Результат интеллектуальной деятельности: СТАБИЛЬНЫЕ ПРЕПАРАТЫ СВЯЗЫВАЮЩЕГО СРЕДСТВА НА ОСНОВЕ IgG4

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

Настоящая заявка притязает на приоритет на основании предварительной заявки на выдачу патента США с регистрационным номером 61/615539, поданной 26 марта 2012 года, которая включена в настоящее описание в виде ссылки в полном объеме.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Антиген LIGHT человека является одной из возможных мишеней цитокинов, которые вовлечены в процессы хронического воспалительного аутоиммунного заболевания. В качестве представителя надсемейства лигандов TNF (TNFSF) LIGHT также известен как TNFSF14 или CD258. LIGHT экспрессируется на поверхности T-клеток при активации строго регулируемым образом. Однако LIGHT также конститутивно присутствует на регистрируемых уровнях на поверхности незрелых дендритных клеток и на T-клетках природных киллеров (NK) кишечника. LIGHT опосредует свои биологические эффекты через связывание трех рецепторов надсемейства TNF, включая рецептор лимфотоксина β (LTβR), медиатор проникновения вируса герпеса (HVEM) и рецептор-ловушку 3 (DcR3). LIGHT-экспрессирующие лимфоциты могут индуцировать IBD-подобные симптомы у человека, и повышение экспрессии LIGHT наблюдали у пациентов с активной формой болезни Крона и другими воспалительными расстройствами, такими как болезнь «трансплантат против хозяина».

CXCR5, также известный как рецептор лимфомы Беркитта (BLR1), CD185, MDR15 и MGC117347, представляет собой сопряженный с G-белком рецептор, который является представителем семейства рецепторов хемокинов CXC. Не подвергнутый процессингу предшественник CXCR5 имеет длину 372 аминокислоты с молекулярной массой 42 кДа. CXCR5 играет роль в миграции и локализации B-клеток в конкретных анатомических компартментах. Нокаутированные мыши не имеют периферических лимфатических узлов, имеют меньше пейеровых бляшек и имеют пониженные уровни B-клеток. CXCL13, также известный как BLC, является лигандом CXCR5. CXCL13 является хемоаттрактантом B-клеток.

Связывающие анти-LIGHT-средства и связывающие анти-CXCR5-средства являются терапевтически значимыми, и существует необходимость в приготовлении таких связывающих средств в виде лекарственных продуктов, которые можно вводить субъектам, особенно человеку, для лечения воспалительных заболеваний.

Чтобы разработать фармацевтический препарат, содержащий связывающее анти-LIGHT-средство или связывающее анти-CXCR5-средство, подходящее для внутривенного или подкожного введения, связывающее средство должно быть сконцентрировано примерно до 20 мг/мл или больше, обычно примерно до 100-150 мг/мл и даже до 250 мг/мл. При таких высоких концентрациях может возникать множество осложнений, включая увеличение вязкости, сдвиг pH, изменение окраски раствора и образование видимых частиц и частиц довидимого диапазона.

Приготовление препаратов таких связывающих средств дополнительно осложняется тем фактом, что такие средства в высокой степени склонны к агрегации при таких высоких концентрациях.

Приготовление препаратов IgG4-антител еще более осложняется тем фактом, что IgG4-антитела имеют тенденцию образовывать полумолекулы при высоких концентрациях в растворе. Однако IgG4-антитела представляют терапевтический интерес, поскольку они обладают пониженной эффекторной функцией.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Для удовлетворения указанных и других потребностей в настоящем изобретении предлагаются высокостабильные препараты связывающего IgG4-средства. Неожиданно были открыты высокостабильные препараты связывающего IgG4-средства в форме жидкостей и лиофилизированных порошков, которые содержат связывающее IgG4-средство и цитратный буфер, при этом pH препарата находится на уровне или ниже как значения pH около 6, так и значения изоэлектрической точки (pI) связывающего средства. Такие препараты улучшены по сравнению с обычными препаратами, которые часто приводят к димеризации связывающего средства, такого как антитело, при увеличении концентрации связывающего средства, такого как антитело, в препарате. В частности, препараты согласно изобретению способствуют снижению количества нежелательных побочных продуктов, включая агрегаты, полумолекулы, продукты распада, низкомолекулярные белки (LMWP), высокомолекулярные белки (HMWP) и перераспределение кислых, основных и нейтральных изоформ связывающего средства, такого как антитело, в препарате.

В некоторых аспектах изобретение относится к стабильному препарату, содержащему: связывающее средство, содержащее, по меньшей мере, часть Fc-области IgG4-антитела; и от примерно 5 до примерно 50 мМ цитрата в качестве буферного средства; при этом pH препарата находится на уровне или ниже как значения pH около 6, так и pI связывающего средства. В некоторых вариантах осуществления изобретения связывающим средством является антитело.

В некоторых вариантах осуществления изобретения связывающее средство или антитело связывается с лимфотоксин-подобным, проявляющим индуцируемую экспрессию и конкурирующим с гликопротеидом D вируса герпеса, за медиатор проникновения вируса герпеса, рецептор, экспрессируемый на лимфоцитах (LIGHT). В конкретных вариантах осуществления изобретения связывающее анти-LIGHT-средство или антитело содержит вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, при этом вариабельная область тяжелой цепи содержит определяющие комплементарность области (CDR), содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO:1, 2 и 3, и вариабельная область легкой цепи содержит CDR, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO:4, 5 и 6. В других конкретных вариантах осуществления изобретения антитело представляет собой полностью человеческое IgG4 анти-LIGHT-антитело, содержащее тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:7, и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:8.

В некоторых вариантах осуществления изобретения связывающее средство или антитело связывается с рецептором хемокина C-X-C типа 5 (CXCR5). В конкретных вариантах осуществления изобретения связывающее анти-CXCR5-средство или антитело содержит вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, при этом вариабельная область тяжелой цепи содержит определяющие комплементарность области (CDR), содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO:15, 16 и 17, и вариабельная область легкой цепи содержит CDR, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO:18, 19 и 20. В других конкретных вариантах осуществления изобретения антитело представляет собой гуманизированное IgG4 анти-CXCR5-антитело, содержащее тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:25, и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:26.

В некоторых вариантах осуществления изобретения концентрация антитела составляет от примерно 5 до примерно 280 мг/мл. В некоторых конкретных вариантах осуществления изобретения концентрация антитела составляет примерно 150 мг/мл. В других конкретных вариантах осуществления изобретения концентрация антитела составляет примерно 50 мг/мл. В следующих конкретных вариантах осуществления изобретения концентрация антитела составляет примерно 20 мг/мл. В следующих конкретных вариантах осуществления изобретения концентрация антитела составляет примерно 100 мг/мл.

В некоторых вариантах осуществления изобретения концентрация цитрата составляет от примерно 5 до примерно 15 мМ. В некоторых вариантах осуществления изобретения концентрация цитрата составляет примерно 10 мМ. В некоторых вариантах осуществления изобретения цитратный буфер представляет собой дигидрат цитрата натрия.

В некоторых вариантах осуществления изобретения pH препарата составляет от примерно pH 5 до примерно pH 6. В конкретных вариантах осуществления изобретения значение pH препарата выбрано из группы, состоящей из значений pH примерно pH 5,0, примерно pH 5,5 и примерно pH 6,0.

В некоторых конкретных вариантах осуществления изобретения pI связывающего средства или антитела составляет от примерно 6,8 до примерно 7,2. В альтернативных конкретных вариантах осуществления изобретения pI связывающего средства или антитела составляет от примерно 7,6 до примерно 8,4.

В некоторых конкретных вариантах осуществления изобретения препарат дополнительно содержит поверхностно-активное вещество. В некоторых конкретных вариантах осуществления изобретения концентрация поверхностно-активного вещества составляет от примерно 0,001% до примерно 0,1% масс./об. В некоторых вариантах осуществления изобретения поверхностно-активным веществом является полисорбат. В некоторых конкретных вариантах осуществления изобретения полисорбат представляет собой полисорбат 20. В некоторых конкретных вариантах осуществления изобретения концентрация полисорбата 20 составляет примерно 0,005% масс./об. В альтернативных конкретных вариантах осуществления изобретения концентрация полисорбата 20 составляет примерно 0,01% масс./об. В следующих альтернативных конкретных вариантах осуществления изобретения концентрация полисорбата 20 составляет примерно 0,02% масс./об.

В некоторых вариантах осуществления изобретения препарат дополнительно содержит средство для тоничности. В некоторых конкретных вариантах осуществления изобретения концентрация средства для тоничности составляет от примерно 0,1% до примерно 10% масс./об. В некоторых конкретных вариантах осуществления изобретения средством для тоничности является сахарид. В некоторых конкретных вариантах осуществления изобретения сахарид представляет собой маннит. В других конкретных вариантах осуществления изобретения концентрация маннита составляет от примерно 1% до примерно 10% масс./об. В следующих конкретных вариантах осуществления изобретения концентрация маннита составляет примерно 4%. В альтернативных конкретных вариантах осуществления изобретения сахарид представляет собой сахарозу. В некоторых конкретных вариантах осуществления изобретения концентрация сахарозы составляет от примерно 1% до примерно 10% масс./об. В некоторых конкретных вариантах осуществления изобретения концентрация сахарозы составляет примерно 5% масс./об. В альтернативных конкретных вариантах осуществления изобретения концентрация сахарозы составляет примерно 6% масс./об. В следующих конкретных вариантах осуществления изобретения концентрация сахарозы составляет примерно 4,5% масс./об. В следующих конкретных альтернативных вариантах осуществления изобретения средством для тоничности является хлорид натрия. В некоторых конкретных вариантах осуществления изобретения концентрация хлорида натрия составляет от примерно 0,01% до примерно 1%. В некоторых конкретных вариантах осуществления изобретения концентрация хлорида натрия составляет примерно 0,2%. В других конкретных вариантах осуществления изобретения средство для тоничности представляет собой сочетание сахарозы и хлорида натрия. В конкретных вариантах осуществления изобретения концентрация сахарозы составляет от примерно 1% до примерно 10% масс./об. в следующих конкретных вариантах осуществления изобретения концентрация хлорида натрия составляет от примерно 0,01% до примерно 1%. В альтернативных конкретных вариантах осуществления изобретения концентрация сахарозы составляет примерно 6% масс./об. и концентрация хлорида натрия составляет примерно 0,2%. В следующих альтернативных конкретных вариантах осуществления изобретения концентрация сахарозы составляет примерно 4,5% масс./об., и концентрация хлорида натрия составляет примерно 0,2%.

В некоторых вариантах осуществления изобретения препарат дополнительно содержит аминокислоту. В некоторых конкретных вариантах осуществления изобретения концентрация аминокислоты составляет от примерно 0,1% до примерно 5% масс./об. В некоторых конкретных вариантах осуществления изобретения аминокислота представляет собой пролин или аргинин. В конкретных вариантах осуществления изобретения концентрация пролина или аргинина составляет от примерно 1% до примерно 2% масс./об. В других конкретных вариантах осуществления изобретения концентрация пролина составляет примерно 1,5% масс./об. В альтернативных конкретных вариантах осуществления изобретения концентрация аргинина составляет примерно 1% масс./об.

В некоторых вариантах осуществления изобретения препарат представляет собой жидкий препарат. В других конкретных вариантах осуществления изобретения препарат представляет собой лиофилизированный препарат.

В некоторых вариантах осуществления изобретения препарат является стабильным в течение, по меньшей мере, 6 месяцев при +5°C. В альтернативных вариантах осуществления изобретения препарат является стабильным в течение, по меньшей мере, 9 месяцев при +5°C.

В некоторых вариантах осуществления изобретения в препарате наблюдают уменьшенное количество, по меньшей мере, одного побочного продукта, выбранного из группы, состоящей из агрегатов, полумолекул, продуктов распада, низкомолекулярных белков, высокомолекулярных белков и перераспределение кислых/основных/нейтральных изоформ антитела по сравнению либо с эталонным анти-LIGHT-препаратом, содержащим анти-LIGHT-антитело в фосфатно-солевом буфере при pH 7,3, либо с эталонным анти-CXCR5-препаратом, содержащим анти-LIGHT-антитело в фосфатно-солевом буфере при pH 7,3.

В некоторых конкретных вариантах осуществления изобретения изобретение относится к стабильному жидкому препарату антитела, подходящему для подкожного введения, при этом препарат содержит:

a) примерно 150 мг/мл полностью человеческого IgG4-антитела против LIGHT (лимфотоксин-подобный, проявляет индуцируемую экспрессию и конкурирует с гликопротеидом D HSV за HVEM, рецептор, экспрессируемый T-лимфоцитами), содержащего тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:7, и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:8;

b) примерно 10 мМ цитратный буфер;

c) примерно 0,005% полисорбат 20; и

d) примерно 4% маннит;

при этом pH препарата составляет примерно pH 5,5.

В других конкретных вариантах осуществления изобретения изобретение относится к стабильному жидкому препарату антитела, подходящему для внутривенного введения, при этом препарат содержит:

a) примерно 50 мг/мл полностью человеческого IgG4-антитела против LIGHT (лимфотоксин-подобный, проявляет индуцируемую экспрессию и конкурирует с гликопротеидом D HSV за HVEM, рецептор, экспрессируемый T-лимфоцитами), содержащего тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:7, и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:8;

b) примерно 10 мМ цитратный буфер; и

c) примерно 0,01% полисорбата 20;

при этом pH препарата составляет примерно pH 5,5.

В следующих конкретных вариантах осуществления изобретения изобретение относится к стабильному лиофилизированному препарату антитела, подходящему для внутривенного введения, при этом препарат содержит:

a) примерно 50 мг/мл полностью человеческого IgG4-антитела против LIGHT (лимфотоксин-подобный, проявляет индуцируемую экспрессию и конкурирует с гликопротеидом D HSV за HVEM, рецептор, экспрессируемый T-лимфоцитами), содержащего тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:7, и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:8;

b) примерно 10 мМ цитратный буфер;

c) примерно 0,01% полисорбата 20;

d) примерно 5% сахарозы; и

e) примерно 1,5% пролина;

при этом pH препарата составляет примерно pH 5,5.

В альтернативных конкретных вариантах осуществления изобретения изобретение относится к стабильному препарату антитела, содержащему:

a) примерно 20 мг/мл гуманизированного IgG4-антитела против CXCR5 (рецептора хемокина C-X-C типа 5), содержащего тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:25, и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:26;

b) примерно 10 мМ цитратный буфер;

c) примерно 0,02% полисорбата 20;

d) примерно 6% сахарозы; и

e) примерно 0,2% хлорида натрия;

при этом pH препарата составляет примерно pH 6,0.

В следующих альтернативных конкретных вариантах осуществления изобретения изобретение относится к стабильному препарату антитела, содержащему:

a) примерно 100 мг/мл гуманизированного IgG4-антитела против CXCR5 (рецептора хемокина C-X-C типа 5), содержащего тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:25, и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:26;

b) примерно 10 мМ цитратный буфер;

c) примерно 0,01% полисорбата 20;

d) примерно 4,5% сахарозы;

e) примерно 0,2% хлорида натрия; и

f) примерно 1% аргинина;

при этом pH препарата составляет примерно pH 6,0.

В некоторых вариантах осуществления изобретения, изобретение относится к набору, содержащему емкость, содержащую: 1) препарат по любому из предшествующих пунктов и 2) ярлык или инструкции по введению и применению препарата. В некоторых вариантах осуществления изобретения ярлык содержит одну или несколько или из следующих инструкций: инструкции по введению препарата, инструкции по применению препарата, инструкции, касающиеся условий хранения препарата, информацию, касающуюся номера партии и серии препарата и/или набора, информацию, касающуюся состава препарата, информацию о безопасности, информацию, касающуюся возможных неблагоприятных реакций, вторичных эффектов и/или побочных эффектов в связи с введением препарата, или информацию, касающуюся возможных показаний и/или противопоказаний препарата.

В некоторых вариантах осуществления изобретения изобретение относится к предварительно наполняемому устройству или предварительно наполняемой емкости, такой как шприц, картридж, флакон, ампула или шприц для самоинъекции, содержащий препарат согласно изобретению.

В некоторых других вариантах изобретение относится к набору, содержащему такой предварительно наполняемый шприц, картридж, флакон, ампулу или шприц для самоинъекции.

В некоторых вариантах изобретение относится к способу лечения воспалительного заболевания кишечника, включающему в себя введение субъекту, нуждающемуся в таком введении, препарата согласно изобретению.

В некоторых других вариантах изобретение относится к способу лечения ревматоидного артрита, включающему в себя введение субъекту, нуждающемуся в таком введении, препарата согласно изобретению.

В некоторых вариантах изобретение относится к препарату для применения в способе диагностики или лечения организма человека или животного. В конкретных вариантах препарат применяют для лечения воспалительного заболевания кишечника. В альтернативных вариантах препарат применяют для лечения ревматоидного артрита.

В некоторых вариантах осуществления изобретения изобретение относится к способу получения препарата согласно изобретению, включающему в себя смешивание компонентов препарата и корректировку pH, при этом получение осуществляют в стерильных условиях или препарат стерилизуют после смешивания компонентов и корректировки pH или обеих процедур.

