Способ прогноза летальности при гнойно-септических инфекциях в эксперименте

Способ прогноза летальности при гнойно-септических инфекциях в эксперименте

Изобретение относится к экспериментальной медицине в области патофизиологии, а именно к определению риска летальности при гнойно-септических инфекциях (ГСИ).

При гнойно-септических инфекциях отмечается высокий процент летального исхода заболеваний. По данным В.М.Гаглоева сепсис ежегодно регистрируется у 750 тыс. людей и более чем у 210 тыс. из них заболевание заканчивается летальным исходом [disserCat http://www.dissercat.com/content/nekotorye-sovremennye-osobennosti-gnoinoi-infektsii-u-detei-i-rannyaya-diagnostika-ee-septic#ixzz4Kb_NSjx4B].

У детей бактериальный сепсис заканчивается летальным исходом в 44,6% случаев, в том числе среди детей до 3-х месяцев жизни летальность составляет в 69,1% случаев [Д.А.Баранов, 2012. Медицинские диссертации http://medical-diss.com/medicina/patomorfoz-vozbuditelev-gnoyno-septicheskih-zabolevaniv-u-detev-i-optimizatsiya-lecheniva-bolnyh#ixzz4KbI93pLw]. При гнойном перитоните летальный исход наблюдается в 18,3-62,8% случаев, а в послеоперационном периоде достигает 45-92,3% [В.П. Будашеев с соавт. Факторы риска гнойно-септических инфекций при распространенном гнойном перитоните / Бюллетень Восточно-Сибирского научного центра СО РАМН. - 2012. - №54. - С. 27].

Прогресс в изучении патофизиологии и генетики индивидуального ответа на септические проявления в организме изменил распространенное понимание данного синдрома, а ряд лечебных мероприятий, применяемых в последние годы с использованием лечебно-профилактических препаратов, продемонстрировал эффективность проводимого химиотерапевтического лечения, однако, проблема интенсивной терапии по-прежнему стоит довольно остро и требует дальнейшего изучения [Щитинин В.Е. с соавт. Лечение острого гематогенного остеомиелита в детском возрасте / Остеомиелиты у детей: тез. док. Рос. симп. по детской хирургии с междунар. участием. Ижевск. - 2006. - Ч. 1. - С. 283-285; Cook S.W. et al. Virulence factors of Escherichia coli isolated from female reproductive tract infections and neonatal sepsis / Infect. Dis. Obstet. Gynecol. - 2001. - Vol. 9. - №4. - P. 203-207; Suryati B.A. et al. Staphylococcus aureus bacteraemia in children: a 5-year retrospective review / J. Paediatr. Child Health. - 2002. - Vol. 38. - №3. - P. 290].

В частности, не установлен патогенетический механизм летальности в различные периоды ГСИ. Известно, что популяции микроорганизмов одного вида неоднородны и состоят из культивируемых и некультивируемых бактерий [Соколенко А.В. Некультивируемые формы бактерий: распространение в природе, индукторы некультивируемого состояния и реверсии // Современные наукоемкие технологии. - 2006. - №2 - С. 11-15; Козлов Л.Б., Диц Е.В. Роль микробных ассоциаций в инфекционной патологии человека // Фундаментальные исследования, 2013. - №9. - С. 366-370; Heim S. Et al. The viable but nonculturable state and starvation are different stress responses of Enterococcus faecalis, as determined by proteome analysis // J. Bacteriol - 2002. - Vol. 184. - №23. - P. 6739-6745]. Установлено также, что на летальность при наличии ГСИ оказывает влияние и собственная условно-патогенная микрофлора организма.

Целью настоящей заявки на изобретение является установить влияние культивируемых и некультивируемых бактерий, а также условно-патогенной микрофлоры организма на частоту возникновения летальности при ГСИ в различные периоды инфекционного процесса.

Решение данной проблемы позволит установить патогенетический механизм летальности и разработать этиотропное и патогенетическое лечение, направленное на предупреждение летального исхода при ГСИ.

В патентной и периодической литературе не описан прогноз возникновения летальности в различные периоды инфекционного процесса, вызванного ГСИ.

