СПОСОБ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО МОДЕЛИРОВАНИЯ МИГРАЦИИ БАКТЕРИЙ В ГОЛОВНОЙ МОЗГ НА ФОНЕ ОЖОГОВОЙ ТРАВМЫ

Изобретение относится к области экспериментальной медицины и может быть использовано для разработки эффективных мероприятий, направленных на предупреждение летального исхода инфекционного процесса на фоне ожоговой травмы, а также для лечения ожоговой болезни с использованием эффективных патогенетических и этиотропных методов лечения.

Летальность от термических травм у детей в мире по данным Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) и Детского фонда ООН (ЮНИСЕФ) занимает 3-е место среди всех травматических факторов после аварий на дорогах и утопления. Ежегодно в мире погибает более 50000 человек от ожогов [Будкевич Л.И. Современные методы хирургического лечения детей с тяжелой термической травмой: Автореф. дис докт. мед наук. - М., 1998. - 33 с.; Всемирный доклад о профилактике детского травматизма.- Всемирная организация здравоохранения и ЮНИСЕФ. - Женева, 2008. - 39 с.]. В работах С.П.Сахарова с соавт. [Сахаров С.П., Иванов В.В., Шень Н.П., Сучков Д.В. Летальные исходы ожоговой болезни у детей: 18-летний опыт работы // Российский научно-практический журнал «Скорая медицинская помощь». - 2011. - №3. - С.52-57.] установлено, что частота летальных исходов при ожогах площадью более 40% составляет 56,6%.

Основная причина летальности связана с инфекционным процессом в организме ожоговых больных. В периодической литературе имеются сообщения о поражении головного мозга в процессе ожоговой болезни. С.Е. Хрулев установил наличие поражений головного мозга у 33,7% инвалидов после перенесенной ожоговой травмы [Хрулев С.Е. Ожоговая травма с церебральными осложнениями у взрослых и детей (клиника, механизмы развития, профилактика). Автореф. дис докт. мед наук. - Нижний Новгород, 2009. - 30 с.]. По результатам исследования нейрон-специфической енолазы выявлено 2 пика возможных церебральных осложнений (1-5 и 16-18 сутки). Во многих случаях инфицирование ожоговой раны у пациентов определяет тяжесть течения ожоговой болезни. Поэтому изучение механизма развития инфекционного и патологического процесса при ожоговой болезни с летальным исходом является актуальным с целью разработки эффективных патофизиологических методов лечения и профилактических мероприятий, направленных на предупреждение инфицирования ожоговой раны.

В периодической и патентной литературе не описано способов экспериментального моделирования инфекционного процесса с летальным исходом при ожоговой травме. В.А. Шатров с соавт. [Патент RU №2286154 от 27.10.2006] предложили способ лечения воспалительных заболеваний головного мозга аутолейкоцитами, полученными по методике плазма-лейкоцитафореза с применением гелий-неонового лазерного облучения.

Описан способ прогнозирования гнойного менингита у обожженных [Патент RU №2321861 от 10.04.2008 г.] по нарастанию концентрации глюкозы в крови в первые 3 дня болезни и повышению уровня СОЭ. Увеличение концентрации глюкозы в первые 3 дня болезни может быть связано с размножением бактерий, образующих капсулы или биопленки. При ферментативном разрушении поверхностных полисахаридов микробных клеток (капсул и биопленок), очевидно, авторы и наблюдали повышение концентрации глюкозы в крови, связанное с размножением бактерий. Через 3 дня, как правило, в крови бактерии не удается обнаружить в результате бактерицидного действия сывороток крови.

Проникновение бактерий в головной мозг чаще всего происходит с повышением проницаемости гематоэнцефалического барьера (ГЭБ). Зарегистрировано повышение проницаемости ГЭБ при гипотермии животных [Патент RU №2012219 от 15.05.1994 г.]. И.А. Мединяк с соавт. [Патент RU №2391107 от 10.06.2010 г.] предложили использовать озон для повышения проницаемости ГЭБ. Отмечено проникновение бактерий в нервную систему на фоне иммунодепрессии [http://www.mielin.ru/ru/ healing_ru/diseases/neuroinfection/]. Установлено также, что инкапсулированные бактерии имеют на своей поверхности компоненты, позволяющие им проходить через ГЭБ [http://medbiol.ru/medbiol/ infect_har/00122bd3.htm]. Капсулы бактерий состоят из полисахаридов, при ферментативном разрушении которых образуется глюкоза, используемая клетками головного мозга в качестве питательного субстрата. Известно проникновение глюкозы в головной мозг в результате облегченной диффузии.

