного неоднородного накопления РФП (ИН=3,35) размерами 49×45×43 мм, соответствующий по локализации поражению, выявленному на МРТ. Сливные очаги максимального накопления ¹¹С-метиоиина занимают более половины общего объема образования.

В плановом порядке больная подготовлена к операции. Под эндотрахеальным наркозом произведена костно-пластическая трепанация в правой лобно-височной области, субтотальное удаление опухоли (по данным гистологии анапластическая олигодендроглиома Grade III).

На серии контрольных послеоперационных ПЭ томограмм при исследовании с ¹¹С-метионином в средней трети правой лобной доли определяется аметаболический очаг размерами 25×27×21 мм, обусловленный послеоперационной полостью. Ниже и медиальнее описанной полости регистрируется мелкий очаг патологически повышенного накопления РФП (ИН=1,65) размерами 15×15×16 мм. Послеоперационная полость окружена прерывистой каймой повышенного накопления РФП (ИН=1,2) толщиной до 8 мм. Накопление РФП в зоне интереса в ранней сосудистой фазе исследования не визуализируется. Деформация переднего рога правого бокового желудочка уменьшилась. ПЭТ данные трактовали как состояние после субтотального удаления анапластической олигодендроглиомы правой лобной доли.

К 10-м и 14-м суткам послеоперационного периода у больной сохранялся астенический и цефалгический синдром, снижение аппетита, тошнота, сухость кожных покровов и слизистых, субфебрилитет. Неврологически: контактна, адекватна в поведении, однако вяла, заторможена, сохраняется левосторонний гемипарез до 4 баллов.

Исследование микроРНК после операции:

Таким образом, повышение экспрессии микроРНК-21 и понижение экспрессии микроРНК-128 и -342 на этапе донейровизуализационного обследования указывало на существование опухоли и было подтверждено инструментально. Нормализация показателей после оперативного лечения опухоли отражает эффект от оперативного удаления опухоли.

2. Больной С., 27 лет, поступил в клинику с жалобами на интенсивные диффузные головные боли, общую слабость, снижение аппетита, тошноту и рвоту. При поступлении - состояние больного тяжелое, слизистые и кожные покровы сухие, пульс до 62 уд. в мин, А/Д до 115/70 мм Hg, температура субфебрильная 37,1°С, частота дыхания до 18-19 в мин. Манифестация заболевания за 2 мес до поступления в клинику.

В неврологическом статусе: сознание сужено до легкого оглушения, речь - односложная прерывистая, без отчетливых афазических расстройств, умеренное ограничение взора вверх, анизокории нет, имеет место рефлекторный и силовой (до 3 баллов) правосторонний гемипарез, чувствительность сохранена, двухсторонние патологические стопные знаки. Выраженный отек дисков зрительных нервов.

При ЭЭГ: патологическая медленная активность в отведениях от левого полушария головного мозга, дисфункция стволовых структур, признаки внутричерепной гипертензии.

При ультразвуковой доплерографии - снижение церебральной перфузии, преимущественно в бассейне левой среднемозговой артерии, левосторонняя венозная дисгемия по базальным, глазничным и яремным коллекторам.

При эхоэнцефалографии - дислокация срединных структур слева направо до 8 мм.

При МРТ и ПЭТ - исследовании головного мозга выявлен объемный процесс глубинных отделов левой височной доли головного мозга с латеральной дислокацией срединных структур слева направо. На серии ПЭ томограмм при исследовании с ¹¹С-метионином в глубинном отделе левого большого полушария паравентрикулярно соответственно заднему отделу гиппокампа, зрительного бугра и теменной доле установлен очаг патологически повышенного неоднородного накопления РФП (ИН=3,2) размерами 40×30×40 мм. Сливной очаг максимального накопления РФП занимает более половины общего объема образования и локализуется в его верхне-заднем отделе. Опухоль расположена в интимной близости с височным рогом, треугольником и задним отделом тела левого бокового желудочка.

До госпитализации выполнено исследование микроРНК:

В связи с проградиентным ухудшением состояния в виде нарастания общемозговой и очаговой неврологической симптоматики больной оперирован по экстренным показаниям. Под эндотрахеальным наркозом произведена костно-пластическая трепанация в левой лобно-теменно-височной области, парциальное удаление новообразования (по данным гистологического исследования - глиобластома, Grade IV) глубинных отделов левой височной доли головного мозга. К 5-м суткам послеоперационного периода: состояние больного - тяжелое, тахипное до 22 в мин, гипертермия до 38,8°С, сухость слизистых и кожных покровов. Уровень сознания - оглушение, элементы психомоторного возбуждения. В анализах ликвора: цитоз в пределах 5/3, белок 0,63 г/л.

Больному проведен курс инфузионно-дезинтоксикационной терапии. После проведения вышеуказанной терапии состояние больного улучшилось: к 10-м суткам послеоперационного периода больной в компенсированном состоянии, ясном сознании, контактен и адекватен, отмечает удовлетворительное субъективное самочувствие. Кроме того, отмечается регресс общемозговой и очаговой симптоматики. При офтальмологическом исследовании - глазное дно и поля зрения в норме.

На серии контрольных послеоперационных ПЭ томограмм при исследовании с ¹¹С-метионином в левой височной доле регистрируется аметаболический очаг размерами 38×27×23 мм, обусловленный послеоперационной полостью. У верхнемедиальной стенки описанной полости в левом зрительном бугре определяется очаг патологически повышенного накопления РФП (ИН=2,8) размерами 26×26×27 мм, соответствующий верхнему участку первичного массива глиомы. Очаг максимального накопления ¹¹С-метионина занимает половину объема остатка глиомы. У нижнемедиальной стенки полости отмечается мелкий очаг патологически повышенного накопления РФП (ИН=1,59) диаметром 7 мм, соответствующий мелкому остатку глиомы в парагиппокампальной извилине. По данным ПЭТ-контроля - состояние после парциального удаления глиобластомы глубинного отдела левого большого полушария.

Клинико-биохимические и иммунологические показатели крови и мочи в норме. Начат курс адъювантной терапии - МХТ темодалом.

Проведено 6 курсов МХТ темодалом. Через 6 мес при МРТ с контрастным усилением - размеры оставшейся части опухоли без существенных изменений, а при ПЭТ-исследовании ИН 2,7, что говорило об относительной стабилизации неопластического процесса (с учетом гистологического диагноза).

Исследование микроРНК:

Данное наблюдение демонстрирует положительную динамику изменений уровней экспрессии микроРНК вплоть до нормализации (уровень микроРНК-342 в плазме) после оперативного вмешательства и на фоне проводимой терапии, что дает возможность использования метода для мониторирования состояния опухоли. Тот факт, что не все показатели нормализовались, подтвержден наличием остаточного очага ЦГ диаметром 7 мм (ИН=1,59).

Использование заявленного изобретения позволяет проводить комплексную оценку состояния патологического процесса при церебральных глиомах, включающую диагностику, активность, чувствительность к химиопрепаратам, мониторирование пациентов на фоне проводимой терапии и оценку эффекта от оперативного вмешательства, неинвазивными средствами.