Способ приготовления препаратов костной ткани для проведения диагностики патологических процессов

Изобретение относится к нанотехнологии в области биологии, ветеринарии, медицины и может быть использовано в судебно-медицинской практике, хирургии и стоматологии.

Морфологическая диагностика патологических процессов в костной ткани, обеспечивающая выявление нативных клеточных структур в тканях зуба и костной ткани является широко применяемой и ведущей в распознавании большинства челюстно-лицевой патологии у людей различных возрастных групп. Использование атомно-силовой микроскопии (АСМ) для диагностики патологических процессов в костной ткани и контроля качества лечения пациентов с патологией соединительной ткани позволяет проводить морфологические исследования на современном уровне [http: - С.Н. Московский с соавт. Использование атомно-силовой микроскопии в изучении плотных тканей орофациальной области. Казанский медицинский журнал, 2012, том 93. - №6. - С. 887-891]. Однако до настоящего времени препараты для АСМ изготовляют с низким качеством.

Известен способ изготовления гистологических препаратов, включающий фиксацию костной ткани, декальцинацию, промывание проточной водой, обработку 5%-ным раствором серно-кислого лития и дегидратацию в спиртах [патент RU 2241994 С1 от 30.09.2003]. Такие препараты предназначены для исследования исключительно в микродиапазоне и не пригодны для исследования в АСМ из-за отсутсвия рельефа на поверхности препарата.

Описан способ приготовления костных препаратов включающий, распиливание костного материала на пластины с последующей шлифовкой и механическим выделением нефоссилизированного костного материала в затемненном помещении при освещении длинноволновой ультрафиолетовой люминесцентной лампой [патент RU 2484445 С2 от 10.06.2013]. Получают препарат с высокой поверхностной шероховатостью, что исключает возможность проведения анализа рельефа поверхности препарата и качественной морфологической диагностики препарата.

Предложено цитологическое исследование препарата, включающее проведение АСМ [Патент RU 2450790 С2 от 20.05.2012]. Однако данный способ применим только для диагностики злокачественных новообразований.

Наиболее близким является способ изготовления препаратов из эмалевых призм зубов [патент RU 2458675 от 23.02.2010]. Поверхность костного препарата разрушают полирующими абразивными частицами с однонаправленным линейным действием, что приводит к искажению рельефа препарата и затрудняет постановку морфологического диагноза при АСМ.

Задачей настоящего способа приготовления препаратов из костной ткани для проведения диагностики патологических процессов является создать щадящую обработку костной ткани, позволяющую сохранить нативный рельеф коллагеновых структур препарата для последующей морфологической диагностики препарата в АСМ.

Технический результат предложенного способа заключается в том, что ультразвуковую обработку поверхности препарата проводят в водной среде с тонкодисперсным абразивным веществом и создают условия для нелинейного, разнонаправленного действия абразивных частиц на поверхности препарата.

Вследствие ультразвуковой кавитации алмазной суспензии происходит разнонаправленное действие абразивных частиц. В суспензии образуются кавитационные полости (пузырьки), вызывающие движение алмазных частиц, которые разнонаправлено и спонтанно, мягко «бомбардируют» поверхность препарата.

Техническое решение предложенного способа приготовления препаратов из костной ткани для проведения диагностики патологических процессов, включающее фиксацию препарата, его шлифовку и полировку, отличающееся тем, что обработку препарата проводят в течение 50-70 минут в водной среде с тонкодисперсным абразивным веществом размером 1 мкм, воздействуя ультразвуком с частотой 20-24 кГц, затем препарат промывают в дистиллированной воде и высушивают при температуре 18-22°C.

Способ осуществляют следующим образом.

Костную ткань фиксируют в 10% нейтральном формалине в течение 24 часов, затем промывают проточной водопроводной водой в течение 100-140 минут. Костный материал распиливают на пластины размером 7×7×4 мм. Шлифование проводят шлифовальным кругом с зернистостью 600, а полирование - полировальными кругами с зернистостью 1200 и 2400.

Затем препарат обрабатывают в течение 50-70 минут в водной среде тонкодисперсным абразивным веществом размером 1 мкм, одновременно воздействуя ультразвуком с частотой 20-24 кГц.

Для этого препарат помещают в стеклянную емкость, заполненную дистиллированной водой в объеме 50 мл, добавляют 1,0 мл водной суспензии алмазной пудры с размером абразивных частиц 1 мкм. Затем стеклянную емкость помещают в ванну, где и проводят ультразвуковую обработку препарата в течение 50-70 минут.

Препарат промывают в дистиллированной воде в течение 30-40 минут и высушивают при температуре 18-22°C.

Предложенный способ поясняется графическим материалом.

На фигуре 1 представлено исследование в АСМ препарата костной ткани, обработанного предложенным способом, где 1 - костная лакуна, 2 - коллагеновые фибриллы, 3 - каналец остеоцита кости.

На фигуре 2 представлено исследование в АСМ препарата костной ткани приготовленного способом, описанным в прототипе, где 4 - артефакты на поверхности препарата, 5 - коллагеновые фибриллы не определяются, 6 - канальцы остеоцитов не видны.

Примеры практического использования способа

Пример 1. Для исследования взят отломок из зоны перелома трубчатой кости. Проведена обработка костной ткани по предложенному выше способу.

Результаты АСМ:

На скане, обработанном для визуализации в 3D, хорошо контурируются костные лакуны и отходящие от них канальцы остеоцитов. Между ними хорошо контурируются хаотично переплетенные между собой коллагеновые фибриллы.

Пример 2. Для исследования взята эмаль зуба. Проведена обработка костной ткани по предложенному выше способу.

Результаты АСМ:

На скане видны контуры полигональных эмалевых призм, внутри которых определяются кристаллы гидроксиапатита.

Исследование методом атомно-силовой микроскопии препаратов костной ткани приготовленных предложенным способом показало, что на поле сканирования определялись детали рельефа размером 20×20 Нм. Общепринятые методы приготовления костных препаратов не позволяли сохранять на препаратах детали рельефа таких размеров.

Приведенные примеры свидетельствуют о возможности применения предложенного способа приготовления костных препаратов для выявления наноструктур костной ткани, что значительно повышает качество морфологической диагностики препаратов с помощью АСМ. Предложенный способ позволяет получить обработанную поверхность 14 класса шероховатости Ra за счет изменения траектории действия абразивных частиц.

Предложенный способ приготовления препаратов из костной ткани апробирован на базе Омского областного бюро судебно-медицинской экспертизы. Проведена морфологическая диагностика костной ткани у 12 пациентов с различной патологией.