В некоторых конкретных вариантах осуществления изобретения изобретение относится к способу получения стабильного препарата антитела, включающему в себя: a) получение связывающего анти-LIGHT-средства; b) ресуспендирование связывающего анти-LIGHT-средства в цитратном буфере, имеющем концентрацию от примерно 5 до примерно 50 мМ; и c) доведение значения pH препарата до pH 5,0 - pH 6,0.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР

Фиг. 1 является изображением геля, на котором показаны результаты экспериментов по изоэлектрическому фокусированию в денатурированном состоянии, которые использовали для определения изоэлектрической точки (pI) полностью человеческого IgG4-антитела против LIGHT, содержащего тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:7, и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:8, приготовленного в виде препарата в фосфатно-солевом буфере при pH 7,3 в концентрации 5,5 мг/мл («исходный препарат», «PBS-препарат» или «эталонная партия»). Дорожки 1 и 5: набор для калибровки IEF в широком диапазоне pI 5-10,5; дорожки 2 и 4: первая серия эталонной партии; дорожки 3 и 4: вторая серия эталонной партии. Значения pI указаны числами.

Фиг. 2 является изображением SDS-ПААГ-геля, на котором сравнивали разные серии эталонной партии в восстанавливающих и не восстанавливающих условиях. Дорожки 1 и 10: стандарт белка Biorad Precision Plus; дорожка 5: пустая; дорожка 2: первая серия эталонной партии в не восстанавливающих условиях; дорожки 3 и 4: вторая серия эталонной партии в не восстанавливающих условиях; дорожка 6: первая серия эталонной партии в восстанавливающих условиях; дорожки 7 и 8: вторая серия эталонной партии в восстанавливающих условиях; и дорожка 9: контроль системы. Размеры указаны числами в рядах.

На фиг. 3 показан график ELISA, который использовали для определения активности связывания антигена первой и второй серий эталонной партии.

На фиг. 4 показана хроматограмма, полученная при эксклюзивной хроматографии по размеру (SEC) первой серии эталонной партии. Как показано на фиг. 4, при SEC выявляли белки с высокой молекулярной массой (HMWP), например, ди/олигомеры (RRT0.8) или агрегаты, и белки с низкой молекулярной массой (LMWP) или продукты распада. Первая серия эталонной партии имела чистоту с содержанием мономера 97%.

На фиг. 5 показана хроматограмма, полученная при слабо-катионообменной хроматографии в случае первой серии эталонной партии. Как показано на фиг. 5, во время исследований стабильности происходило перераспределение кислых, нейтральных и основных изоформ. Первая серия эталонной партии имела распределение кислых/нейтральных/основных изоформ 42,3/55,6/1,9%.

На фиг. 6 показана термограмма дифференциальной сканирующей калориметрии первой серии эталонной партии. Как показано на фиг. 6, разворачивание трех доменов антитела происходит при 68°C, 75°C и 78°C.

На фиг. 7 показана картина динамического светорассеяния первой серии эталонной партии, которую не подвергали фильтрации. DLS использовали для определения гидродинамического диаметра мономера и потенциальных растворимых агрегатов антитела первой серии эталонной партии.

На фиг. 8 показана картина динамического светорассеяния первой серии эталонной партии, которую подвергали фильтрации. DLS использовали для определения гидродинамического диаметра мономера и потенциальных растворимых агрегатов антитела первой серии эталонной партии.

Фиг. 9 представляет собой схему операций в процессе производства лекарственного продукта в случае препарата с высокой концентрацией антитела.

На фиг. 10 показана картина динамического светорассеяния препарата 14. DLS использовали для определения гидродинамического диаметра мономера и потенциальных растворимых агрегатов антитела.

На фиг. 11 представлена картина геля, показывающая результаты изоэлектрического фокусирования для определения pI (изоэлектрической точки) лидирующего CXCR5-антитела. Дорожки 1,6: набор для калибровки IEF в широком диапазоне pI; дорожки 2,4: эталонное стандартное лидирующее антитело LP08031; и дорожки 3,5: лекарственная субстанция лидирующего антитела, RSN0151.

Фиг. 12 представляет собой картину SDS-ПААГ-геля, на котором сравнивали разные партии лекарственной субстанции в восстанавливающих и не восстанавливающих условиях. Гель также использовали для определения молекулярной массы лидирующего CXCR5-антитела и присутствия каких-либо агрегатов.

Фиг. 13 представляет собой график ELISA, который использовали для определения активности связывания с антигеном лидирующего CXCR5-антитела с 28-мерным пептидом антигена CXCR5.

Фиг. 14 представляет собой хроматограмму SEC подвергнутого стрессу лидирующего CXCR5-антитела. SEC позволяет выявлять белки с высокой молекулярной массой (HMWP), например, ди/олигомеры или агрегаты, и белки с низкой молекулярной массой (LMWP) или продукты распада. Лидирующее CXCR5-антитело имело чистоту 99% по содержанию мономера.

Фиг. 15 представляет собой хроматограмму WCX, которую использовали для определения кислых, нейтральных и основных изоформ лидирующего CXCR5-антитела. Лидирующее CXCR5-антитело имело распределение кислых/нейтральных/основных изоформ 14/85/1%.

На фиг. 16 показано измерение DLS, которое использовали для определения гидродинамического диаметра мономера и потенциальных растворимых агрегатов антитела.

Фиг. 17 представляет собой изображение лидирующего CXCR5-антитела в ацетатном буфере с pH 5,0 (слева) и pH 5,5 (справа); каждый по сравнению с WFI (водой для инъекции) и после термического стресса. Данная фигура показывает, что ацетат является подходящей буферной системой.

Фиг. 18 представляет собой изображение лидирующего CXCR5-антитела в гистидиновом буфере с pH 6,0 (слева), pH 5,5 (в середине) и pH 5,0 (справа); каждый по сравнению с WFI (водой для инъекций) и после термического стресса. На данной фигуре показано, что гистидин является подходящим буфером.

Фиг. 19 представляет собой изображение лидирующего CXCR5-антитела в трис-буфере с pH 7,5 после UF/DF (слева) и после фильтрации (справа); каждый против WFI (воды для инъекций) и после термического стресса. На данной фигуре показано, что трис является несовместимой буферной системой.

Фиг. 20 представляет собой изображение лидирующего CXCR5-антитела в цитратном буфере с pH 6,0 после UF/DF и фильтрации.

Фиг. 21 представляет собой изображение лидирующего CXCR5-антитела в ацетатном буфере pH с 5,5 после UF/DF и фильтрации.

Фиг. 22 представляет собой изображение лидирующего CXCR5-антитела в сукцинатном буфере с pH 5,0 после UF/DF и фильтрации.

Фиг. 23 представляет собой изображение лидирующего CXCR5-антитела в гистидиновом буфере с pH 5,0 после UF/DF и фильтрации.

Фиг. 24 представляет собой изображение лидирующего CXCR5-антитела в аргининовом буфере с pH 6,0 после UF/DF и фильтрации.

На фиг. 25 представлена картина внешнего вида растворов лидирующего CXCR5-антитела LA_09_016 с разными поверхностно-активными веществами (без поверхностно-активного вещества, с полисорбатом 20, полисорбатом 80, лутролом F68, кремофором RH40, солутолом HS15 и SDS) после механического стресса (350 об./мин, 2,5 часа, комнатная температура).

Фиг. 26 представляет собой график, который показывает увеличение количества димеров в условиях ускоренных испытаний, которое анализировали, используя SEC. Можно было наблюдать увеличение образования димеров до 10% после трех месяцев хранения во всех четырех гистидиновых препаратах. В ацетатных препаратах наблюдали повышение содержания димеров до 6%. Во всех четырех цитратных препаратах концентрация димеров была ниже 2% даже после трех месяцев при +40°C.

Фиг. 27 представляет собой график, показывающий увеличение содержания основных изоформ в условиях ускоренных испытаний, которое анализировали с использованием WCX. Гистидин является плохим для стабильности лидирующего CXCR5-антитела в условиях ускоренных испытаний. Можно отметить небольшое увеличение содержания основных изоформ для всех четырех ацетатных препаратов. Интересно, что невозможно было отличить между собой четыре цитратных препарата.

Фиг. 28 представляет собой график, показывающий уменьшение содержания нейтральных изоформ в условиях ускоренных испытаний, которое анализировали с использованием WCX. Данная фигура показывает сильное снижение содержания нейтральных изоформ в случае гистидиновых препаратов. Небольшое снижение наблюдали в ацетате. Цитрат влиял меньше всего.

На фиг. 29 показана разница pH всех четырех препаратов (A-D) в цитратном буферу в условиях ускоренных испытаний. Препараты, в наибольшей степени стабилизирующие pH, забуферены цитратом и особенно препарат B и D.

На фиг. 30 показана разница pH всех четырех препаратов (A-D) в ацетатном буфере в условиях ускоренных испытаний. В забуференных ацетатом растворах лидирующего CXCR5-антитела pH сдвигалось к более высокому значению.

На фиг. 31 показана разница pH всех четырех препаратов (A-D) в гистидиновом буфере в условиях ускоренных испытаний. В забуференных гистидином растворах лидирующего CXCR5-антитела значение pH немного снижалось.

Фиг. 32 представляет собой график, показывающий гидродинамический диаметр CXCR5 LA_09_027 A-D после 3 месяцев хранения при 40°C. В забуференных цитратом препаратах наблюдали только небольшие агрегаты спустя три недели в случае препарата C и после шести недель хранения в случае препарата A. Некоторое количество агрегатов также можно было выявить спустя три месяца в случае препарата B. Но по сравнению с забуференными ацетатом препаратами количество было очень маленьким.

Фиг. 33 представляет собой график, показывающий гидродинамический диаметр CXCR5 LA_09_028 A-D после 3 месяцев хранения при 40°C. В забуференном ацетатом препарате C наблюдали некоторое количество агрегатов <200 нм спустя три недели. В препарате A наблюдали некоторое количество агрегатов через три месяца.

Фиг. 34 представляет собой диаграмму, показывающую влияние возрастающих концентраций лидирующего CXCR5-антитела на Z-среднее. В случае лидирующего CXCR5-антитела наблюдали значимое увеличение гидродинамического диаметра (Z-среднее) при возрастании концентрации антитела.

Фиг. 35 представляет собой диаграмму, показывающую влияние разных стабилизаторов (эксципиентов) на Z-среднее в случае концентрации 100 мг/мл лидирующего CXCR5-антитела после термического стресса. Z-среднее измеряли до и после термического стресса. Стабилизирующий эффект был сходен в случае всех тестированных эксципиентов, но увеличение Z-среднего, в общем, было понижено при использовании в качестве стабилизаторов аминокислот (аргинина, лизина или глицина). Лизин исключали из-за более высокого содержания агрегатов после стресса. Аргинин влиял лучше, чем глицин.

Фиг. 36 представляет собой диаграмму, показывающую влияние разных стабилизаторов на Z-среднее в случае концентрации 100 мг/мл лидирующего CXCR5-антитела после механического стресса. Z-среднее измеряли до и после механического стресса. Такое же снижение Z-среднего было отмечено в присутствии аминокислот. Сахароза оказывала лучшее защитное действие, чем трегалоза от механического стресса. Аргинин и глицин работали лучше в сочетании с NaCl.

Фиг. 37 представляет собой набор графиков, показывающих распределение размера частиц, которое измеряли, используя DLS, лидирующего CXCR5-антитела, приготовленного в виде препарат в 10 мМ цитратном буфере при pH 6, до механического стресса (A) и после механического стресса (B). Виды с более высокой молекулярной массой измеряли, используя DLS, после механического стресса лекарственной субстанции (ЛС).

Фиг. 38 представляет собой набор графиков, показывающих распределение размера частиц, которое измеряли, используя DLS, в прототипных препаратах лекарственного продукта лидирующего CXCR5-антитела (A-D; таблица 111) до (A) и после (B) механического стресса.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ

A. Определения

Если не определено иное, все технические и научные термины, используемые в настоящем описании, имеют такое же значение, которые обычно подразумевает специалист в данной области.

Следует отметить, что в используемом в настоящем описании и прилагаемой формуле изобретения смысле формы единственного числа также включают указание и множественного числа, если контекст ясно не диктует иное.

Термин «примерно» или «приблизительно» означает в пределах 10%, например, в пределах 5% (или 1% или меньше) от данного значения или диапазона.

Термины «вводить» или «введение» относятся к действию, осуществляемому в виде инъекции или другой физической доставки пациенту вещества, которое находится вне организма (например, препарата согласно изобретению), такой как мукозальная, интрадермальная, внутривенная, подкожная, внутримышечная доставка и/или любой другой способ физической доставки, описанный в настоящей публикации или известный в данной области. В том случае, когда заболевание или его симптом подвергают лечению, введение вещества обычно происходит после появления заболевания или его симптомов. В том случае, когда заболевание или его симптомы подвергают профилактике, введение вещества обычно происходит до наступления заболевания или его симптомов.

В контексте полипептида термин «аналог» относится к полипептиду, который обладает сходной или идентичной функцией, что и полипептид LIGHT или CXCR5, фрагмент полипептида LIGHT или CXCR5, эпитоп LIGHT или CXCR5 или анти-LIGHT- или анти-CXCR5-антитело, но не обязательно содержит аминокислотную последовательность, сходную или идентичную аминокислотной последовательности полипептида LIGHT или CXCR5, фрагмента полипептида LIGHT или CXCR5, эпитопа LIGHT или CXCR5 или анти-LIGHT- или анти-CXCR5-антитело, или обладает структурой, сходной или идентичной структуре полипептида LIGHT или CXCR5, фрагмента полипептида LIGHT или CXCR5, эпитопа LIGHT или CXCR5 или анти-LIGHT- или анти-CXCR5-антитела. Полипептид, который имеет сходную аминокислотную последовательность, относится к полипептиду, который удовлетворяет, по меньшей мере, одному из следующих условий: (a) полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, на 30%, по меньшей мере, на 35%, по меньшей мере, на 40%, по меньшей мере, на 45%, по меньшей мере, на 50%, по меньшей мере, на 55%, по меньшей мере, на 60%, по меньшей мере, на 65%, по меньшей мере, на 70%, по меньшей мере, на 75%, по меньшей мере, на 80%, по меньшей мере, на 85%, по меньшей мере, на 90%, по меньшей мере, на 95% или, по меньшей мере, на 99% идентична аминокислотной последовательности полипептида LIGHT или CXCR5 (например, SEQ ID NO:9 или SEQ ID NO:14, соответственно), фрагмента полипептида LIGHT или CXCR5, эпитопа LIGHT или CXCR5 или анти-LIGHT- или анти-CXCR5-антитела, описанного в настоящей публикации; (b) полипептид, кодируемый нуклеотидной последовательностью, которая гибридизуется в жестких условиях с нуклеотидной последовательностью, кодирующей полипептид LIGHT или CXCR5, фрагмент полипептида LIGHT или CXCR5, эпитоп LIGHT или CXCR5 или анти-LIGHT- или анти-CXCR5-антитело (или его VH- или VL-область), описанное в настоящей публикации, длиной по меньшей мере, 5 аминокислотных остатков, по меньшей мере, 10 аминокислотных остатков, по меньшей мере, 15 аминокислотных остатков, по меньшей мере, 20 аминокислотных остатков, по меньшей мере, 25 аминокислотных остатков, по меньшей мере, 40 аминокислотных остатков, по меньшей мере, 50 аминокислотных остатков, по меньшей мере, 60 аминокислотных остатков, по меньшей мере, 70 аминокислотных остатков, по меньшей мере, 80 аминокислотных остатков, по меньшей мере, 90 аминокислотных остатков, по меньшей мере, 100 аминокислотных остатков, по меньшей мере, 125 аминокислотных остатков, или по меньшей мере 150 аминокислотных остатков (смотрите, например, Sambrook с соавторами (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.; Maniatis с соавторами (1982) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y.); и (c) полипептид, кодируемый нуклеотидной последовательностью, которая, по меньшей мере, на 30%, по меньшей мере, на 35%, по меньшей мере, на 40%, по меньшей мере, на 45%, по меньшей мере, на 50%, по меньшей мере, на 55%, по меньшей мере, на 60%, по меньшей мере, на 65%, по меньшей мере, на 70%, по меньшей мере, на 75%, по меньшей мере, на 80%, по меньшей мере, на 85%, по меньшей мере, на 90%, по меньшей мере, на 95% или, по меньшей мере, на 99% идентична нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид LIGHT или CXCR5, фрагмент полипептида LIGHT или CXCR5, эпитоп LIGHT или CXCR5 или анти-LIGHT- или анти-CXCR5-антитело (или его VH- или VL-область), описанные в настоящей публикации. Полипептид со структурой, сходной со структурой полипептида LIGHT или CXCR5, фрагмента полипептида LIGHT или CXCR5, эпитопа LIGHT или CXCR5 или анти-LIGHT- или анти-CXCR5-антитела относится к полипептиду, который имеет вторичную, третичную или четвертичную структуру, сходную со структурой полипептида LIGHT или CXCR5, фрагмента полипептида LIGHT или CXCR5, эпитопа LIGHT или CXCR5 или антитела против LIGHT или CXCR5. Структуру полипептида можно определить способами, известными специалистам в данной области, включая без ограничения рентгеновскую кристаллографию, ядерный магнитный резонанс и кристаллографическую электронную микроскопию.