Описан прогноз развития гнойно-септических осложнений при поражении различных органов и тканей организма. Так, предложен способ прогнозирования осложненного течения флегмон [Патент RU №2342656 от 27.12.2008. Бюл. №36]. Прогноз основан на интеграции показателей состояния макроорганизма по выраженности системного воспалительного ответа и наличия факторов патогенности у микроорганизма.

Камзалакова Н.И. с соавт. предложили прогноз развития гнойных послеоперационных осложнений на основании иммунологических данных, полученных в предоперационном периоде [Патент RU №2153674 от 27.07.2000. Бюл. №21].

На основании известных механизмов развития гнойных инфекций предложен ряд способов по предупреждению развития гнойно-воспалительных осложнений. Любарский М.С. с соавт. [Патент RU №2100976 от 10.01.1998] предложили способ лечения открытых переломов костей, направленный на уменьшение эндогенной интоксикации, подавления присутствующей микрофлоры и предупреждения присоединения вторичной инфекции.

Описаны способы лечения токсико-септических состояний [Патент RU №2144837 от 27.01.2000. Бюл. №3] и гнойно-воспалительных осложнений, обусловленных нозокомиальной инфекцией [Патент RU №2246273 от 20.02.2005. Бюл. №5].

Итак, в патентной литературе не выявлено способов прогноза летального исхода при заболеваниях ГСИ, вызванных некультивируемыми бактериями и транслокацией условно-патогенной микрофлорой организма.

В качестве прототипа выбран материал, изложенный в монографии С.П. Сахарова, Л.Б. Козлова [Сахаров С.П., Козлов Л.Б. Система диагностики инфекционных осложнений и прогнозирование исходов ожоговой болезни у детей (клинико-экспериментальные исследования): монография // Екатеринбург: Изд-во Урал. Ун-та, 2014. 252 с.]. В монографии представлены данные о влиянии культивируемых и некультивируемых бактерий, а также условно-патогенной микрофлоры организма на развитие инфекционного процесса, описаны сроки возникновения летального исхода у кроликов породы шиншилла, но не дан прогноз частоты возникновения летального исхода заболеваний у животных.

В задачу настоящего изобретения входило выявить в начальном периоде инфекции частоту возникновения летального исхода ГСИ, вызванной некультивируемыми и культивируемыми бактериями, а также транслокацией условно-патогенной микрофлоры организма на основании биохимических тестов и патогенетического механизма развития инфекционного процесса.

Технический результат - простой, не требующий больших материальных затрат и основан на прогнозировании летального исхода при ГСИ в зависимости от патогенеза заболеваний и количественных показателей щелочной фосфатазы, аланинтрансферазы и мочевины в сыворотке крови больных животных.

Технический результат предложенного нами способа прогноза летальности при гнойно-септической инфекции в эксперименте согласно изобретению включает заражение кроликов путем подкожного введения взвеси бактерий P. aeruginosa и S. aureus, выделенных от больных гнойно-воспалительными процессами, в концентрации 10⁵ микробных клеток в 1 мл, затем определяют показатели щелочной фосфатазы (ЩФ), аланинтрансферазы (АЛТ) и мочевины и при показателе ЩФ 205-391 u/L и АЛТ 53-63 u/L на 1-2 сутки после заражения прогнозируют поражение головного мозга и гибель животных на 2-4 сутки в 29-38%, при показателе ЩФ 485-652 u/L и АЛТ 36-38 u/L на 4-5 сутки прогнозируют развитие гнойно-септической инфекции и гибель животных на 9-11 день болезни в 69-84%, а при показателе концентрации мочевины 1,3-1,9 u/L на 4-5 день болезни прогнозируют транслокацию E. coli с развитием при гнойно-септической инфекции и гибель животных на 7-8 день болезни в 54-66% случаев.

Предлагаемый способ осуществляют следующим образом. От больных с гнойно-воспалительными процессами выделяют культуры P. aeruginosa и S. aureus. Популяции выделенных бактерий содержат культивируемые и некультивируемые бактерии соответствующих видов.

В качестве экспериментальной модели берут кроликов породы «шиншилла» мужского пола массой 2230-2295 грамм. Смесь бактерий P. aeruginosa и S. aureus вводят кроликам подкожно в левое бедро с концентрацией 10⁵ микробных клеток в 1 мл.