Наиболее близким техническим решением является материал, опубликованный в патенте А.Г. Новартиса [Патент RU №2478385 от 10.04.2013 г.] и выбранный нами в качестве наиболее близкого аналога изобретения (т.е. «прототипа»). Предложен способ лечения муковисцироза. Следовательно, предложенный способ не является средством одного и того же назначения настоящего изобретения, а именно, способом экспериментального моделирования миграции бактерий в головной мозг на фоне ожоговой травмы. В ближайшем аналоге изобретения возбудителем заболевания является также Pseudomonas aeruginosa. В США заболеваемость муковисцидозом составляет 1 на 1000 населения. В штате Виктория, в Австралии заболеваемость составляет 1 на 3600. В Северной Италии заболеваемость муковисцидозом составляет 1 на 4300 населения. Наиболее часто заболевание встречается у европейцев и евреев ашкенази. Автор патента Дэйвид Рейд предложил препараты для прерывания биопленкообразования бактериями Р. aeruginosa и в результате этого микробы не проникали в головной мозг. Предупреждение формирования биопленки бактериями Р. aeruginosa позволило автору патента осуществить этиотропное лечение данного инфекционного заболевания. Таким образом, установлено, что бактерии Р. aeruginosa, часто определяемые на поверхности ожоговых ран при возможности биопленкообразования, могут проникать через ГЭБ в головной мозг и в результате этого возможен летальный исход заболевания.

Задачей настоящего изобретения является разработка способа экспериментального моделирования миграции бактерий в головной мозг на фоне ожоговой травмы с целью разработки эффективных мероприятий, направленных на предупреждение интрацеребральных поражений при ожоговой травме.

Технический результат предложенного способа основан на максимальном приближении экспериментального моделирования миграции бактерий в головной мозг к естественным условиях развития и течения ожоговой болезни. В качестве лабораторной модели для реализации предложенного способа выбраны кролики, в организме которых имеется в достаточном количестве фермент, разрушающий нерастворимые полисахариды, основные поверхностные химические соединения капсул и биопленок бактерий.

Для воспроизведения экспериментального моделирования проникновения бактерий в головной мозг учитывали влияние дополнительных факторов, влияющих на проникновение бактерий в головной мозг: снижение иммунного статуса организма в результате ожоговой болезни, повышение проницаемости ГЭБ для бактерий, имеющих на своей поверхности полисахаридные структуры, а также способность cахаров проникать через ГЭБ в результате облегченной диффузии.

В организме человека имеются ферменты, разрушающие полисахариды (поверхностные структуры микробных клеток), в результате этого микробные клетки, освобожденные от биопленок, могут проникать в головной мозг. Полисахариды микробных клеток являются источником глюкозы и поэтому в головном мозгу, очевидно, на фоне ожоговой травмы преобладает анаэробный способ получения энергии (анаэробный гликолиз). В головном мозгу возникает гипоксия, являющаяся основной причиной повреждения головного мозга при ожоговой травме. При гипоксии отмечается гибель нейронов [S. Wolf et all. Die Blut-Hirn-Schranke: ′Eine Besonderheit des cerebralen Mikrozirkulationssystems // Naturwissenschaften. - 1996.- №83.- С.302-311; S. Ohtsuki. New Aspects of the Blood-Brain Barrier Transporters; Its Physiological Roles in the Central Nervous System // Biological Pharmaceutical Bulletin. - 2004. - №27 (10). - с.1489-1496].

У ожоговых больных возникает геморрагический и ишемический инсульт, менингит и энцефалопатия [Хрулев С.Е. Ожоговая травма с церебральными осложнениями у взрослых и детей (клиника, механизмы развития, профилактика). Автореф. дис. докт. мед. наук. - Нижний Новгород, 2009. - 30 с.]. Повышенная концентрация глюкозы в головном мозгу вызывает отек мозговой ткани.