Чтобы определить идентичность в процентах двух аминокислотных последовательностей или двух последовательностей нуклеиновой кислоты, последовательности выравнивают в целях оптимального сравнения (например, могут быть введены пробелы в последовательность первой аминокислотной последовательности или последовательности нуклеиновой кислоты для оптимального выравнивания со второй аминокислотной последовательностью или последовательностью нуклеиновой кислоты). Затем сравнивают аминокислотные остатки или нуклеотиды в соответствующих положениях аминокислот или положениях нуклеотидов. Если положение в первой последовательность занято таким же аминокислотным остатком или нуклеотидом, как и в соответствующем положении во второй последовательности, то молекулы являются идентичными в таком положении. Идентичность в процентах между двумя последовательностями является функцией количества идентичных положений, имеющихся в последовательностях (т.е., идентичность в % = количество идентичных перекрывающихся положений/общее количество положений ×100%). В одном варианте две последовательности имеют одинаковую длину.

Определение идентичности в процентах между двумя последовательностями (например, аминокислотными последовательностями или последовательностями нуклеиновой кислоты) также можно осуществить, используя математический алгоритм. Не ограничивающим примером математического алгоритма, используемого для сравнения двух последовательностей является алгоритм Карлина и Альтшуля, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87: 2264 2268, модифицированный согласно публикации Karlin and Altschul, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90: 5873-5877. Такой алгоритм включен в программы NBLAST и XBLAST (Altschul с соавторами, 1990, J. Mol. Biol. 215: 403. Поиск нуклеотидов BLAST может быть осуществлен с использованием набора параметров программы для нуклеотидов NBLAST, например, в случае счета = 100, длина слова = 12, чтобы получить нуклеотидные последовательности, гомологичные представляющим интерес молекулам нуклеиновой кислоты. Поиски белков BLAST можно осуществлять с использованием набора параметров программы XBLAST, например, для счета 50, длина слова = 3, чтобы получить аминокислотные последовательности, гомологичные представляющей интерес молекуле. Чтобы получить выравнивания с пробелами в целях сравнения, можно использовать Gapped BLAST, как описано в работе Altschul с соавторами, 1997, Nucleic Acids Res. 25: 3389 3402. Альтернативно можно использовать PSI BLAST, чтобы осуществить итерационный поиск, который позволяет выявлять отдаленные взаимосвязи между молекулами (там же). При использовании программ BLAST, Gapped BLAST и PSI Blast можно применять параметры соответствующих программ по умолчанию (например, XBLAST и NBLAST) (смотрите, например, National Center for Biotechnology Information (NCBI) в Интернете ncbi dotnlm dot nih dot gov). Другим не ограничивающим примером математического алгоритма, используемого для сравнения последовательностей, является алгоритм Myers и Miller, 1988, CABIOS 4: 11 17. Такой алгоритм включен в программу ALIGN (версия 2.0), которая является частью пакета компьютерных программ для выравнивания последовательностей GCG. При использовании программы ALIGN для сравнения аминокислотных последовательностей можно применять таблицу весов остатков PAM120, штраф за длину пробела 12 и штраф за пробел 4.

Идентичность в процентах между двумя последовательностями можно определить, используя способы, сходные со способами, описанными, допуская или не допуская пробелы. При вычислении идентичности в процентах обычно подсчитывают только точные совпадения.

«Антагонист» или «ингибитор» относится к молекуле, способной ингибировать одну или несколько биологических активностей молекулы-мишени. Антагонисты могут мешать связыванию рецептора с лигандом и наоборот за счет выведения из строя или убивания клеток, активируемых лигандом, и/или мешая активации рецептора или лиганда (например, активации тирозинкиназы) или трансдукции сигнала после связывания лиганда с рецептором. Антагонист может полностью блокировать взаимодействия рецептор-лиганд или может в значительной степени уменьшать такие взаимодействия. Все такие точки вмешательства антагониста следует считать эквивалентными в целях настоящего изобретения.

Например, «антагонист» или «ингибитор» LIGHT относится к молекуле, которая способна ингибировать или иным образом снижать одну или несколько биологических активностей LIGHT, например, в клетке, экспрессирующей LIGHT, или в клетке, экспрессирующей лиганд LIGHT, такой как рецептор LIGHT. Например, в некоторых вариантах антитела согласно изобретению представляют собой антагонистические антитела, которые ингибируют или иным образом снижают секрецию CCL20, IL-8 и/или RANTES из клетки, имеющей экспрессируемый на клеточной поверхности рецептор LIGHT (например, HVEM, LTpR и/или DcR3) в том случае, когда указанное антитело контактирует с указанной клеткой. В некоторых вариантах антагонист LIGHT (например, антагонистическое антитело согласно изобретению) может, например, действовать, ингибируя или иным образом снижая активацию и/или пути передачи клеточного сигнала в клетке, экспрессирующей рецептор LIGHT, тем самым ингибируя опосредованную LIGHT биологическую активность клетки по сравнению с опосредованной LIGHT биологической активностью в отсутствие антагониста. В некоторых вариантах осуществления изобретения анти-LIGHT-антитела являются полностью человеческими, антагонистическими анти-LIGHT-антителами, такими как полностью человеческие моноклональные антагонистические анти-LIGHT-антитела.

Например, «антагонист» или «ингибитор» CXCR5 относится к молекуле, способной ингибировать одну или несколько биологических активностей, таких как передача сигнала через CXCR5. Таким образом, в объем изобретения включены антагонисты (например, нейтрализующие антитела), которые связываются с CXCR5, CXCL13 или другими лигандами CXCR5 или комплексом CXCR5 и его лиганда, такого как CXCL13; варианты или производные аминокислотной последовательности CXCR5 или CXCL13, которые антагонизируют взаимодействие между CXCR5 и лигандом, таким как CXCL13; растворимый CXCR5, необязательно слитый с гетерологичной молекулой, такой как область иммуноглобулина (например, иммуноадгезином); комплекс, содержащий CXCR5 в ассоциации с другим рецептором или биологической молекулой; пептиды с синтетической или нативной последовательностью, которые связываются с CXCR5; и так далее.

Термины «антитело», «иммуноглобулин» или «Ig» могут быть использованы в настоящем описании взаимозаменяемо. Термин антитело включает без ограничения синтетические антитела, моноклональные антитела, рекомбинантно полученные антитела, полиспецифичные антитела (включая биспецифичные антитела), человеческие антитела, гуманизированные антитела, химерные антитела, интраантитела, одноцепочечные Fv (scFv) (например, включая моноспецифичные, биспецифичные и т.д.), верблюдизированные антитела, Fab-фрагменты, F(ab’)-фрагменты, связанные дисульфидными связями Fv (sdFv), анти-идиотипические (анти-Id)-антитела и связывающие эпитоп фрагменты любого из указанных выше. В частности, антитела включают молекулы иммуноглобулинов и иммунологически активные части молекул иммуноглобулинов, т.е. антигенсвязывающие домены или молекулы, которые содержат антигенсвязывающий участок, который специфично связывается с антигеном LIGHT (например, одна или несколько определяющих комплементарность областей (CDR) анти-LIGHT-антитела) или антигеном CXCR5 (например, одна или несколько определяющих комплементарность областей (CDR) анти-CXCR5-антитела). Анти-LIGHT- или анти-CXCR5-антитела могут быть любого типа (например, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA и IgY), любого класса (например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 и IgA2) или любого подкласса (например, IgG2a и IgG2b) молекулы иммуноглобулина. В некоторых вариантах анти-LIGHT-антитела являются полностью человеческими, такими как полностью человеческие моноклональные анти- LIGHT-антитела. В некоторых вариантах анти-LIGHT-антитела представляют собой IgG-антитела, человеческие IgG4-антитела. Альтернативно в некоторых вариантах анти-CXCR5-антитела являются гуманизированными, такие как гуманизированные моноклональные анти-CXCR5-антитела. В некоторых вариантах анти-CXCR5-антитела представляют собой IgG-антитела, гуманизированные IgG4-антитела.

В используемом в настоящем описании смысле термин «анти-LIGHT-антитело» означает антитело или полученный из него полипептид (производное), который специфично связывается с LIGHT человека, который определен в настоящем описании, включая без ограничения молекулы, которые ингибируют или в значительной степени снижают связывание LIGHT с его лигандами или ингибируют активность LIGHT.

В используемом в настоящем описании смысле термин «анти-CXCR5-антитело» означает антитело или полученный из него полипептид (производное), который специфично связывается с CXCR5 человека, который определен в настоящем описании, включая без ограничения молекулы, которые ингибируют или в значительной степени снижают связывание CXCR5 с его лигандами или ингибируют активность CXCR5.

Термин «B-клеточная активность» означает более высокие уровни, чем уровни нормальных B-клеток, которые могут быть локальными, или доказательство биологического проявления или функции B-клетки, например экспрессии антител, присутствия или активности тирозинкиназы Братона, экспрессии или присутствия CD19, экспрессии или присутствия активирующего фактора B-клеток и так далее.

Термин «связывающее средство» означает любую молекулу, такую как антитело, ми-РНК, нуклеиновая кислота, аптамер, белок или низкомолекулярное органическое соединение, которая связывается или специфично связывается с LIGHT или CXCR5, или ее вариант или фрагмент.

Термин «побочный продукт» включает нежелательные продукты, которые снижают или уменьшают долю терапевтического/профилактического связывающего средства, такого как антитело, в данном препарате. Например, типичные побочные продукты включают агрегаты антитела, фрагменты антитела, например, получаемые при распаде антитела в результате дезамидирования или гидролиза, или их смеси. Обычно агрегаты представляют собой комплексы, которые имеют более высокую молекулярную массу, чем мономерное антитело. Продукты распада антитела могут включать, например, фрагменты антитела, например, возникающие в результате дезамидирования или гидролиза. Обычно продукты распада представляют собой комплексы, которые имеют более низкую молекулярную массу, чем мономерное антитело. В случае IgG-антитела такие продукты распада имеют молекулярную массу меньше чем примерно 150 кДа.

Подразумевается, что термины «композиция» и «препарат» охватывают продукт, содержащий указанные ингредиенты (например, анти-LIGHT-антитело или анти-CXCR5-антитело) необязательно в указанных количествах, а также любой продукт, который получают, прямо или опосредованно, в результате сочетания конкретных ингредиентов, необязательно в указанных количествах.

Термины «константная область» или «константный домен» относятся к находящейся на карбоксильном конце части легкой и тяжелой цепей, которая непосредственно не вовлечена в связывание антитела с антигеном, но проявляет различные эффекторные функции, такие как взаимодействие с рецептором Fc. Термины относятся к части молекулы иммуноглобулина, имеющей более консервативную аминокислотную последовательность по сравнению с другой частью иммуноглобулина, вариабельным доменом, который содержит антигенсвязывающий участок. Константный домен содержит домены CH1, CH2 и CH3 тяжелой цепи и домен CHL легкой цепи.

Термин «CXCR5» относится к встречающейся в природе известной молекуле, найденной на лимфоцитах, в частности, на B-клетках, и в частности, на наивных B-клетках; к такой молекуле, выделенной из таких клеток; к такой молекуле, получено рекомбинантно с использованием известных материалов и способов и с использованием нуклеиновой кислоты, кодирующей CXCR5; а также к частям CXCR5, таким как внеклеточный (EC) домен, который сохраняет характеристики и свойства, имеющие отношение к практическому осуществлению настоящего изобретения, такие как связывание CXCL13. Растворимая молекула CXCR5 может по существу состоять из EC-домена CXCR5, который содержит примерно шестьдесят первых аминокислот молекулы, то есть, амино-концевую часть CXCR5.

CXCR5 не является неразборчивым рецептором. CXCL13 является лигандом CXCR5 и экспрессируется конститутивно на стромальных клетках, таких как фолликулярные дендритные клетки, и в лимфоидных тканях. CXCL13 специфично привлекает B-клетки и небольшую подгруппу T-клеток, называемых хелперными фолликулярными T-клетками, TFH. Это не может быть неожиданным, учитывая множество взаимодействий между популяциями T-клеток и B-клеток в иммунной системе. Кроме того, активированные T-клетки индуцируют или осуществляют повышающую регуляцию экспрессии CXCR5. Было обнаружено, что инфильтрация лимфоцитов в третичные эктопические зародышевые центры (GC) хорошо коррелирует с возрастающей тяжестью заболевания и нарушением толерантности при некоторых расстройствах, в случае которых имеются такие атипичные подобные лимфатическим узлам структуры. В случае использования мышиных моделей in vivo, таких как мыши CXCR5-/- и CXCL13-/-, отсутствие либо рецептора, либо лиганда приводит к измененной тонкой структуре GC вследствие измененной локализации возможного взаимодействия T- и B-клеток. Такие мыши также защищены от развития тяжелого индуцированного коллагеном артрита (CIA). Так как CXCR5 избирательно экспрессируется на зрелых B-клетках, которые связаны с патогенезом RA, блокирование такого рецептора будет модулировать артритогенную реакцию у пораженных заболеванием людей. Показано, что лечение ревматоидного артрита биологическими средствами (т.е., анти-TNFa- и анти-CD20-антителами, ритуксимабом) является клинически эффективным; в частности, было показано, что у пациентов, получающих направленную на B-клетки терапию, наблюдается длительное улучшение клинических признаков и симптомов. Избирательное целенаправленное действие на CXCR5, который экспрессируется только на зрелых B-клетках и T-клетках, являющихся помощниками B-клеток, не будет влиять на развитие B-клеток или вызывать иммунную недостаточность у пациента. В отличие от ритуксимаба анти-CXCR5-антитело согласно настоящему изобретению является нейтрализующим антителом, которое не опосредует клеточную цитотоксичность.

«CXCR5-заболевание» представляет недомогание, расстройство, заболевание, состояние, аномалию и так далее, которое характеризуется или вызвано сверхэкспрессией или повышенными уровнями CXCL13 или другого лиганда CXCR5, повышенными уровнями B-клеток, повышенными уровнями B-клеточной активности, повышенными уровнями CXCR5 или нарушенным метаболизмом и активностью CXCR5.

Термин «эпитоп» относится к локализованной области на поверхности антигена, такого как полипептид LIGHT или CXCR5 или фрагмент полипептида LIGHT или CXCR5, которая может быть связана с одной или несколькими антигенсвязывающими областями связывающего средства, такого как антитело, и которая обладает антигенной или иммуногенной активностью у животного, такого как млекопитающее, такого как человек, которая способна вызывать иммунный ответ. Эпитоп, обладающий иммуногенной активностью, является частью полипептида, который вызывает гуморальный ответ у животного. Эпитоп, обладающий антигенной активностью, является частью полипептида, с которым специфично связывается антитело, и такую активность определяют любым способом, известным в данной области, например, таким как иммуноанализ. Антигенные эпитопы не должны быть обязательно иммуногенными. Эпитопы обычно состоят из химически активных поверхностных групп молекул, таких как аминокислоты или боковые группы сахаров, и имеют конкретные характеристики трехмерной структуры, а также конкретные характеристики заряда. Область полипептида, вносящая вклад в эпитоп, может представлять собой непрерывно следующие друг за другом аминокислоты полипептида, или эпитоп может быть образован двумя или несколькими непрерывно не следующими друг за другом областями полипептида. Эпитоп может являться или может не являться признаком трехмерной поверхности антигена. В некоторых вариантах эпитоп LIGHT или CXCR5 является признаком трехмерной поверхности полипептида LIGHT или CXCR5 (например, в тримерной форме полипептида LIGHT). В других вариантах эпитоп LIGHT является линейным признаком полипептида LIGHT или CXCR5 (например, в тримерной форме или мономерной форме полипептида LIGHT). Анти-LIGHT- или анти-CXCR5-антитела могут специфично связываться с эпитопом мономерной (денатурированной) формы LIGHT или CXCR5, эпитопом тримерной (нативной) формы LIGHT или CXCR5 или обеих мономерной (денатурированной) формы и тримерной (нативной) формы LIGHT или CXCR5. В конкретных вариантах анти-LIGHT-антитела специфично связываются с эпитопом тримерной формы LIGHT, но не связывают специфично мономерную форму LIGHT.

Термин «эксципиенты» относится к инертным веществам, которые обычно применяют в качестве разбавителя, наполнителя, консерванта, связывающего средства, стабилизатора и т.д. для лекарственных средств, и включает без ограничения белки (например, сывороточный альбумин, и т.д.), аминокислоты (например, аспарагиновую кислоту, глутаминовую кислоту, лизин, аргинин, глицин, гистидин и т.д.), жирные кислоты и фосфолипиды (например, алкилсульфонаты, каприлат и т.д.), поверхностно-активные вещества (например, SDS, полисорбат, неионогенное поверхностно-активное вещество и т.д.), сахариды (например, сахарозу, мальтозу, трегалозу и т.д.) и полиолы {например, маннит, сорбит и т.д.). Смотрите также публикацию Remington's Pharmaceutical Sciences (1990) Mack Publishing Co., Easton, Pa., которая включена в настоящее описание в виде ссылки в полном объеме.