На 1 -2 сутки после заражения, а также на 4-5 сутки, у кроликов берут кровь и определяют наличие в сыворотках крови концентрацию щелочной фосфатазы, АЛТ и мочевины. При показателе щелочной фосфотазы на 1-2 сутки болезни кроликов 205-391 u/L и АЛТ 53-63 u/L прогнозируют поражение головного мозга с гибелью животных на 2-4 сутки в 29-38% случаев. При показателях щелочной фосфатазы 495-652 u/L и АЛТ 36-38 u/L на 4-5 сутки прогнозируют развитие гнойно-септической инфекции с гибелью животных на 9-11 день в 69-84% случаев. При показателе концентрации мочевины 1,3-1,9 u/L на 4-5 день болезни кроликов прогнозируют транслокацию E. coli с развитием ГСИ с летальным исходом на 7-8 день болезни у 54-66% животных.

Примеры практического использования предлагаемого способа

Пример 1. В качестве экспериментальной модели взят кролик породы «шиншилла» мужского пола массой 2240 грамм. Смесь бактерий P. aeruginosa и S. aureus ввели кролику подкожно в левое бедро с концентрацией 10⁵ микробных клеток в 1 мл.

На 1-е сутки после заражения у кролика взяли кровь и провели биохимическое исследование сыворотки крови. Показатель щелочной фосфатазы на 1-е сутки болезни кролика составил 260 u/L и АЛТ 58 u/L. Прогнозировано поражение головного мозга на 2 сутки. Кролик погиб на 3 сутки. При вскрытии животного подтверждено поражение головного мозга на основании гистологических и микробиологических исследований.

Пример 2. В качестве экспериментальной модели взят кролик породы «шиншилла» мужского пола массой 2256 грамм. Смесь бактерий P. aeruginosa и S. aureus ввели кролику подкожно в левое бедро с концентрацией 10⁵ микробных клеток в 1 мл. На 4-е сутки после заражения у кролика взяли кровь из ушной вены для биохимических исследований.

Показатель щелочной фосфатазы на 4-е сутки в сыворотке крови кролика составил 523 u/L и АЛТ 37 u/L. Прогнозировано развитие гнойно-септической инфекции с гибелью животных с 9 дня болезни. Животное погибло на 9 день болезни. При вскрытии животного на основании гистологических и микробиологических исследований установлено наличие гнойно-септической инфекции с поражением внутренних органов.

Пример 3. В качестве экспериментальной модели взят кролик породы «шиншилла» мужского пола массой 2282 грамма. Смесь бактерий P. aeruginosa и S. aureus ввели кролику подкожно в левое бедро с концентрацией 10⁵ микробных клеток в 1 мл.

На 4-е сутки после заражения у кролика взяли кровь для биохимических исследований. На 4-е сутки концентрация мочевины в сыворотке составила 1,4 u/L. У животного прогнозирована транслокация E. coli из кишечника животного и развитие ГСИ на 7 день болезни. Животное погибло на 7 день заболевания.

При вскрытии кролика на основании гистологических и микробиологических исследований отмечена транслокация кишечной палочки из кишечника животного и развитие гнойно-септической инфекции с поражением внутренних органов.

Экспериментальные исследования на кроликах проведены в виварии ФГБОУ ВПО «Государственного аграрного университета Северного Зауралья». Микробиологические исследования проведены на базе микробиологической лаборатории Тюменского филиала ФГУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии по железнодорожному транспорту», а биохимические исследования - на автоматическом биохимическом анализаторе BS 200 (Mindray) с использованием коммерческих наборов реактивов на базе ФБУН ТНИИКИП Роспотребнадзора. Всего в эксперименте находилось 53 кролика породы «шиншилла».

Предложенный способ прогноза летального исхода при ГСИ в эксперименте на животных легко воспроизводим, не требует больших материальных затрат и позволяет в эксперименте на животных апробировать новые методы лечения с учетом патогенетических изменений в организме и экстраполировать полученные экспериментальные данные на животных при лечении пациентов. Предложенная экспериментальная модель (кролики породы «шиншилла») с учетом биохимических показателей сывороток крови животных может быть использована для совершенствования методов интенсивной терапии, направленной на предупреждение летальности при ГСИ.