В качестве дополнительных факторов, влияющих на повышение проницаемости ГЭБ, использовано повышение температуры окружающего воздуха, обычно регистрируемое в летний период года, а также обеспечивали повышенную концентрацию кислорода во вдыхаемом животными воздухе.

Следует отметить также, что в комплексном лечении ожоговых больных ведущее место занимает метод окигенотерапии.

Известно, что потребление кислорода центральной нервной системой составляет 20% от общего количества кислорода, потребляемого организмом. По сравнению с другими органами мозг обладает наименьшими запасами питательных веществ и поэтому нервные клетки не могут обеспечить свои энергетические потребности путем одного лишь анаэробного гликолиза. В головном мозгу имеет место аэробный и анаэробный механизм получения энергии [http://ru.wikipedia.org/wiki/]. При аэробном типе дыхания в результате окислительно-восстановительных реакций выделяется СО₂ (углекислый газ). В периодической литературе описан способ повышения проницаемости ГЭБ у лабораторных животных в результате вдыхания углекислого газа [http://n-t.ru/nj/nz/1986/1101.htm]. Следует отметить, что у бактерий рода Pseudomonas нет фермента фосфофруктокиназы и поэтому при ферментативном расщеплении глюкозы (цикл трикарбоновых кислот) образуется СО₂ (углекислый газ) [Медицинская микробиология, вирусология и иммунология: Учебник / Под ред. А.А. Воробьева. - М.: Медицинское информативное агентство, 2004. - 691 с., стр.57-58.]. Следовательно, в нашем способе экспериментального моделирования миграции бактерий в головной мозг дополнительным фактором снижающим проницаемость ГЭБ служил углекислый газ.

В предложенном способе экспериментального моделирования отражены основные механизмы проникновения микробных популяций в головной мозг и прослеживаются основные патофизиологические изменения в организме при проникновении бактерий в головной мозг, что позволит разработать основные мероприятия, направленные на снижение патологических процессов в головном мозгу у ожоговых больных.

Технический результат достигают тем, что согласно изобретения здоровых кроликов массой 2000-2500 грамм после срока карантина содержат в течение 8 часов при температуре воздуха 34-36°С, затем температуру воздуха снижают до 24-26°С и через 24 часа наносят под наркозом термический ожог, площадью 10-20% от площади поверхности тела, в течение часа после ожога кроликам создают дополнительные условия для дыхания, используя газовую смесь, содержащую 80% кислорода и 20% азота, затем через 24 часа животным вводят подкожно по 1 мл некультурабельных бактерий Pseudomonas aeruginosa и Staphylococcus aureus в концентрациях 10⁴-10⁵ микробных клеток в 1 мл и через 12 часов снова повышают температуру воздуха до 34-36°С в течение 8 часов, а затем в течение 5 суток определяют признаки поражения головного мозга и регистрируют сроки гибели животных.

Сущность способа достигается тем, что для развития патофизиологических процессов в головном мозгу использована определенная последовательность воздействия различных факторов, влияющих на поражение головного мозга у лабораторных животных.

Использование кислорода в процессе дыхания кроликов с образованием конечного продукта СО₂ оказывало влияние на снижение проницаемости ГЭБ. Образование углекислого газа происходило также в процессе репродукции бактерий P. aeruginosa. Повышение температуры окружающего воздуха также способствовало повышению проницаемости ГЭБ, а ожоговая травма оказывала влияние на снижение иммунобиологической реактивности организма животных.

В качестве лабораторной модели выбрано лабораторное животное, в организме которого имеется в достаточном количестве фермент, разрушающий капсулы и биопленки бактерий. Для заражения животных выбрана культура Р. aeruginosa, обладающая способностью формировать биопленку и при бактериологическом обследовании больных часто высевалась с поверхности ожоговых ран, а проникновение в головной мозг бактерий, имеющих на своей поверхности полисахаридные химические структуры, происходило по типу поступления в головной мозг питательных веществ.