В контексте пептида или полипептида термин «фрагмент» относится к пептиду или полипептиду, который содержит аминокислотную последовательность, меньшую, чем полноразмерная аминокислотная последовательность. Такой фрагмент может возникать, например, в результате укорочения амино-конца, укорочения карбоксильного конца и/или внутренней делеции остатка(ов) из аминокислотной последовательности. Фрагменты могут возникать, например, в результате альтернативного сплайсинга РНК или в результате активности протеаз in vivo. В некоторых вариантах фрагменты hLIGHT или hCXCR5 включают в себя полипептиды, содержащие аминокислотную последовательность, состоящую, по меньшей мере, из 5 непрерывно следующих друг за другом аминокислотных остатков, по меньшей мере, 10 непрерывно следующих друг за другом аминокислотных остатков, по меньшей мере, 15 непрерывно следующих друг за другом аминокислотных остатков, по меньшей мере, 20 непрерывно следующих друг за другом аминокислотных остатков, по меньшей мере, 25 непрерывно следующих друг за другом аминокислотных остатков, по меньшей мере, 40 непрерывно следующих друг за другом аминокислотных остатков, по меньшей мере, 50 непрерывно следующих друг за другом аминокислотных остатков, по меньшей мере, 60 непрерывно следующих друг за другом аминокислотных остатков, по меньшей мере, 70 непрерывно следующих друг за другом аминокислотных остатков, по меньшей мере, 80 непрерывно следующих друг за другом аминокислотных остатков, по меньшей мере, 90 непрерывно следующих друг за другом аминокислотных остатков, по меньшей мере, 100 непрерывно следующих друг за другом аминокислотных остатков, по меньшей мере, 125 непрерывно следующих друг за другом аминокислотных остатков, по меньшей мере, 150 непрерывно следующих друг за другом аминокислотных остатков, по меньшей мере, 175 непрерывно следующих друг за другом аминокислотных остатков, по меньшей мере, 200 непрерывно следующих друг за другом аминокислотных остатков или, по меньшей мере, 250 непрерывно следующих друг за другом аминокислотных остатков аминокислотной последовательности полипептида LIGHT или CXCR5 или антитела, которое специфично связывается с полипептидом LIGHT или CXCR5. В конкретном варианте фрагмент полипептида LIGHT или CXCR5 или антитела, которое специфично связывается с антигеном LIGHT или CXCR5, сохраняет, по меньшей мере 1, по меньшей мере 2 или по меньшей мере 3 функции полипептида или антитела.

Термины «полностью человеческое антитело» или «человеческое антитело» используют в настоящем описании взаимозаменяемо, и они относятся к антителу, которое содержит человеческую вариабельную область и вероятно человеческую константную область. В конкретных вариантах термины относятся к антителу, которое содержит вариабельную область и константную область человеческого происхождения. «Полностью человеческие» анти-LIGHT-антитела в некоторых вариантах также могут охватывать антитела, которые связывают полипептиды LIGHT и кодируются последовательностями нуклеиновой кислоты, которые являются встречающимися в природе соматическими вариантами последовательности нуклеиновой кислоты иммуноглобулина зародышевой линии человека. В конкретном варианте анти-LIGHT-антитела являются полностью человеческими антителами. Термин «полностью человеческое антитело» включает антитела, имеющие вариабельные и константные области, соответствующие последовательностям иммуноглобулина зародышевой линии человека, которые описаны Kabat с соавторами (смотрите Kabat с соавторами (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242). Способы получения полностью человеческих антител известны в данной области.

Фраза «рекомбинантное человеческое антитело» включает человеческие антитела, которые получены, экспрессированы, созданы или выделены основанными на рекомбинации способами, такие как антитела, экспрессированные с использованием рекомбинантного экспрессирующего вектора, введенного в результате трансфекции в клетку-хозяина, антитела, выделенные из библиотеки рекомбинантных комбинаторных человеческих антител, антитела, выделенные из организма животного (например, мыши или коровы), которое является трансгенным и/или трансхромосомным по генам иммуноглобулина человека (смотрите, например, Taylor, L. D. с соавторами (1992) Nucl. Acids Res. 20: 6287-6295), или антитела, полученные, экспрессированные, созданные или выделенные любыми другими способами, в которые вовлечен сплайсинг последовательностей генов иммуноглобулинов человека с другими последовательностями ДНК. Такие рекомбинантные человеческие антитела могут иметь вариабельные и константные области, полученные из последовательностей иммуноглобулинов зародышевой линии человека (смотрите Kabat, E. A. с соавторами (1991), Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242). Однако в некоторых вариантах такие рекомбинантные человеческие антитела подвергают мутагенезу in vitro (или, в том случае, когда используют животного, трансгенного по последовательностям Ig человека, соматическому мутагенезу in vivo), и поэтому аминокислотные последовательности областей VH и VL рекомбинантных антител представляет собой последовательности, которые, хотя и получены из последовательностей VH и VL зародышевой линии человека и являются родственными таким последовательностям, могут не существовать в природе в репертуаре человеческих антител зародышевой линии in vivo.

Оба термина, «связывающее IgG4-средство» или «связывающее средство, содержащее, по меньшей мере, часть Fc-области IgG4», относятся к связывающим средствам, описанным в настоящей публикации, которые содержат, по меньшей мере, фрагмент Fc IgG4. В некоторых вариантах фрагмент содержит 10, 20, 30, 40, 50, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210 или 220 аминокислот Fc-области IgG4. В других вариантах фрагмент содержит 10-50, 50-100, 100-150 или 150-200 аминокислот Fc-области IgG4. В других вариантах часть Fc-области IgG4 может иметь некоторую гомологию с Fc-областью IgG4. Например, связывающее IgG4-средство может включать в себя часть белка с гомологией по отношению к Fc-области IgG4, составляющей более чем 50, 60, 70, 80, 90, 93, 95, 96, 97, 98, 99 или 100%. Примеры Fc-областей IgG4 описаны на протяжении настоящего описания.

Термин «тяжелая цепь» при использовании в отношении антитела относится к пяти разным типам, называемым альфа (α), дельта (Δ), эпсилон (ε), гамма (γ) и мю (μ), основанным на аминокислотной последовательности константного домена тяжелой цепи. Указанные отличающиеся типы тяжелых цепей хорошо известны в данной области и обуславливают пять классов антител, IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, соответственно, включая четыре подкласса IgG, а именно IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4. В некоторых вариантах тяжелая цепь представляет собой тяжелую цепь человека.

«Гуманизированные» формы антител животных, отличных от человека (например, мыши), являются химерными иммуноглобулинами, цепями иммуноглобулинов или их фрагментами (такими как F_v, F_ab, F_ab’, F_(ab’)2 или другие связывающие мишень подпоследовательности антител), которые содержат последовательности, полученные из иммуноглобулина животного, отличного от человека, по сравнению с человеческим антителом. В общем, гуманизированное антитело будет содержат существенную часть одного и обычно двух вариабельных доменов, в которых все или большинство CDR-областей соответствуют CDR-областям иммуноглобулина животного, отличного от человека, и все или большинство FR-областей являются FR-областями матричной последовательности иммуноглобулина человека. Гуманизированное антитело также может содержать, по меньшей мере, часть константной области иммуноглобулина (F_c), обычно часть выбранной матрицы иммуноглобулина человека. В общем, целью является получение молекулы антитела, которая является минимально иммуногенной для человека. Таким образом, вероятно одна или несколько аминокислот в одной или нескольких CDR также могут быть заменены на аминокислоту, которая является менее иммуногенной для человека-хозяина, по существу без снижения функции специфичного связывания одной или нескольких CDR по отношению к CXCR5 или CXCL13. Альтернативно, FR могут быть FR животного, отличного от человека, но наиболее иммуногенные аминокислоты заменяют менее иммуногенными аминокислотами. Однако прививка CDR, которая осуждается выше, не является единственным способом получения гуманизированного антитела. Например, модификация только CDR-областей может быть недостаточной, так как нередко каркасные остатки играют роль в определении трехмерной структуры петель CDR и общей аффиности антитела по отношению к его лиганду. Следовательно, на практике можно осуществить любые способы, чтобы модифицировать исходную молекулу антитела животного, отличного от человека так, чтобы она была менее иммуногенной для человека, и глобальная идентичность последовательности с человеческим антителом не всегда является обязательной. Таким образом, гуманизацию также можно осуществлять, например, лишь заменой только нескольких остатков, в частности, остатков, которые экспонированы на молекуле антитела, а не погружены в молекуле и, следовательно, не являются легко доступными для иммунной системы хозяина. Такой способ описан в настоящей публикации в отношении замены «подвижных» или «гибких» остатков на молекуле антитела, при этом целью является снижение или ослабление иммуногенности полученной в результате молекулы, не затрагивая специфичности антитела по отношению к его эпитопу или детерминанте. Смотрите, например, Studnicka et al., Prot Eng 7(6)805-814, 1994; Mol Imm 44:1986-1988, 2007; Sims et al., J Immunol 151:2296 (1993); Chothia et al., J Mol Biol 196:901 (1987); Carter et al., Proc Natl Acad Sci USA 89:4285 (1992); Presta et al., J Immunol 151:2623 (1993), WO 2006/042333 и патент США № 5869619.

«Изолированное» или «очищенное» связывающее средство, такое как антитело, по существу не содержит клеточного материала или других примесных белков из клеточного или тканевого источника, из которого получено связывающее средство, или по существу не содержит химических предшественников или других химических веществ в случае химического синтеза. Например, выражение «по существу не содержит клеточного материала» включает препараты антитела, в которых антитело отделено от клеточных компонентов клеток, из которых оно выделено или рекомбинантно получено. Таким образом, антитело, которое по существу не содержит клеточного материала, включает препараты антитела, содержащие менее чем примерно 30%, 20%, 10% или 5% (в расчете на сухую массу) гетерологичного белка (также называемого в настоящем описании «загрязняющим белком»). Когда антитело получают основанным на рекомбинации способом, также желательно, чтобы оно по существу не содержало культуральной среды, т.е., чтобы культуральная среда составляла менее чем примерно 20%, 10% или 5% от объема препарат белка. Когда антитело получают в результате химического синтеза, в некоторых вариантах оно по существу не содержит химических предшественников или других химических веществ, т.е., оно отделено от химических предшественников или других химических веществ, которые вовлечены в синтез белка. Соответственно, такие препараты антитела содержат менее чем примерно 30%, 20%, 10%, 5% (в расчете на сухую массу) химических предшественников или соединений, отличных от представляющего интерес антитела. В некоторых вариантах анти-LIGHT- или анти-CXCR5-антитела являются выделенными или очищенными.

Термины «LIGHT человека», «hLIGHT» или «полипептид hLIGHT» и сходные термины относятся к полипептидам («полипептиды», «пептиды» и «белки» используют в настоящем описании взаимозаменяемо), содержащим аминокислотную последовательность SEQ ID NO:9, и родственным полипептидам, включая их SNP-варианты. В некоторых вариантах родственные полипептиды включают аллельные варианты (например, SNP-варианты); варианты сплайсинга; фрагменты; производные; варианты с заменой, делецией и инсерцией; слитые полипептиды; и межвидовые гомологи, которые сохраняют активность LIGHT и/или достаточны для того, чтобы вызвать иммунный анти-LIGHT-ответ. Также включены растворимые формы LIGHT, которые достаточны для того, чтобы вызвать иммунологический анти-LIGHT-ответ. Как будет понятно специалистам в данной области, связывающее анти-LIGHT-средство, такое как антитело, может связываться с полипептидом LIGHT, полипептидным фрагментом, антигеном и/или эпитопом, так как эпитоп является частью более крупного антигена, который является частью более крупного полипептидного фрагмента, который в свою очередь является частью более крупного полипептида. hLIGHT может существовать в тримерной (нативной) или мономерной (денатурированной) форме.

Термины «CXCR5 человека», «hCXCR5» или «полипептид hCXCR5» и сходные термины относятся к полипептидам («полипептиды», «пептиды» и «белки» используют в настоящем описании взаимозаменяемо), содержащим аминокислотную последовательность SEQ ID NO:14, и родственным полипептидам, включая их SNP-варианты. В некоторых вариантах родственные полипептиды включают аллельные варианты (например, SNP-варианты); варианты сплайсинга; фрагменты; производные; варианты с заменой, делецией и инсерцией; слитые полипептиды; и межвидовые гомологи, которые сохраняют активность CXCR5 и/или достаточны для того, чтобы вызвать иммунный анти- CXCR5-ответ. Также включены растворимые формы CXCR5, которые достаточны для того, чтобы вызвать иммунологический анти-CXCR5-ответ. Как будет понятно специалистам в данной области, связывающее анти-CXCR5-средство, такое как антитело, может связываться с полипептидом CXCR5, полипептидным фрагментом, антигеном и/или эпитопом, так как эпитоп является частью более крупного антигена, который является частью более крупного полипептидного фрагмента, который в свою очередь является частью более крупного полипептида.

Термин «нумерация согласно Кабату» и подобные термины известны в данной области и относятся к системе нумерации аминокислотных остатков, которые являются более вариабельными (т.е., гипервариабельными), чем другие аминокислотные остатки в вариабельной области тяжелой и легкой цепей антитела или его антигенсвязывающей части (Kabat et al. (1971) Ann. NY Acad. Sci. 190:382-391 and, Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242).

В случае вариабельной области тяжелой цепи гипервариабельная область обычно находится в диапазоне от 31 до 35 положения аминокислот для CDR1, от 50 до 65 положения аминокислот для CDR2 и от 95 до 102 положения аминокислот для CDR3. В случае вариабельной области легкой цепи гипервариабельная область обычно находится в диапазоне от 24 до 34 положения аминокислот для CDR1, от 50 до 56 положения аминокислот для CDR2 и от 89 до 97 положения аминокислот для CDR3.

Термин «легкая цепь» при использовании в отношении антитела относится к двум разным типам, называемым каппа (κ) или лямбда (λ), на основании аминокислотной последовательности константных доменов. Аминокислотные последовательности легкой цепи хорошо известны в данной области. В некоторых вариантах легкая цепь представляет собой легкую цепь человека.

Термины «контролировать», «осуществлять контроль» и «контроль» относятся к полезному эффекту, который получает субъект в результате терапии (например, профилактическим или терапевтическим средством), который не приводит к излечению инфекции. В некоторых вариантах субъекту вводят одно или несколько терапевтических средств (например, профилактических или терапевтических средств, таких как препарат согласно изобретению), чтобы «контролировать» заболевание, опосредованное LIGHT (например, хроническое заболевание кишечника, IBD, болезнь Крона, язвенный колит или GVHD) или CXCR5-опсоредованное заболевание (например, ревматоидный артрит), один или несколько их симптомов, для того, чтобы предотвратить прогрессирование или ухудшение состояния при заболевании.

Термин «моноклональное антитело» относится к антителу, полученному из популяции гомогенных или по существу гомогенных антител, и каждое моноклональное антитело обычно будет узнавать один эпитоп антигена. В некоторых вариантах «моноклональное антитело» представляет собой антитело, продуцируемое одной гибридомой или другой клеткой. Термин «моноклональное» не ограничен каким-либо конкретным способом получения антитела. Например, моноклональные антитела могут быть получены способом, основанным на гибридомах, который описан в Kohler с соавторами (Nature, 256: 495 (1975)), или могут быть выделены из фаговых библиотек. Другие способы получения клональных клеточных линий и экспрессируемых ими моноклональных антител хорошо известны в данной области (смотрите, например, главу 11 в: Short Protocols in Molecular Biology, (2002) 5^th Ed., Ausubel et al., eds., John Wiley and Sons, New York).

Термин «фармацевтически приемлемый означает одобренный контролирующим органом федерального правительства или правительства штата или указанный в списке в фармакопее США, Европейской фармакопее или других общеизвестных фармакопеях для применения на животных и более конкретно на человека.

Под «фармацевтически приемлемым эксципиентом» подразумевают любое инертное вещество, которое объединяют с активной молекулой, такой как моноклональное антитело, для получения отвечающей требованиям или удобной дозированной формы. «Фармацевтически приемлемый эксципиент» представляет собой эксципиент, который является нетоксичным для реципиентов в используемых дозах и концентрациях и совместим с другими ингредиентами препарата, содержащего моноклональное антитело.

Термины «предотвращать», «предотвращение» и «профилактика» относятся к полному или частичному ингибированию развития, рецидива, появления или распространения LIGHT-опосредованного или CXCR5-опосредованного заболевания и/или связанного с ним симптома, которое является результатом введения терапевтического средства или сочетания терапевтических средств, предлагаемых в настоящем изобретении (например, сочетания профилактических или терапевтических средств, таких как препарат согласно изобретению).

Термин «профилактическое средство» относится к любому средству, которое может полностью или частично ингибировать развитие, рецидив, появление или распространение LIGHT-опосредованного или CXCR5-опосредованного заболевания и/или связанного с ним симптома у субъекта. В некоторых вариантах термин «профилактическое средство» относится к препарату согласно изобретению. В некоторых других вариантах термин «профилактическое средство» относится к другому средству, отличному от препарата согласно изобретению. В некоторых вариантах профилактическим средством является средство, которые, как известно, является применимым или применялось или применяется в настоящее время для профилактики LIGHT-опосредованного или CXCR5-опосредованного заболевания и/или связанного с ним симптома или препятствует появлению, развитию, прогрессированию и/или снижает тяжесть LIGHT-опосредованного или CXCR5-опосредованного заболевания и/или связанного с ним симптома. В конкретных вариантах профилактическим средством является полностью человеческое анти-LIGHT-антитело, такое как полностью человеческое моноклональное анти-LIGHT-антитело или гуманизированное анти-CXCR5-антитело, такое как гуманизированное моноклональное анти-CXCR5-антитело.

Термин «антиген LIGHT» относится к такой части полипептида LIGHT, с которой специфично связывается связывающее средство, такое как антитело. Антиген LIGHT также относится к аналогу или производному полипептида LIGHT или его фрагмента, с которые специфично связывается связывающее средство, такое как антитело. В некоторых вариантах антиген LIGHT является мономерным антигеном LIGHT или тримерным антигеном LIGHT. Область полипептида LIGHT, вносящего вклад в эпитоп, может представлять собой область, образованную соседними аминокислотами полипептида, или эпитоп может быть образован двумя или более областями полипептида, которые не являются соседними областями в полипептиде. Эпитоп может являться или может не являться трехмерным поверхностным признаком антигена. Локализованная область на поверхности антигена LIGHT, которая способна вызывать иммунный ответ, представляет собой эпитоп LIGHT. Эпитоп может являться трехмерным поверхностным признаком антигена или не являться таковым.

Термин «антиген CXCR5» относится к такой части полипептида CXCR5, с которой специфично связывается связывающее средство, такое как антитело. Антиген CXCR5 также относится к аналогу или производному полипептида CXCR5 или его фрагмента, с которые специфично связывается связывающее средство, такое как антитело. Область полипептида CXCR5, вносящего вклад в эпитоп, может представлять собой область, образованную соседними аминокислотами полипептида, или эпитоп может быть образован двумя или более областями полипептида, которые не являются соседними областями в полипептиде. Эпитоп может являться или может не являться трехмерным поверхностным признаком антигена. Локализованная область на поверхности антигена CXCR5, которая способна вызывать иммунный ответ, представляет собой эпитоп CXCR5. Эпитоп может являться трехмерным поверхностным признаком антигена или не являться таковым.

Термины «заболевание, опосредованное LIGHT» и «расстройство, опосредованное hLIGHT» используют взаимозаменяемо, и они относятся к любому заболеванию, которое полностью или частично вызвано или является результатом влияния LIGHT. В некоторых вариантах LIGHT аномально (например, в высокой степени) экспрессируется на поверхности клетки. В некоторых вариантах LIGHT может подвергаться аномальной повышающей регуляции в конкретном типе клеток. В других вариантах нормальная, аномальная или избыточная передача сигналов в клетке вызвана связыванием LIGHT с лигандом LIGHT. В некоторых вариантах лигандом LIGHT является рецептор LIGHT (например, HVEM, LTβR или DCR3), например, рецептор, который экспрессируется на поверхности клетки, такой как эпителиальная клетка ободочной кишки. В некоторых вариантах заболеванием, опосредованным LIGHT, является хроническое заболевание кишечника, воспалительное заболевание кишечника (IBD), такое как болезнь Крона (CD) или язвенный колит (UC). В других вариантах заболеванием, опосредованным LIGHT, является болезнь «трансплантат против хозяина» (GVHD).

Термины «заболевание, опосредованное CXCR5» и «расстройство, опосредованное CXCR5» используют взаимозаменяемо, и они относятся к любому заболеванию, которое полностью или частично вызвано или является результатом влияния CXCR5. В некоторых вариантах CXCR5 аномально (например, в высокой степени) экспрессируется на поверхности клетки. В некоторых вариантах CXCR5 может подвергаться аномальной повышающей регуляции в конкретном типе клеток. В других вариантах нормальная, аномальная или избыточная передача сигналов в клетке вызвана связыванием CXCR5 с лигандом CXCR5. В некоторых вариантах лигандом CXCR5 является CXCL13. В некоторых вариантах заболеванием, опосредованным CXCR5, является ревматоидный артрит (RA).

Термин «сахарид» относится к классу молекул, которые являются производными многоатомных спиртов. Сахариды обычно называют углеводами, и они могут содержать разные количества единиц сахара (сахарида), например, моносахариды, дисахариды и полисахариды.

Термины «специфично связывается» или «специфичное связывание» означают специфичное связывание с антигеном или его фрагментом и неспецифичное связывание с другими антигенами. Например, антитело, которое специфично связывается с антигеном, может связываться с другими пептидами или полипептидами с более низкой аффинностью, которую определяют, например, используя радиоиммуноанализы (РИА), твердофазные иммуноферментные анализы (ELISA), BIACORE или другие анализы, известные в данной области. Антитела или их варианты или фрагменты, которые специфично связываются с антигеном, могут быть перекрестно реактивными по отношению к родственным антигенам. В некоторых вариантах антитела или их варианты или фрагменты, которые специфично связываются с антигеном, перекрестно не взаимодействуют с другими антигенами. Антитело или его вариант илиа фрагмент, который специфично связывается с антигеном LIGHT или CXCR5, может быть идентифицирован, например, с использованием иммуноанализов, BIAcore или других способов, известных специалистам в данной области. Обычно специфичное или избирательное взаимодействие будет давать сигнал, превышающий фоновый сигнал или шум, по меньшей мере, в два раза и более обычно превышающий фон более чем в 10 раз. Обсуждение, имеющее отношение к специфичности антител, смотрите, например, в Paul, ed., 1989, Fundamental Immunology Second Edition, Raven Press, New York, 332-336.

«Стабильный» или «стабилизированный» препарат представляет собой препарат, в котором связывающее средство, такое как антител согласно настоящему изобретению, по существу сохраняет свою физическую стабильность, идентичность, целостность и/или химическую стабильность, идентичность, целостность, и/или биологическую активность при хранении. Различные аналитические способы измерения стабильности белка доступны в данной области, и обзор приведен, например, в публикации Peptide and Protein Drug Delivery, 247-301, Vincent Lee Ed., Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., Pubs. (1991), и в публикации Jones, A. Adv. Drug Delivery Rev. 10: 29-90 (1993). Стабильность может быть измерена при выбранной температуре и других условиях хранения в течение выбранного периода времени. Стабильность можно определить, по меньшей мере, одним из способов, выбранным из группы, состоящей из визуального осмотра, SDS-ПААГ, IEF, HPSEC, RFFIT и ELISA каппа/лямбда. Например, антитело «сохраняет свою физическую стабильность» в фармацевтическом препарате, если в нем не наблюдают признаков агрегации, преципитации и/или денатурации при визуальном осмотре окраски и/или прозрачности или в случае измерения УФ-светорассеяния, в SDS-ПААГ или с использованием эксклюзионной хроматографии по размеру (высокого давления) (HPSEC). В некоторых вариантах в случае применения препаратов согласно изобретению 5% или меньше, обычно 4% или меньше, обычно 3% или меньше, более обычно 2% или меньше и, в частности, 1% или меньше антител образуют агрегаты, судя по измерения с использованием HPSEC или любого другого подходящего способа измерения образования агрегатов. Например, антитело считают стабильным в конкретном препарате, если мономер антитела имеет чистоту примерно 90%, обычно примерно 95%, в частности, примерно 98% после некоторого предварительно определяемого периода времени в определенных условиях хранения в конкретном препарата. Химическую стабильность можно оценить, выявляя и количественно определяя химически измененные формы белка. Химическое изменение может включать в себя модификацию по размеру (например, урезание), которую можно оценить, используя, например, (HP)SEC, SDS-ПААГ и/или времяпролетную масс-спектрометрию с матрично-активируемой лазерной десорбцией/ионизацией (MALDI/TOF MS). Другие типы химического изменения включают изменение заряда (например, возникающее в результате дезамидирования), которое можно оценить, например, ионообменной хроматографией. Антитело «сохраняет свою биологическую активность» в фармацевтическом препарате в данный момент времени, если биологическая активность антитела в данный момент времени составляет, по меньшей мере, примерно 90% (в пределах ошибок анализа) от биологической активности, наблюдаемой в момент получения фармацевтического препарата, которую определяют, например, в анализе связывания антигена или в анализе нейтрализации вируса.

Термины «субъект» и «пациент» используют взаимозаменяемо. В используемом в настоящем описании смысле субъектом обычно является млекопитающее, такое как млекопитающее, не относящееся к приматам (например, коровы, свиньи, лошади, кошки, собаки, крысы и т.д.), или примат (например, обезьяна и человека) и в некоторых вариантах человек. В одном варианте субъектом является млекопитающее, такое как человек, имеющий опосредованное LIGHT или опосредованное CXCR5 заболевание. В другом варианте субъектом является млекопитающее, такое как человек, для которого существует риск развития опосредованного LIGHT или опосредованного CXCR5 заболевания.

Термин «терапевтически эффективное количество» относится к количеству терапевтического средства (например, препарата согласно изобретению), которое достаточно для снижения и/или ослабления тяжести и/или продолжительности данного заболевания и/или родственного ему симптома. Такой термин также охватывает количество, необходимое для уменьшения или ослабления развития или прогрессирования данного заболевания, уменьшения или ослабления рецидива, развития или возникновения данного заболевания, и/или для улучшения или усиления профилактического или терапевтического эффекта(-ов) другого терапевтического средства (например, терапевтического средства, отличного от препарата согласно изобретению). В некоторых вариантах терапевтически эффективное количество антитела согласно изобретению составляет от примерно 0,1 мг/кг (мг антитела на кг массы субъекта) до примерно 100 мг/кг. В некоторых вариантах терапевтически эффективное количество антитела, предлагаемого в настоящем изобретении, составляет примерно 0,1 мг/кг, примерно 0,5 мг/кг, примерно 1 мг/кг, 3 мг/кг, 5 мг/кг, примерно 10 мг/кг, примерно 15 мг/кг, примерно 20 мг/кг, примерно 25 мг/кг, примерно 30 мг/кг, примерно 35 мг/кг, примерно 40 мг/кг, примерно 45 мг/кг, примерно 50 мг/кг, примерно 60 мг/кг, примерно 70 мг/кг, примерно 80 мг/кг примерно 90 мг/кг или примерно 100 мг/кг (или количество в диапазоне между указанными значениями). В некоторых вариантах «терапевтически эффективное количество» в используемом в настоящем описании смысле также относится к количеству антитела согласно изобретению, необходимому для достижения конкретного результата (например, ингибирования биологической активности LIGHT в клетке, такого как ингибирование секреции CCL20, IL-8 или RANTES из клетки; или ингибирования биологической активности CXCR5 в клетке, такой как связывание с CXCL13).

Термин «терапевтическое средство» относится к любому средству, которое можно использовать для лечения, оказания помощи или ослабления LIGHT-опосредованного или CXCR5-опосредованного заболевания и/или связанного с ним симптома. В некоторых вариантах термин «терапевтическое средство» относится к препарату согласно изобретению. В некоторых других вариантах термин «терапевтическое средство» относится к другому средству, отличному от препарата согласно изобретению. Предпочтительно терапевтическим средством является средство, которое, как известно, полезно или было использовано или используется в настоящее время для лечения, оказания помощи или ослабления LIGHT-опосредованного или CXCR5-опосредованного заболевания или одного или нескольких связанных с ним симптомов.

Термин «терапия» относится к любому протоколу, способу и/или средству, которые можно использовать для профилактики, контролирования, лечения и/или ослабления заболевания, опосредованного LIGHT (например, IBD или GVHD), или заболевания, опосредованного CXCR5 (например, ревматоидного артрита). В некоторых вариантах термины «средства терапии» и «терапия» относятся к биологической терапии, поддерживающей терапии и/или другим способам терапии, применимым для профилактики, контролирования, лечения и/или ослабления заболевания, опосредованного LIGHT, или заболевания, опосредованного CXCR5, известным специалисту в данной области, например медицинскому персоналу.

Термины «лечить», «лечение» и «процесс лечения» относятся к уменьшению или ослаблению прогрессирования, тяжести и/или продолжительности опосредованного LIGHT заболевания (например, хронического заболевания кишечника, IBD или GVHD) или опосредованного CXCR5 заболевания (например, ревматоидного артрита) в результате введения одного или нескольких средств лечения (включая без ограничения введение одного или нескольких терапевтических средств (включая без ограничения введение одного или нескольких профилактических или терапевтических средств, таких как препарат согласно изобретению). В конкретных вариантах в случае LIGHT такие термины относятся к уменьшению или ингибированию связывания LIGHT с HVEM, уменьшению или ингибированию связывания LIGHT с LTβR, уменьшению или ингибированию связывания LIGHT с DcR3, уменьшению или ингибированию продукции или секреции CCL20 из клетки субъекта, экспрессирующей рецептор LIGHT, уменьшению или ингибированию продукции или секреции IL-8 из клетки субъекта, экспрессирующей рецептор LIGHT, уменьшению или ингибированию продукции или секреции RANTES из клетки субъекта, экспрессирующей рецептор LIGHT, и/или ингибированию или уменьшению одного или нескольких симптомов, связанных с заболеванием, опосредованным LIGHT, таким как хроническое заболевание кишечника, IBD или GVHD. В конкретных вариантах в случае CXCR5 такие термины относятся к уменьшению или ингибированию связывания CXCR5 с CXCL13 и/или ингибированию или уменьшению одного или нескольких симптомов, ассоциированных с опосредованным CXCR5 заболеванием, таким как ревматоидный артрит.

Термин «вариабельная область» или «вариабельный домен» относится к части легких и тяжелых цепей, обычно примерно к 120-130 аминоконцевым аминокислотам в тяжелой цепи и примерно 100-110 аминокислотам в легкой цепи, которые сильно отличаются по последовательности в разных антителах и используются в связывании и обеспечении специфичности каждого конкретного антитела по отношению к его конкретному антигену. Вариабельность последовательностей сконцентрирована в областях, называемых областями, определяющими комплементарность (CDR), тогда как более консервативные области в вариабельном домене называют каркасными областями (FR). CDR легких и тяжелых цепей главным образом ответственны за взаимодействие антитела с антигеном. Нумерация положений аминокислот, используемая в настоящем описании, соответствует EU Index, как описано в публикации Kabat с соавторами (1991) Sequences of proteins of immunological interest (U.S. Department of Health and Human Services, Washington, D. C.) 5^th ed. («Kabat с соавторами»). В предпочтительных вариантах вариабельная область является вариабельной областью человека.

B. Препараты и компоненты препаратов

Как указано ранее, неожиданно были открыты препараты согласно изобретению в форме жидкостей и лиофилизированных порошков, которые содержат связывающее IgG4-средство и цитратный буфер, при этом pH препарата находится на уровне или ниже как значения pH около 6, так и значения изоэлектрической точки (pI) связывающего средства. Препараты согласно изобретению в значительной степени улучшены по сравнению с обычными препаратами связывающего IgG4-средства (например, препаратами на основе фосфатно-солевого буфера (PBS)), которые образуют нежелательные побочные продукты при увеличении концентрации связывающего средства в препарате. В частности, препараты согласно изобретению имеют уменьшенное количество агрегатов, полумолекул, продуктов распада, низкомолекулярных белков (LMWP), высокомолекулярных белков (HMWP) и перераспределение кислых, основных и нейтральных изоформ связывающего средства в препаратах.

i. Связывающие анти-LIGHT-средства и их варианты и фрагменты

В некоторых вариантах препараты согласно изобретению включают в себя связывающее анти-LIGHT-средство. Связывающие средства могут представлять собой любую молекулу, такую как антитело, миРНК, нуклеиновая кислота, аптамер, белок или низкомолекулярное органическое соединение, которое связывается или специфично связывается с LIGHT, или их вариант или фрагмент. В некоторых вариантах связывающее средство представляет собой анти-LIGHT-антитело или его вариант или его антигенсвязывающий фрагмент. Анти-LIGHT-антитела специфично связываются с белком LIGHT (лимфотоксин-подобный, проявляет индуцируемую экспрессию и конкурирует с гликопротеидом D HSV за HVEM, рецептор, экспрессируемый T-лимфоцитами), полипептидным фрагментом или эпитопом. Молекула LIGHT может быть получена из любого вида. В некоторых вариантах молекула LIGHT получена от человека, и в данном случае известна как «hLIGHT». hLIGHT имеет следующую аминокислотную последовательность, которая указана в виде SEQ ID NO:9:

1 MEESVVRPSV FVVDGQTDIP FTRLGRSHRR QSCSVARVGL GLLLLLMGAG 51 LAVQGWFLLQ LHWRLGEMVT RLPDGPAGSW EQLTQERRSH EVNPAAHLTG 101 ANSSLTGSGG PLLWETQLGL AFLRGLSYHD GALVVTKAGY YYIYSKVQLG 150 GVGCPLGLAS TITHGLYKRT PRYPEELELL VSQQSPCGRA TSSSRVWWDS 200 SFLGGVVHLE AGEEVVVRVL DERLVRLRDG TRSYFGAFMV (SEQ ID NO: 9).