Биопленки бактерий состоят из нерастворимых полисахаридов, которые могут проходить через ГЭБ в результате облегченной диффузии специальными транспортными системами. Так, проникновение глюкозы в головной мозг обеспечивает GLUT-1-транспортер [Agus D.B. et all. Vitamin С crosses the blood-brain barrier in the oxidized form through the glucose transporters // J. Clin Invest. - 1997. - №100. - с.2842-2848.]. В головном мозгу бактерии, освобождаясь от биопленок, вызывают инфекционный процесс. В ближайшем аналоге изобретения (т.е. «прототипе») отмечен описанный выше механизм проникновения Р. aeruginosa в головной мозг, однако, способ, описанный в «прототипе», предназначен для предупреждения возможности проникновения Р. aeruginosa в головной мозг с целью обеспечения эффективного лечения больных муковисцидозом. Предложенный нами способ экспериментального моделирования миграции бактерий в головной мозг предназначен для выявления механизмов проникновения Р. aeruginosa в головной мозг и разработки эффективных способов лечения ожоговой болезни.

Перед началом запланированных исследований для выявления влияния преморбидного фона у кроликов на результаты эксперимента использовано повышение температуры воздуха до 34-36°С в течение 8 часов. При повышении температуры тела кроликов выше физиологических норм кроликов в опыт не брали.

Предлагаемый способ осуществляют следующим образом:

Здоровых кроликов массой 2000-2500 грамм после срока карантина помещают в экспериментальные клетки малых размеров (Заявка №2013119320 от 18.01.13 «Устройство для проведения экспериментов на кроликах), снабженных патрубком для подачи в клетку смеси кислорода и азота. Продолжительность адаптации животных к новым клеткам составила 3 дня, затем в течение 8 часов в клетках поддерживали температуру окружающего воздуха 34-36°С для выявления преморбидного фона, затем температуру воздуха снижали до 24-26°С и через 24 часа наносили под наркозом термический ожог площадью 10-20% от площади поверхности тела.

Наркоз осуществляли по следующей методике: премедикацию проводили 2%-ным раствором ксилазина гидрохлорида (рометара) в дозе 5,0 мг/кг, а на его фоне внутримышечно вводили 5%-ный раствор золетина в дозе 7,5 мг/кг массы тела кролика соответственно. Со спины и боковой поверхности тела кролика удаляли волосяной покров. Затем погружали очищенную от шерсти поверхность в водяную баню на 10 с при температуре 90°С. На ожоговую поверхность накладывали стерильную асептическую марлевую повязку с мазью левомеколь.

В течение часа после ожога кроликам создавали дополнительные условия для дыхания, используя газовую смесь, содержащую 80% кислорода и 20% азота. В патрубок экспериментальной клетки подавали кислородную смесь из кислородного баллончика ПРАНА KISLOROD K161, затем через 24 часа животным вводили подкожно по 1 мл некультурабельных бактерий P. aeruginosa и S. aureus в концентрациях 10⁴-10⁵ микробных клеток в 1 мл и через 12 часов снова повышали температуру окружающего воздуха до 34-36°С в течение 8 часов, а затем в течение 5 суток определяли признаки поражения головного мозга и сроки гибели животных.

Примеры использования предложенной экспериментальной модели

Пример 1

Кролика содержали в клетке в соответствии с требованиями санитарных правил (Утв. Главным Государственным санитарным врачом №1045-73). Здорового кролика породы «шиншилла» массой 2000 грамм после срока карантина помещали в экспериментальную клетку (Заявка на полезную модель №2013119320 от 18.01.13 «Устройство для проведения экспериментов на кроликах») снабженную патрубком для подачи в клетку газовой смеси, содержащей кислород и азот.

В течение 3-х дней происходила адаптации животного к экспериментальной клетке. Затем в течение 8 часов в клетке поддерживали температуру воздуха 34-36°С для выявления преморбидного фона у животного. Животных с температурой тела выше или ниже физиологических норм отбраковывали. Перед термической травмой животного содержали при температуре воздуха 24-26°С в течение 24 часов, затем осуществляли наркоз по следующей методике: премедикацию проводили 2%-ным раствором ксилазина гидрохлорида (рометара) в дозе 5,0 мг/кг, а на его фоне внутримышечно вводили 5%-ный раствор золетина в дозе 7,5 мг/кг массы тела кролика соответственно.

После наркоза наносили термический ожог. Со спины и боковой поверхности тела кролика удаляли волосяной покров. Поверхность кролика, очищенную от шерсти, погружали в водяную баню на 10 сек при температуре 90°С. Площадь глубокого ожога составила 14,5% площади поверхности тела. На ожоговую поверхность накладывали стерильную асептическую марлевую повязку с мазью левомеколь.