В некоторых иллюстративных вариантах анти-LIGHT-антитело является гуманизированным антителом, полностью человеческим антителом или его вариантом или его антигенсвязывающим фрагментом. В некоторых вариантах анти-LIGHT-антитела предотвращают связывание LIGHT с его рецепторами и ингибируют биологическую активность LIGHT (например, LIGHT-опосредованную продукцию или секрецию CCL20, IL-8 или RANTES из клеток, экспрессирующих лиганд LIGHT, такой как рецептор LIGHT рецептор (например, HVEM, LTpR и/или DcR3).

В некоторых конкретных вариантах анти-LIGHT-антитело содержит вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую аминокислотную последовательность любой одной или нескольких из следующих определяющих комплементарность областей (CDR):

HCDR1 - GYNWH (SEQ ID NO:1);

HCDR2 - EITHSGSTNYNPSLKS (SEQ ID NO:2); или

HCDR3 - EIAVAGTGYYGMDV (SEQ ID NO:3).

В других конкретных вариантах анти-LIGHT-антитело содержит вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую аминокислотную последовательность любой одной или нескольких из следующих определяющих комплементарность областей (CDR):

LCDR1 - RASQGINSAFA (SEQ ID NO:4);

LCDR2 - DASSLES (SEQ ID NO:5); или

LCDR3 - QQFNSYPLT (SEQ ID NO:6).

В одном конкретном варианте анти-LIGHT-антитело содержит вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую аминокислотные последовательности SEQ ID NO:1, 2 и 3.

В другом конкретном варианте анти-LIGHT-антитело содержит вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую аминокислотные последовательности SEQ ID NO:4, 5 и 6.

В более конкретных вариантах анти-LIGHT-антитело содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотные последовательности SEQ ID NO:1, 2 и 3; и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотные последовательности SEQ ID NO:4, 5 и 6.

В конкретных вариантах анти-LIGHT-антитело содержит тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:7:

Положения 1-122: вариабельная область тяжелой цепи (VH). CDR (определяющие комплементарность области согласно определению Кабата) подчеркнуты.

Положения 123-448: константная область IgG4 человека (SwissProt IGHG4_HUMAN с двумя мутациями S241P и L248E, согласно нумерации по Кабату).

В других конкретных вариантах анти-LIGHT-антитело содержит легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:8:

Положения 1-107: вариабельная область легкой цепи (VL). CDR (определяющие комплементарность области согласно определению Кабата) подчеркнуты.

Положения 108-214: константная область Cκ человека.

В следующих вариантах анти-LIGHT-антитело содержит тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:7, и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:8.

В некоторых вариантах анти-LIGHT-антитело содержит тяжелую цепь, полученную из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:10, которая может кодироваться последовательностью нуклеиновой кислоты SEQ ID NO:11.

Аминокислоты 1-19: сигнальный пептид.

Аминокислоты 20-141: вариабельная область (VH) 124F19k2.

Аминокислоты 142-конец: константная область hIgG4 PE.

Нуклеиновые кислоты 1-57: нуклеиновые кислоты, кодирующие сигнальный пептид.

Нуклеиновые кислоты 58-423: нуклеиновые кислоты, кодирующие вариабельную область (VH) 124F19k2.

Нуклеиновые кислоты 424-конец: нуклеиновые кислоты, кодирующие константную область hIgG4 PE.

В альтернативных конкретных вариантах анти-LIGHT-антитело содержит легкую цепь, полученную из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12, которая может кодироваться последовательностью нуклеиновой кислоты SEQ ID NO:13.

Аминокислоты 1-22: сигнальный пептид.

Аминокислоты 23-129: вариабельная область (VL) 124F19k2/

Аминокислоты 130-конец: константная область hKappa.

Нуклеиновые кислоты 1-66: нуклеиновые кислоты, кодирующие сигнальный пептид.

Нуклеиновые кислоты 67-387: нуклеиновые кислоты, кодирующие вариабельную область (VL) 124F19k2.

Нуклеиновые кислоты 388-конец: нуклеиновые кислоты, кодирующие константную область hKappa.

В одном варианте осуществления изобретения анти-LIGHT-антитело является полностью человеческим антителом. Примеры изотипов полностью человеческих антител включают IgA, IgD, IgE, IgG и IgM. В некоторых вариантах анти-LIGHT-антитело является IgG-антителом. Существуют четыре формы IgG. В некоторых вариантах анти-LIGHT-антитело является IgG4-антителом. В некоторых вариантах осуществления изобретения анти-LIGHT-антитело является полностью человеческим IgG4-антителом.

В некоторых вариантах анти-LIGHT-антитело, кроме того, содержит константную область, например, константную область IgG человека. В некоторых вариантах константная область представляет собой константную область IgG4 человека. В дополнительных вариантах константная область представляет собой модифицированную константную область IgG4 человека. В других вариантах константная область представляет собой константную область Cκ человека.

В некоторых вариантах осуществления изобретения анти-LIGHT-антитело является полностью человеческим IgG4-анти-LIGHT-антителом, содержащим тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:7, и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:8 («лидирующее LIGHT-антитело»). В альтернативных вариантах осуществления изобретения анти-LIGHT-антитело является полностью человеческим IgG4-анти-LIGHT-антителом, содержащим вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, при этом вариабельная область тяжелой цепи содержит 3 определяющих комплементарность области (CDR), содержащих аминокислотные последовательности SEQ ID NO:1, 2 и 3, и вариабельная область легкой цепи содержит 3 CDR, содержащих аминокислотные последовательности SEQ ID NO:4, 5 и 6. Идентификация, выделение, приготовление и характеристика анти-LIGHT-антител, включая анти-LIGHT-антитело, содержащее аминокислотную последовательность тяжелой цепи, содержащую последовательность SEQ ID NO:7, и аминокислотную последовательность легкой цепи, содержащую последовательность SEQ ID NO:8, были подробно описаны в патенте США № 8058402, соответствующем публикации PCT WO 2008/027338, которые включены в настоящее описание в виде ссылки.

Некоторые варианты препаратов согласно изобретению также включают в себя варианты связывающих анти-LIGHT-средств, таких как антитела. В частности, препараты согласно изобретению могут содержать варианты анти-LIGHT-антитела, которое является полностью человеческим IgG4-анти-LIGHT-антителом, содержащим тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:7, и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:8. Варианты анти-LIGHT-антитела могут иметь сходные физико-химические свойства на основании их высокого сходства, и поэтому также включены в объем изобретения. Варианты определяют как антитела с аминокислотной последовательностью, которая, по меньшей мере, на 95%, по меньшей мере, на 97%, например, по меньшей мере, на 98% или 99% гомологичны анти-LIGHT-антителу и способны конкурировать за связывание с полипептидом LIGHT, фрагментом полипептида LIGHT или эпитопом LIGHT. В некоторых вариантах осуществления изобретения варианты будут ослаблять, нейтрализовать или иным образом ингибировать биологическую активность LIGHT (например, LIGHT-опосредованную продукцию или секрецию CCL20, IL-8 или RANTES из клеток, экспрессирующих лиганд LIGHT, такой как рецептор LIGHT (например, HVEM, LTpR и/или DcR3). Определение конкуренции за связывание с мишенью можно осуществить обычными способами, известными специалисту в данной области. В некоторых вариантах осуществления изобретения варианты представляют собой человеческие антитела, и в некоторых вариантах являются молекулами IgG4. В некоторых вариантах осуществления изобретения вариант, по меньшей мере, на 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичен по аминокислотной последовательности лидирующему антителу. Термин «вариант» относится к антителу, которое содержит аминокислотную последовательность, которая изменена на одну или несколько аминокислот по сравнению с аминокислотными последовательностями анти-LIGHT-антитела. Вариант может иметь консервативные модификации последовательности, включая аминокислотные замены, модификации, добавления и делеции.

Примеры модификаций включают без ограничения гликозилирование, ацетилирование, пегилирование, фосфорилирование, амидирование, дериватизацию известными защитными/блокирующими группами, протеолитическое расщепление и связывание с клеточным лигандом или другим белком. Модификации аминокислот можно вводить стандартными способами, известными в данной области, такими как сайт-специфичный мутагенез, молекулярное клонирование, сайт-специфичный мутагенез с использованием олигонуклеотидов и случайный опосредованный ПЦР мутагенез, в нуклеиновую кислоту, кодирующую антитела. Консервативные аминокислотные замены включают замены, при которых аминокислотный остаток заменяют аминокислотным остатком, имеющим сходные структурные или химические свойства. Семейства аминокислотных остатков, имеющих сходные боковые цепи, были определены в данной области. Такие семейства включают аминокислоты с основными боковыми цепями (например, лизин, аргинин, гистидин), кислыми боковыми цепями (например, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота), незаряженными полярными боковыми цепями (например, аспарагин, глутамин, серин, треонин, тирозин, цистеин, триптофан), неполярными боковыми цепями (например, глицин, аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин), бета-разветвленными боковыми цепями (например, треонин, валин, изолейцин) и ароматическими боковыми цепями (например, тирозин, фенилаланин, триптофан). Специалисту в данной области будет понятно, что также можно использовать другие классификации семейств аминокислотных остатков, отличные от классификации, приведенной выше. Кроме того, вариант может иметь неконсервативные аминокислотные замены, например, замену аминокислоты аминокислотным остатком, обладающим другими структурными или химическими свойствами. Сходные небольшие изменения также могут включать делеции или инсерции аминокислот или и то и другое. Руководство по определению того, какие аминокислотные остатки могут быть заменены, модифицированы, встроены или делетированы без снижения иммунологической активности, можно найти, используя компьютерные программы, хорошо известные в данной области. Можно использовать компьютерные алгоритмы, наряду с другими такие как Gap или Bestfit, которые известны специалисту в данной области, чтобы оптимально выравнивать сравниваемые аминокислотные последовательности и определять сходные или идентичные аминокислотные остатки. Варианты могут иметь такие же или другие, либо более высокие, либо более низкие, аффинности связывания по сравнению с анти-LIGHT-антителом, но при этом все еще оставаться способными специфично связываться с LIGHT, и могут иметь такую же, более высокую или более низкую биологическую активность по сравнению с активностью анти-LIGHT-антитела.

Варианты осуществления изобретения также включают антигенсвязывающие фрагменты связывающих анти-LIGHT-средств, таких как антитела. Термин «антигенсвязывающий домен», «антигенсвязывающая область», «антигенсвязывающий фрагмент» и подобные термины относятся к такой части антитела, которая содержит аминокислотные остатки, которые взаимодействуют с антигеном и придают связывающему средству специфичность и аффинность по отношению к антигену (например, области, определяющие комплементарность (CDR)). Антигенсвязывающая область может быть получена от любого вида животного, такого как грызуны (например, кролик, крыса или хомячок), и человека. В некоторых вариантах антигенсвязывающая область может иметь человеческое происхождение. Не ограничивающие примеры антигенсвязывающих фрагментов включают: Fab-фрагменты, F(ab’)₂-фрагменты, Fd-фрагменты, Fv-фрагменты, одноцепочечные молекулы Fv (scFv), dAb-фрагменты и минимальные единицы узнавания, состоящие из аминокислотных остатков, которые имитируют гипервариабельную область антитела.

В некоторых вариантах осуществления изобретения связывающие анти-LIGHT-средства (или их вариант или их антигенсвязывающий фрагмент) будут ослаблять, нейтрализовать или иным образом ингибировать биологическую активность LIGHT in vivo (например, LIGHT-опосредованную продукцию или секрецию CCL20, IL-8 или RANTES из клетки, экспрессирующей рецептор LIGHT, например, HVEM, LTpR и/или DcR3).

В некоторых вариантах осуществления изобретения связывающие анти-LIGHT-средства (или их вариант или их антигенсвязывающий фрагмент) являются антагонистическими связывающими средствами, которые ослабляют, нейтрализуют или иным образом ингибируют биологическую активность LIGHT in vivo (например, LIGHT-опосредованную продукцию или секрецию CCL20, IL-8 или RANTES из клеток, экспрессирующих лиганд LIGHT, такой как рецептор LIGHT (например, HVEM, LTpR и/или DcR3).

В некоторых вариантах связывающее анти-LIGHT-средство (или его вариант или его антигенсвязывающий фрагмент) присутствует в препаратах в количестве от примерно 5 мг/мл до примерно 280 мг/мл, например, от примерно 5 мг/мл до примерно 200 мг/мл, от примерно 50 мг/мл до примерно 250 мг/мл, от примерно 100 мг/мл до примерно 250 мг/мл, от примерно 50 мг/мл до примерно 200 мг/мл и от примерно 100 мг/мл до примерно 200 мг/мл. Например, связывающее анти-LIGHT-средство может присутствовать в препарате в количестве примерно 5 мг/мл, примерно 10 мг/мл, примерно 15 мг/мл, примерно 20 мг/мл, примерно 25 мг/мл, примерно 30 мг/мл, примерно 35 мг/мл, примерно 40 мг/мл, примерно 45 мг/мл, примерно 50 мг/мл, примерно 55 мг/мл, примерно 60 мг/мл, примерно 65 мг/мл, примерно 70 мг/мл, примерно 75 мг/мл, примерно 80 мг/мл, примерно 85 мг/мл, примерно 90 мг/мл, примерно 95 мг/мл, примерно 100 мг/мл, примерно 105 мг/мл, примерно 110 мг/мл, примерно 115 мг/мл, примерно 120 мг/мл, примерно 125 мг/мл, примерно 130 мг/мл, примерно 135 мг/мл, примерно 140 мг/мл, примерно 145 мг/мл, примерно 150 мг/мл, примерно 155 мг/мл, примерно 160 мг/мл, примерно 165 мг/мл, примерно 170 мг/мл, примерно 175 мг/мл, примерно 180 мг/мл, примерно 185 мг/мл, примерно 190 мг/мл, примерно 195 мг/мл, примерно 200 мг/мл, примерно 205 мг/мл, примерно 210 мг/мл, примерно 215 мг/мл, примерно 220 мг/мл, примерно 225 мг/мл, примерно 230 мг/мл, примерно 235 мг/мл, примерно 240 мг/мл, примерно 245 мг/мл, примерно 250 мг/мл, примерно 255 мг/мл, примерно 260 мг/мл, примерно 265 мг/мл, примерно 270 мг/мл, примерно 275 мг/мл или примерно 280 мг/мл.

В альтернативных вариантах связывающее анти-LIGHT-средство может присутствовать в препарате в количестве от примерно 5 до примерно 25 мг/мл, от примерно 26 до примерно 50 мг/мл, от примерно 51 до примерно 75 мг/мл, от примерно 76 до примерно 100 мг/мл, от примерно 101 до примерно 125 мг/мл, от примерно 126 до примерно 150 мг/мл, от примерно 151 до примерно 175 мг/мл, от примерно 176 до примерно 200 мг/мл, от примерно 201 мг/мл до примерно 225 мг/мл, от примерно 226 мг/мл до примерно 250 мг/мл, от примерно 251 до примерно 280 мг/мл, от примерно 5 до примерно 10 мг/мл, от примерно 40 до примерно 60 мг/мл, от примерно 75 до примерно 85 мг/мл или от примерно 140 до примерно 160 мг/мл.

В некоторых иллюстративных вариантах связывающее анти-LIGHT-средство присутствует в препарате в количестве от примерно 50 мг/мл до примерно 170 мг/мл, от примерно 100 мг/мл до примерно 160 мг/мл, например, примерно 150 мг/мл. Альтернативно связывающее анти-LIGHT-средство присутствует в количестве примерно 50 мг/мл. В другом иллюстративном варианте полностью человеческое IgG4-анти-LIGHT антитело, содержащее тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:7, и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:8, присутствует в препарате в количестве, составляющем примерно 150 мг/мл.

ii. Связывающие анти-CXCR5-средства и их варианты и фрагменты

В некоторых вариантах препараты согласно изобретению включают в себя связывающее анти-CXCR5-средство. Связывающие средства могут представлять собой любую молекулу, такую как антитело, миРНК, нуклеиновая кислота, аптамер, белок или низкомолекулярное органическое соединение, которое связывается или специфично связывается с CXCR5, или их вариант или фрагмент. В некоторых вариантах связывающее средство представляет собой анти-CXCR5-антитело или его вариант или его антигенсвязывающий фрагмент. Анти-CXCR5-антитела специфично связываются с белком CXCL13 (также известным как BLC), полипептидным фрагментом или эпитопом. Молекула CXCR5 может быть получена из любого вида. В некоторых вариантах молекула CXCR5 получена от человека, и в данном случае известна как «hCXCR5». hCXCR5 имеет следующую аминокислотную последовательность, которая указана в виде SEQ ID NO:14:

В некоторых иллюстративных вариантах анти-CXCR5-антитело является гуманизированным антителом, полностью человеческим антителом или его вариантом или его антигенсвязывающим фрагментом. В некоторых вариантах анти-CXCR5-антитела предотвращают связывание CXCR5 с его лигандами и ингибируют биологическую активность CXCR5 (например, связывание CXCR5 с CXCL13).

В некоторых конкретных вариантах анти-CXCR5-антитело содержит вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую аминокислотную последовательность любой одной или нескольких из следующих определяющих комплементарность областей (CDR):

HCDR1 - GFSLIDYGVN (SEQ ID NO:15);

HCDR2 - VIWGDGTTY (SEQ ID NO:16); или

HCDR3 - IVY (SEQ ID NO:17).