В течение часа после ожога кролику создавали дополнительные условия для дыхания, используя газовую смесь, содержащую 80% кислорода и 20% азота. В патрубок экспериментальной клетки подавали газовую смесь из кислородного баллончика ПРАНА KISLOROD K161, затем через 24 часа животному вводили подкожно по 1 мл некультурабельных бактерий Р. aeruginosa и S. aureus в концентрации 10⁵ микробных клеток в 1 мл и через 12 часов снова повышали температуру в клетке до 34-36°С в течение 8 часов. На вторые сутки после введения микробной взвеси животное погибло при наличии клинических признаков (вялость, стон, крик, судороги). При вскрытии животного отмечен отек головного мозга, при бактериологическом исследовании выделена культура Р. aeruginosa. Животное погибло в результате отека головного мозга и проникновения Р. aeruginosa в мозговую ткань через ГЭБ.

Пример 2

Кролика содержали в клетке в соответствии с требованиями санитарных правил (Утв. Главным Государственным санитарным врачом №1045-73). Здорового кролика породы «шиншилла» массой 2400 грамм после срока карантина помещали в экспериментальную клетку (Заявка на полезную модель №2013119320 от 18.01.13 «Устройство для проведения экспериментов на кроликах») снабженную патрубком для подачи в клетку газовой смеси.

В течение 3-х дней происходила адаптации животного к экспериментальной клетке. Затем в течение 8 часов в клетке поддерживали температуру воздуха 34-36°С для выявления преморбидного фона у животного. Животных с температурой тела выше или ниже физиологических норм отбраковывали. Затем температуру воздуха снижали до 24-26°С и через 24 часа под наркозом наносили термический ожог.

Наркоз осуществляли по следующей методике: премедикацию проводили 2%-ным раствором ксилазина гидрохлорида (рометара) в дозе 5,0 мг/кг, а на его фоне внутримышечно вводили 5%-ный раствор золетина в дозе 7,5 мг/кг массы тела кролика соответственно.

После наркоза со спины и боковой поверхности тела кролика удаляли волосяной покров. Поверхность кролика, очищенную от шерсти, погружали в водяную баню на 10 с при температуре 90°С. Площадь глубокого ожога составила 19,9% площади поверхности тела. На ожоговую поверхность накладывали стерильную асептическую марлевую повязку с мазью левомеколь.

В течение часа после ожога кролику создавали условия для дыхания газовой смесью, содержащей 80% кислорода и 20% азота. В патрубок экспериментальной клетки подавали смесь газов из кислородного баллончика ПРАНА KISLOROD К 161, затем через 24 часа животному вводили подкожно по 1 мл некультурабельных бактерий Р. aeruginosa и S. aureus в концентрации 10⁴ микробных клеток в 1 мл и через 12 часов снова повышали температуру окружающего воздуха до 34-36°С в течение 8 часов. Через 23 часа после введения микробной взвеси животное погибло при наличии клинических признаков (возбуждение, стон, крик, судороги). При вскрытии животного отмечен отек головного мозга, при бактериологическом исследовании выделена культура Р. aeruginosa. Животное погибло в результате отека головного мозга и проникновения Р. aeruginosa в мозговую ткань через ГЭБ.

Пример 3

Кролика содержали в клетке в соответствии с требованиями санитарных правил (Утв. Главным Государственным санитарным врачом №1045-73). Здорового кролика породы «шиншилла» массой 2300 грамм после срока карантина помещали в экспериментальную клетку (Заявка на полезную модель №2013119320 от 18.01.13 «Устройство для проведения экспериментов на кроликах»), снабженную патрубком для подачи в клетку газовой смеси.

В течение 3-х дней происходила адаптации животного к экспериментальной клетке. Затем в течение 8 часов в клетке поддерживали температуру воздуха 34-36°С для выявления преморбидного фона у животного. Животных с температурой тела выше или ниже физиологических норм отбраковывали. Затем температуру воздуха снижали до 24-26°С и через 24 часа наносили под наркозом термический ожог.