В других конкретных вариантах анти-CXCR5-антитело содержит вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую аминокислотную последовательность любой одной или нескольких из следующих определяющих комплементарность областей (CDR):

LCDR1 - RSSKSLLHSSGKTYLY (SEQ ID NO:18);

LCDR2 - RLSSLA (SEQ ID NO:19); или

LCDR3 - MQHLEYPYT (SEQ ID NO:20).

В одном конкретном варианте анти-CXCR5-антитело содержит вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую аминокислотные последовательности SEQ ID NO:15, 16 и 17.

В другом конкретном варианте анти-CXCR5-антитело содержит вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую аминокислотные последовательности SEQ ID NO:18, 19 и 20.

В более конкретных вариантах анти-CXCR5-антитело содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотные последовательности SEQ ID NO:15, 16 и 17; и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотные последовательности SEQ ID NO:18, 19 и 20.

В конкретных вариантах анти-CXCR5-антитело содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:21:

В другом конкретном варианте анти-CXCR5-антитело содержит вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:22:

В более конкретных вариантах анти-CXCR5 антитело содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:21; и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:22.

В некоторых вариантах анти-CXCR5-антитело, кроме того, содержит константную область, например, константную область IgG человека. В некоторых вариантах константная область представляет собой константную область IgG4 человека. В дополнительных вариантах константная область представляет собой модифицированную константную область IgG4 человека. В некоторых вариантах константная область IgG4 человека имеет следующие модификации: S241P (смотрите ниже в SEQ ID NO:23 жирным шрифтом), L248E (смотрите ниже в SEQ ID NO:23 жирным шрифтом), и не имеет концевого лизина, чтобы избежать гетерогенности. В некоторых вариантах константная область IgG4 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:23:

В других вариантах константная область представляет собой константную область Cκ человека. В некоторых вариантах константная область Cκ содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:24:

В конкретных вариантах анти-CXCR5 антитело содержит тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:25:

Положения 1-111: вариабельная область тяжелой цепи (VH). CDR (определяющие комплементарность области согласно определению Кабата) подчеркнуты.

Положения 112-432: константная область IgG4 человека (SwissProt IGHG4_HUMAN, включающая следующие модификации: S241P, L248E и отсутствие концевого лизина, чтобы избежать гетерогенности).

В других конкретных вариантах анти-CXCR5-антитело содержит легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:26:

Положения 1-112: вариабельная область легкой цепи (VL). CDR (определяющие комплементарность области, согласно определению Кабата) подчеркнуты.

Положения 113-182: константная область Cκ человека.

В следующих вариантах анти-CXCR5 антитело содержит тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:25, и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:26.

В некоторых вариантах анти-CXCR5-антитело, кроме того, содержит лидерную последовательность. Лидерная последовательность в некоторых вариантах содержит аминокислотную последовательность длиной 1-30 аминокислот, например 25-25 аминокислот, и обычно 19 аминокислот. Тяжелая цепь, легкая цепь или обе, и тяжелая и легкая цепь, могут содержать лидерную последовательность. В некоторых вариантах лидерная последовательность содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:16: MGWSCIILFLVATATGVHS (SEQ ID NO:27).

В конкретных вариантах анти-CXCR5 антитело содержит тяжелую цепь, полученную из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:28:

Положения 1-19: лидерная последовательность.

Положения 20-130: вариабельная область тяжелой цепи (VH). CDR (определяющие комплементарность области, согласно определению Кабата) подчеркнуты.

Положения 131-456: константная область IgG4 человека (SwissProt IGHG4_HUMAN, включающая следующие модификации: S241P, L248E и отсутствие концевого лизина, чтобы избежать гетерогенности).

В других конкретных вариантах анти-CXCR5 антитело содержит легкую цепь, полученную из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:29:

Положения 1-19: лидерная последовательность.

Положения 20-131: вариабельная область легкой цепи (VL). CDR (определяющие комплементарность области, согласно определению Кабата) подчеркнуты.

Положения 132-238: константная область Cκ человека.

В следующих вариантах анти-CXCR5-антитело содержит тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:28, и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:29.

В некоторых вариантах осуществления изобретения анти-CXCR5-антитело представляет собой гуманизированное или a полностью человеческое антитело. Примеры изотипов гуманизированных и полностью человеческих антител включают IgA, IgD, IgE, IgG и IgM. В некоторых вариантах анти-CXCR5-антитело представляет собой IgG-антитело. Существует четыре формы IgG. В некоторых вариантах анти-CXCR5-антитело представляет собой IgG4-антитело. В некоторых вариантах осуществления изобретения анти-CXCR5-антитело представляет собой гуманизированное IgG4-антитело.

В некоторых вариантах осуществления изобретения анти-CXCR5-антитело является гуманизированным IgG4-анти-CXCR5-антителом, содержащим тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:25, и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:26 («лидирующее CXCR5-антитело»). В альтернативных вариантах осуществления изобретения анти-CXCR5-антитело является гуманизированным IgG4-анти-CXCR5-антителом, содержащим вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, при этом вариабельная область тяжелой цепи содержит 3 определяющих комплементарность области (CDR), содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO:15, 16 и 17, и вариабельная область легкой цепи содержит 3 CDR, содержащих аминокислотные последовательности SEQ ID NO:18, 19 и 20. Идентификация, выделение, приготовление и характеристика анти-CXCR5-антител, включая анти-CXCR5-антитело, содержащее аминокислотную последовательность тяжелой цепи, содержащую последовательность SEQ ID NO:25, и аминокислотную последовательность легкой цепи, содержащую последовательность SEQ ID NO:26, были подробно описаны в публикации PCT WO 2009/032661, которая включена в настоящее описание в виде ссылки.

Некоторые варианты препаратов согласно изобретению также содержат варианты связывающих анти-CXCR5-средств, таких как антитела. В частности, препараты согласно изобретению могут содержать варианты анти-CXCR5-антитела, которое является гуманизированным IgG4-анти-CXCR5-антителом, содержащим тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:25, и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:26. Варианты анти-CXCR5-антитела могут иметь сходные физико-химические свойства на основе их высокого сходства, и поэтому также включены в объем изобретения. Варианты определяют как антитела с аминокислотной последовательностью, которая, по меньшей мере, на 95%, по меньшей мере, на 97%, например, по меньшей мере, на 98% или 99% гомологичны анти-CXCR5-антителу и способна конкурировать за связывание с полипептидом CXCR5, фрагментом полипептида CXCR5 или эпитопом CXCR5. В некоторых вариантах осуществления изобретения варианты буду ослаблять, нейтрализовать или иным образом ингибировать биологическую активность CXCR5 (например, связывание CXCL13 с CXCR5). Определение конкуренции за связывание с мишенью можно осуществить обычными способами, известными специалисту в данной области. В некоторых вариантах осуществления изобретения варианты представляют собой человеческие антитела, и в некоторых вариантах являются молекулами IgG4. В некоторых вариантах осуществления изобретения вариант, по меньшей мере, на 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичен по аминокислотной последовательности лидирующему антителу. Термин «вариант» относится к антителу, которое содержит аминокислотную последовательность, которая изменена на одну или несколько аминокислот по сравнению с аминокислотными последовательностями анти-CXCR5-антитела. Вариант может иметь консервативные модификации последовательности, включая аминокислотные замены, модификации, добавления и делеции.

Примеры модификаций включают без ограничения гликозилирование, ацетилирование, пегилирование, фосфорилирование, амидирование, дериватизацию известными защитными/блокирующими группами, протеолитическое расщепление и связывание с клеточным лигандом или другим белком. Модификации аминокислот можно вводить стандартными способами, известными в данной области, такими как сайт-специфичный мутагенез, молекулярное клонирование, сайт-специфичный мутагенез с использованием олигонуклеотидов и случайный опосредованный ПЦР мутагенез, в нуклеиновую кислоту, кодирующую антитела. Консервативные аминокислотные замены включают замены, при которых аминокислотный остаток заменяют аминокислотным остатком, имеющим сходные структурные или химические свойства. Семейства аминокислотных остатков, имеющих сходные боковые цепи, были определены в данной области. Такие семейства включают аминокислоты с основными боковыми цепями (например, лизин, аргинин, гистидин), кислыми боковыми цепями (например, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота), незаряженными полярными боковыми цепями (например, аспарагин, глутамин, серин, треонин, тирозин, цистеин, триптофан), неполярными боковыми цепями (например, глицин, аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин), бета-разветвленными боковыми цепями (например, треонин, валин, изолейцин) и ароматическими боковыми цепями (например, тирозин, фенилаланин, триптофан). Специалисту в данной области будет понятно, что также можно использовать другие классификации семейств аминокислотных остатков, отличные от классификации, приведенной выше. Кроме того, вариант может иметь неконсервативные аминокислотные замены, например, замену аминокислоты аминокислотным остатком, обладающим другими структурными или химическими свойствами. Сходные небольшие изменения также могут включать делеции или инсерции аминокислот или и то и другое. Руководство по определению того, какие аминокислотные остатки могут быть заменены, модифицированы, встроены или делетированы без снижения иммунологической активности, можно найти, используя компьютерные программы, хорошо известные в данной области. Можно использовать компьютерные алгоритмы, наряду с другими такие как Gap или Bestfit, которые известны специалисту в данной области, чтобы оптимально выравнивать сравниваемые аминокислотные последовательности и определять сходные или идентичные аминокислотные остатки. Варианты могут иметь такие же или другие, либо более высокие, либо более низкие, аффинности связывания по сравнению с анти-CXCR5-антителом, но при этом все еще оставаться способными специфично связываться с CXCR5, и могут иметь такую же, более высокую или более низкую биологическую активность по сравнению с активностью анти-CXCR5-антитела.

Варианты осуществления изобретения также включают антигенсвязывающие фрагменты связывающих анти-CXCR5-средств, таких как антитела. Термин «антигенсвязывающий домен», «антигенсвязывающая область», «антигенсвязывающий фрагмент» и подобные термины относятся к такой части антитела, которая содержит аминокислотные остатки, которые взаимодействуют с антигеном и придают связывающему средству специфичность и аффинность по отношению к антигену (например, области, определяющие комплементарность (CDR)). Антигенсвязывающая область может быть получена от любого вида животного, такого как грызуны (например, кролик, крыса или хомячок), и человека. В некоторых вариантах антигенсвязывающая область может иметь человеческое происхождение. Неограничивающие примеры антигенсвязывающих фрагментов включают: Fab-фрагменты, F(ab’)₂-фрагменты, Fd-фрагменты, Fv-фрагменты, одноцепочечные молекулы Fv (scFv), dAb-фрагменты и минимальные единицы узнавания, состоящие из аминокислотных остатков, которые имитируют гипервариабельную область антитела.

В некоторых вариантах осуществления изобретения связывающие анти-CXCR5-средства (или их вариант или их антигенсвязывающий фрагмент) будут ослаблять, нейтрализовать или иным образом ингибировать биологическую активность CXCR5 in vivo (например, связывание CXCL13 c CXCR5).

В некоторых вариантах осуществления изобретения связывающие анти-CXCR5-средства (или их вариант или их антигенсвязывающий фрагмент) являются антагонистическими связывающими средствами, которые ослабляют, нейтрализуют или иным образом ингибируют биологическую активность CXCR5 in vivo (например, связывание CXCL13 с CXCR5).

В некоторых вариантах связывающее анти-CXCR5-средство (или его вариант или его антигенсвязывающий фрагмент) присутствует в препаратах в количестве от примерно 5 мг/мл до примерно 280 мг/мл, например, примерно 5 мг/мл до примерно 200 мг/мл, примерно 5 мг/мл до примерно 125 мг/мл, от примерно 5 мг/мл до примерно 75 мг/мл, от примерно 5 мг/мл до примерно 50 мг/мл и от примерно 5 мг/мл до примерно 25 мг/мл. Например, связывающее анти-CXCR5-средство может присутствовать в препарате в количестве примерно 5 мг/мл, примерно 10 мг/мл, примерно 15 мг/мл, примерно 20 мг/мл, примерно 25 мг/мл, примерно 30 мг/мл, примерно 35 мг/мл, примерно 40 мг/мл, примерно 45 мг/мл, примерно 50 мг/мл, примерно 55 мг/мл, примерно 60 мг/мл, примерно 65 мг/мл, примерно 70 мг/мл, примерно 75 мг/мл, примерно 80 мг/мл, примерно 85 мг/мл, примерно 90 мг/мл, примерно 95 мг/мл, примерно 100 мг/мл, примерно 105 мг/мл, примерно 110 мг/мл, примерно 115 мг/мл, примерно 120 мг/мл, примерно 125 мг/мл, примерно 130 мг/мл, примерно 135 мг/мл, примерно 140 мг/мл, примерно 145 мг/мл, примерно 150 мг/мл, примерно 155 мг/мл, примерно 160 мг/мл, примерно 165 мг/мл, примерно 170 мг/мл, примерно 175 мг/мл, примерно 180 мг/мл, примерно 185 мг/мл, примерно 190 мг/мл, примерно 195 мг/мл, примерно 200 мг/мл, примерно 205 мг/мл, примерно 210 мг/мл, примерно 215 мг/мл, примерно 220 мг/мл, примерно 225 мг/мл, примерно 230 мг/мл, примерно 235 мг/мл, примерно 240 мг/мл, примерно 245 мг/мл, примерно 250 мг/мл, примерно 255 мг/мл, примерно 260 мг/мл, примерно 265 мг/мл, примерно 270 мг/мл, примерно 275 мг/мл или примерно 280 мг/мл.

В альтернативных вариантах связывающее анти-CXCR5-средство может присутствовать в препарате в количестве от примерно 5 до примерно 25 мг/мл, от примерно 26 до примерно 50 мг/мл, от примерно 51 до примерно 75 мг/мл, от примерно 76 до примерно 100 мг/мл, от примерно 101 до примерно 125 мг/мл, от примерно 126 до примерно 150 мг/мл, от примерно 151 до примерно 175 мг/мл, от примерно 176 до примерно 200 мг/мл, от примерно 201 мг/мл до примерно 225 мг/мл, от примерно 226 мг/мл до примерно 250 мг/мл, от примерно 251 до примерно 280 мг/мл, от примерно 5 до примерно 25 мг/мл, от примерно 40 до примерно 60 мг/мл, от примерно 75 до примерно 85 мг/мл или от примерно 90 до примерно 110 мг/мл.

В некоторых иллюстративных вариантах связывающее анти-CXCR5-средство присутствует в препарате в количестве примерно 20 мг/мл. Альтернативно связывающее анти-CXCR5-средство присутствует в количестве примерно 100 мг/мл. В другом иллюстративном варианте гуманизированное-IgG4-анти-CXCR5-антитело, содержащее тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:25, и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:26, присутствует в препарате в количестве примерно 20 мг/мл или 100 мг/мл.

iii. Буферные средства

Препараты согласно изобретению содержат цитратный буфер в качестве буферного средства. Буферное средство поддерживает физиологически подходящий pH. Кроме того, буферное средство повышает изотоничность и химическую стабильность препарата. В некоторых вариантах цитратный буфер присутствует в препаратах в концентрации от примерно 0,5 мМ до примерно 50 мМ, например, от примерно 5 мМ до примерно 15 мМ. Например, цитратный буфер может присутствовать в препарате в концентрации примерно 5 мМ, примерно 6 мМ, примерно 7 мМ, примерно 8 мМ, примерно 9 мМ, примерно 10 мМ, примерно 11 мМ, примерно 12 мМ, примерно 13 мМ, примерно 14 мМ, примерно 15 мМ, примерно 16 мМ, примерно 17 мМ, примерно 18 мМ, примерно 19 мМ, примерно 20 мМ, примерно 21 мМ, примерно 22 мМ, примерно 23 мМ, примерно 24 мМ, примерно 25 мМ, примерно 26 мМ, примерно 27 мМ, примерно 28 мМ, примерно 29 мМ, примерно 30 мМ, примерно 31 мМ, примерно 32 мМ, примерно 33 мМ, примерно 34 мМ, примерно 35 мМ, примерно 36 мМ, примерно 37 мМ, примерно 38 мМ, примерно 39 мМ, примерно 40 мМ, примерно 41 мМ, примерно 42 мМ, примерно 43 мМ, примерно 44 мМ, примерно 45 мМ, примерно 46 мМ, примерно 47 мМ, примерно 48 мМ, примерно 49 мМ и примерно 50 мМ. В некоторых вариантах цитратный буфер присутствует в препарате в концентрации от примерно 7 мМ до примерно 13 мМ, такой как от примерно 9 мМ до примерно 11 мМ. В некоторых вариантах цитратный буфер присутствует в концентрации примерно 10 мМ.