Наркоз осуществляли по следующей методике: премедикацию проводили 2% раствором ксилазина гидрохлорида (рометара) в дозе 5,0 мг/кг, а на его фоне внутримышечно вводили 5% раствор золетина в дозе 7,5 мг/кг массы тела кролика соответственно.

После наркоза со спины и боковой поверхности тела кролика удаляли волосяной покров. Поверхность кролика, очищенную от шерсти, погружали в водяную баню на 10 с при температуре 90°С. Площадь глубокого ожога составила 13,8% площади поверхности тела. На ожоговую поверхность накладывали стерильную асептическую марлевую повязку с мазью левомеколь.

В течение часа после нанесения ожога кролику создавали дополнительные условия для дыхания, используя газовую смесь, содержащую 80% кислорода и 20% азота. В патрубок экспериментальной клетки подавали газовуюсмесь из кислородного баллончика ИРАНА KISLOROD K161, затем через 24 часа кролику вводили подкожно по 1 мл некультурабельных бактерий Р. aeruginosa и S. aureus в концентрации 10⁴ микробных клеток в 1 мл и через 12 часов снова повышали температуру в клетке до 34-36°С в течение 8 часов. На третьи сутки после введения микробной смеси животное погибло при наличии клинических признаков (вялость, стон, крик, судороги). При вскрытии животного отмечен отек головного мозга, при бактериологическом исследовании выделена культура Р. aeruginosa. Животное погибло в результате отека головного мозга и проникновения Р. aeruginosa в мозговую ткань через ГЭБ.

Приведенные примеры иллюстрируют возможность использования предложенного способа экспериментального моделирования миграции бактерий в головной мозг для разработки эффективных методов лечения и предупреждения развития патологических процессов в головном мозгу при ожоговой травме. Работа выполнена на базе вивария при Государственном аграрном университете Северного Зауралья. Под наблюдением находилось 7 кроликов породы «шиншилла». Летальный исход отмечен у 7 кроликов. У животных отмечались клинические признаки поражения головного мозга (стон, крик, возбуждение, судороги), отек мозговой ткани и выделение бактерий Р. aeruginosa из мозговой ткани. Результаты проведенных исследований представлены в таблице 1.

Анализ полученных данных дает основание полагать, что патологический процесс в головном мозгу возникает за счет гипоксии в клетках головного мозга, анаэробного типа дыхания, сопровождающегося высокой концентрацией глюкозы в тканях головного мозга, и в результате этого возникает отек в различных отделах головного мозга. Дополнительными факторами, влияющими на развитие патологического процесса в организме, являются: инфекционный процесс, вызванный P. aeruginosa, и окислительно-восстановительные реакции в мозговой ткани, сопровождающиеся выделением углекислого газа. Подводя общий итог, следует отметить, что температурный фактор, выделение углекислого газа и ожоговая травма оказывают существенное влияние на снижение проницаемости ГЭБ у данных лабораторных животных.

Отличительные признаки предложенного способа экспериментального моделирования миграции бактерий в головной мозг на фоне ожоговой травмы по сравнению с ближайшим аналогом изобретения (т.е. «прототипом» заключаются в следующем:

1. Предложенный способ экспериментального моделирования миграции бактерий в головной мозг на фоне ожоговой травмы предназначен для совершенствования методов лечения и профилактики инфекционных осложнений при ожоговой болезни, а «прототип» - для лечения хронического заболевания «Муковисцидоза».

2. В предложенном способе экспериментального моделирования миграции бактерий в головной мозг на фоне ожоговой травмы происходит перевод бактерий из некультурабельного в культурабельное состояние с последующем проникновением бактерий в головной мозг, а в «прототипе» использовано сложное химическое соединение: 4-[3,5-бис(2-гидроксифенил)-[1,2,4]триазол-1-ил] бензойная кислота или ее фармацевтически приемлемая соль для предупреждения образования культурабельными бактериями биопленок.

3. По результатам экспериментальных исследований предложенный способ экспериментального моделирования миграции бактерий в головной мозг позволяет определить основные направления по реализации поставленной цели: совершенствование методов лечения ожоговой болезни и использования выявленных механизмов проникновения бактерий в головной мозг для предупреждения церебральных осложнений при ожоговых травмах.

Способ экспериментального моделирования миграции бактерий в головной мозг на фоне ожоговой травмы