В некоторых вариантах препараты согласно изобретению имеют pH, равный или ниже pH 6. В некоторых вариантах pH препаратов находится в диапазонах от примерно 5,0 до примерно 6,0. Например, pH препаратов может составлять примерно 5,0, примерно 5,1, примерно 5,2, примерно 5,3, примерно 5,4, примерно 5,5, примерно 5,6, примерно 5,7, примерно 5,8, примерно 5,9 и примерно 6,0. В некоторых вариантах pH препаратов может быть в диапазоне от примерно 5,5 до примерно 6,0. В некоторых вариантах pH составляет либо примерно 5,5, либо примерно 6,0. Значение pH препарата можно измерить любыми способами, известными специалистам в данной области. Способы измерения pH включают использованием pH-метра с микроэлектродом. pH препарата можно корректировать, используя любые способы, известные в данной области. Примерами химических соединений для изменения pH препаратов являются хлористоводородная кислота (HCl) и гидроксид натрия (NaOH).

В некоторых вариантах препараты согласно изобретению имеют значение pH, равное или ниже изоэлектрической точки (pI) связывающего средства, такого как антитело. Изоэлектрическая точка означает значение pH, при котором конкретная молекула или поверхность не несет суммарного электрического заряда. pI связывающего анти-LIGHT- или анти-CXCR5-средства может быть определена любыми способами, известными специалистам в данной области. В некоторых вариантах pI анти-LIGHT- или анти-CXCR5-антитела определяют, используя изоэлектрическое фокусирование в денатурированном состоянии. Как показано на фиг. 1, pI полностью человеческого IgG4-анти-LIGHT-антитела, содержащего тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:7, и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:8, составляет 6,8-7,2. Как показано на фиг. 11, pI гуманизированного IgG4-анти-CXCR5-антитела, содержащего тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:25, и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:26, составляет 7,6-8,4.

iv. Поверхностно-активные вещества

Препараты согласно изобретению необязательно могут дополнительно содержать поверхностно-активное вещество, которое также известно как стабилизирующее средство. Поверхностно-активные вещества/стабилизирующие средства представляют собой химические соединения, которые взаимодействуют и стабилизируют биологические молекулы и/или основные фармацевтические эксципиенты в препарате. В некоторых вариантах поверхностно-активные вещества могут быть использованы вместе с хранением при более низкой температуре. Поверхностно-активные вещества обычно защищаю связывающее средство от индуцируемых на границе раздела воздух/раствор стрессов и индуцируемых на поверхности раствора стрессов, которые в противном случае могут приводить к агрегации белков. Поверхностно-активные вещества могут включать без ограничения полисорбаты, глицерин, дикарбоновые кислоты, щавелевую кислоту, янтарную кислоту, фумаровую кислоту, фталевые кислоты и их сочетания. Специалистам в данной области известно, что можно использовать другие поверхностно-активные вещества, например, неионогенные или ионогенные детергенты, при условии, что они являются фармацевтически приемлемыми, т.е. подходящими для введения субъектам. Поверхностно-активным веществом в некоторых вариантах является полисорбат. Примеры полисорбатов включают полисорбат 20, полисорбат 40, полисорбат 60, полисорбат 65 и полисорбат 80.

В иллюстративных вариантах поверхностно-активное вещество присутствует в препаратах в количестве от примерно 0,001% до примерно 0,1% (масс./об.). Например, поверхностно-активное вещество может присутствовать в препаратах в количестве примерно 0,001% (масс./об.), примерно 0,002% (масс./об.), примерно 0,003% (масс./об.), примерно 0,004% (масс./об.), примерно 0,005% (масс./об.), примерно 0,006% (масс./об.), примерно 0,007% (масс./об.), примерно 0,008% (масс./об.), примерно 0,009% (масс./об.), примерно 0,01% (масс./об.), примерно 0,02% (масс./об.), примерно 0,03% (масс./об.), примерно 0,04% (масс./об.), примерно 0,05% (масс./об.), примерно 0,06% (масс./об.), примерно 0,07% (масс./об.), примерно 0,08% (масс./об.), примерно 0,09% (масс./об.) и примерно 0,1% (масс./об.). В конкретных вариантах поверхностно-активное вещество присутствует в препаратах в количестве от примерно 0,003% до примерно 0,05% (масс./об.), от примерно 0,004% до примерно 0,025% (масс./об.) или от примерно 0,005% до примерно 0,02% (масс./об.), например, примерно 0,005% (масс./об.). Например, полисорбат 20 может присутствовать в количестве от примерно 0,001% до примерно 0,1% (масс./об.), от примерно 0,002% до примерно 0,01% (масс./об.), от примерно 0,003% до примерно 0,008% (масс./об.) и от примерно 0,004% до примерно 0,006% (масс./об.), например, примерно 0,005% (масс./об.). В альтернативных вариантах полисорбат 20 присутствует в количестве от примерно 0,001% до примерно 0,1% (масс./об.), от примерно 0,005% до примерно 0,05% (масс./об.) и от примерно 0,0075% до примерно 0,025% (масс./об.), например, примерно 0,01% (масс./об.). В следующих альтернативных вариантах полисорбат 20 присутствует в количестве от примерно 0,001% до примерно 0,1% (масс./об.), от примерно 0,005% до примерно 0,05% (масс./об.) и от примерно 0,01% до примерно 0,03% (масс./об.), например, примерно 0,02% (масс./об.).

v. Средства для тоничности

Препараты согласно изобретению необязательно могут дополнительно содержать средство для тоничности. Обычно средства для тоничности используют для того, чтобы скорректировать или поддержать осмоляльность препаратов, чтобы сделать ее ближе к осмотическому давлению жидкостей организма, таких как кровь или плазма. Средства для тоничности также могут поддерживать уровни связывающего средства в препарате. Отчасти, средство для тоничности вносит вклад в сохранение уровня, соотношения или доли терапевтически активного связывающего средства, присутствующего в препарате. В используемом в настоящем описании смысле термин «тоничность» относится к характеристике биологических компонентов в жидкой среде или растворе. Изотоничные растворы имеют такое же осмотическое давление, как и плазма крови, и могут быть внутривенно инфузированы субъекту без изменения осмотического давления плазмы крови субъекта. Действительно, в некоторых вариантах осуществления изобретения средство для тоничности присутствует в количестве, достаточного для того, чтобы сделать препарат подходящим для внутривенной инфузии. Часто средство для тоничности служит в качестве объемообразующего агента, а также стабилизатора. Как таковое средство для тоничности может обеспечивать возможность преодоления связывающим средством различных стрессов, таких как замораживание и скалывание. Средства для тоничности могут включать без ограничения сахариды, сахара, глицерин, сорбит, маннит, хлорид натрия, хлорид калия, хлорид магния и другие неорганические соли. Специалистам в данной области известно, что можно использовать другие средства для тоничности, при условии, что они являются фармацевтически приемлемыми, т.е., подходящими для введения субъектам.

В некоторых вариантах средство для тоничности присутствует в препаратах в количестве от примерно 0,1% to 10% (масс./об.). Например средство для тоничности может присутствовать в препарате в количестве примерно 0,1% (масс./об.), примерно 0,2% (масс./об.), примерно 0,3% (масс./об.), примерно 0,4% (масс./об.), примерно 0,5% (масс./об.), примерно 0,6% (масс./об.), примерно 0,7% (масс./об.), примерно 0,8% (масс./об.), примерно 0,9% (масс./об.), примерно 1% (масс./об.), примерно 2% (масс./об.), примерно 3% (масс./об.), примерно 4% (масс./об.), примерно 4,5% (масс./об.), примерно 5% (масс./об.), примерно 5,5% (масс./об.), примерно 6% (масс./об.), примерно 7% (масс./об.), примерно 8% (масс./об.), примерно 9% (масс./об.) и примерно 10% (масс./об.). Альтернативно средство для тоничности может присутствовать в препарате в количестве от примерно 2% до примерно 8% (масс./об.), от примерно 3% до примерно 7% (масс./об.) и от примерно 4% до примерно 6% (масс./об.). В следующих альтернативных вариантах средство для тоничности может присутствовать в препарате в количестве от примерно 0,1% до примерно 1%, от примерно 0,1% до примерно 0,5%, от примерно 0,1 до примерно 0,3% и примерно 0,2%.

В некоторых иллюстративных вариантах средством для тоничности является сахарид. Примеры сахаридов включают глюкозу, сахарозу, мальтозу, трегалозу, декстрозу, ксилит, фруктозу и маннит. Например, маннит может присутствовать в количестве от примерно 1% до примерно 10% (масс./об.), от примерно 2% до примерно 8% (масс./об.) или от примерно 3% до примерно 5% (масс./об.), например, примерно 4% (масс./об.). Альтернативно, сахароза может присутствовать в количестве от примерно 1% до примерно 10% (масс./об.), от примерно 3% до примерно 8% (масс./об.) или от примерно 4% до примерно 6% (масс./об.), например, примерно 4,5, 5, 5,5 или 6% (масс./об.).

В некоторых других иллюстративных вариантах средством для тоничности является хлорид натрия. Например, хлорид натрия может присутствовать в количестве примерно 0,1% (масс./об.), примерно 0,2% (масс./об.), примерно 0,3% (масс./об.), примерно 0,4% (масс./об.), примерно 0,5% (масс./об.), примерно 0,6% (масс./об.), примерно 0,7% (масс./об.), примерно 0,8% (масс./об.), примерно 0,9% (масс./об.) и примерно 1% (масс./об.). Альтернативно, хлорид натрия может присутствовать в препарате в количестве от примерно 0,1% до примерно 1%, от примерно 0,1% до примерно 0,5%, от примерно 0,1 до примерно 0,3% и примерно 0,2%.

В следующих иллюстративных вариантах препараты могут содержать одно или несколько средство для тоничности. Например, препараты могут содержать одно или несколько из указанных выше средств для тоничности в указанных выше концентрациях. В некоторых конкретных вариантах препараты могут содержать сахарозу и хлорид натрия, при этом концентрации и сахарозы и хлорида натрия составляют от примерно 0,1% до примерно 10% (масс./об.). В некоторых вариантах концентрация сахарозы составляет примерно 6% и концентрация хлорида натрия составляет примерно 0,2%. Альтернативно концентрация сахарозы составляет примерно 4,5%, и концентрация хлорида натрия составляет примерно 0,2%.

В некоторых вариантах осуществления изобретения осмоляльность препаратов находится в диапазоне от примерно 200 мОсм/кг до примерно 350 мОсм/кг, от примерно 270 мОсм/кг до примерно 330 мОсм/кг, от примерно 280 мОсм/кг до примерно 320 мОсм/кг или от примерно 290 мОсм/кг до примерно 310 мОсм/кг, например, примерно 300 мОсм/кг. Другими словами препараты согласно изобретению в некоторых вариантах являются по существу изотоничными, т.е. имеющими по существу такое же осмотическое давление, как и кровь человека. Осмоляльность может быть измерена любыми способами, известными специалистам в данной области, такими как способы, основанные на использовании осмометров давления пара или криоскопические осмометры. Осмоляльность препаратов согласно изобретению, например, можно регулировать, используя одно или несколько средств для тоничности, описанных в настоящей публикации.

vi. Аминокислоты

Препараты согласно изобретению необязательно могут дополнительно содержать аминокислоту. Примеры аминокислот включают без ограничения глицин, аланин, аспарагиновую кислоту, лизин, серин, тирозин, цистеин, глутамин, метионин, аргинин и пролин. В иллюстративных вариантах аминокислота присутствует в препаратах в количестве от примерно 0,1% до 5% (масс./об.). Например, аминокислота может присутствовать в препарате в количестве примерно 0,1% (масс./об.), примерно 0,2% (масс./об.), примерно 0,3% (масс./об.), примерно 0,4% (масс./об.), примерно 0,5% (масс./об.), примерно 0,6% (масс./об.), примерно 0,7% (масс./об.), примерно 0,8% (масс./об.), примерно 0,9% (масс./об.), примерно 1,0% (масс./об.), примерно 1,1% (масс./об.), примерно 1,2% (масс./об.), примерно 1,3% (масс./об.), примерно 1,4% (масс./об.), примерно 1,5% (масс./об.), примерно 1,6% (масс./об.), примерно 1,7% (масс./об.), примерно 1,8% (масс./об.), примерно 1,9% (масс./об.), примерно 2,0% (масс./об.), примерно 3% (масс./об.), примерно 4% (масс./об.) и примерно 5% (масс./об.). Альтернативно, аминокислота присутствует в препарате в количестве от примерно 1,3% до примерно 1,8% (масс./об.) или от примерно 1,4% до примерно 1,6% (масс./об.), например, примерно 1,5% (масс./об.). В следующих альтернативных вариантах аминокислота присутствует в препарате в количестве от примерно 0,5% до примерно 1,5% (масс./об.) или от примерно 0,8% до примерно 1,2% (масс./об.), например, примерно 1,0% (масс./об.). Примером аминокислоты является пролин или аргинин. Например, пролин может присутствовать в препарате в количестве от примерно 1% до примерно 2%, (масс./об.) от примерно 1,3% до примерно 1,8% (масс./об.), от примерно 1,4% до примерно 1,6% (масс./об.), например, примерно 1,5% (масс./об.). Альтернативно, аргинин может присутствовать в препарате в количестве от примерно 0,5% до примерно 1,5% (масс./об.) или от примерно 0,8% до примерно 1,2% (масс./об.), например, примерно 1,0% (масс./об.).

vii. Другие эксципиенты

Кроме того, препараты согласно изобретению могут содержать другие эксципиенты, включая без ограничения, воду для инъекций, разбавители, солюбилизаторы, успокоительные средства, дополнительные буферы, неорганические или органические соли, антиоксиданты или тому подобные. Однако в некоторых вариантах препараты согласно изобретению не содержат других эксципиентов, за исключением эксципиентов, описанных выше. Другие фармацевтически приемлемые носители, эксципиенты или стабилизаторы, такие как описанные в Remington's Pharmaceutical Sciences 16^th edition, Osol, A. Ed. (1980), могут быть включены в препарат, при условии, что они не оказывают неблагоприятного влияния на требуемые характеристики препарата. В конкретном варианте препарат по существу не содержит консервантов, хотя в альтернативных вариантах консерванты могут быть при необходимости добавлены. Например, в лиофилизируемые препараты могут быть включены криопротекторы или лиопротекторы.

viii. Жидкие или лиофилизированные препараты

Препараты согласно изобретению могут представлять собой либо жидкие препараты, либо лиофилизированные препараты. В некоторых вариантах препараты являются жидкими препаратами. В некоторых вариантах жидкие препараты являются готовыми препаратами для инъекции. Альтернативно, препараты могут быть в виде лиофилизированных порошков. В некоторых вариантах лиофилизированные порошки приготовлены для объединения с растворителем непосредственно перед введением.

ix. Примеры препаратов

В одном иллюстративном варианте осуществления изобретения изобретение относится к стабильному жидкому препарату антитела, подходящему для подкожного введения, при этом препарат содержит:

a) более чем примерно 80 мг/мл, например, примерно 150 мг/мл, полностью человеческого IgG4-антитела против LIGHT (лимфотоксин-подобный, проявляет индуцируемую экспрессию и конкурирует с гликопротеидом D HSV за HVEM, рецептор, экспрессируемый T-лимфоцитами), содержащего тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:7, и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:8;

b) примерно 10 мМ цитратный буфер;

c) примерно 0,005% (масс./об.) полисорбата 20; и

d) примерно 4% (масс./об.) маннита;

при этом pH препарата составляет примерно pH 5,5.

В некоторых иллюстративных вариантах такой препарат может быть произведен следующим образом:

a) растворение примерно 10 мМ дигидрата цитрата натрия в воде для инъекций и доведением pH буферного раствора примерно до pH 5,5, например, с использованием либо хлористоводородной кислоты, либо гидроксида натрия;

b) добавление более чем примерно 80 мг/мл, например, примерно 150 мг/мл, полностью человеческого IgG4-антитела против LIGHT (лимфотоксин-подобный, проявляет индуцируемую экспрессию и конкурирует с гликопротеидом D HSV за HVEM, рецептор, экспрессируемый T-лимфоцитами), содержащего тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:7, и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:8, примерно 4% (масс./об.) маннита и 0,005% (масс./об.) полисорбата 20 к буферному раствору, полученному на стадии a) с перемешиванием в сосуде, изготовленном из инертного материала, вплоть до полного растворения, и затем доведение pH полученного препарата примерно до pH 5,5 с использованием либо хлористоводородной кислоты, либо гидроксида натрия, и затем добавление буферного раствора со стадии a) с доведением до конечной массы получаемого препарата;

c) фильтрование препарата, полученного на стадии b) в асептических условиях с использованием стерилизованного, совместимого мембранного фильтра, имеющего номинальный размер пор 0,2 мкм, и затем стерилизация препарата фильтрованием в асептических условиях в стерилизованные емкости, изготовленные из инертного материала, с использованием стерилизованного совместимого мембранного фильтра, имеющего номинальный размер пор 0,2 мкм;

d) наполнение препаратом, полученным на стадии c), в асептических условиях в стерилизованные флаконы, которые закрывают пробками и вальцуемыми колпачками с фланцем; и необязательно

e) осмотр емкостей, полученных на стадии d) в отношении крупных посторонних примесей, не нарушенной герметичности и видимых частиц.

В другом иллюстративном варианте осуществления изобретения изобретение относится к стабильному жидкому препарату антитела, подходящему для внутривенного введения, при этом препарат содержит:

a) от примерно 5 до примерно 80 мг/мл, например, примерно 50 мг/мл, полностью человеческого IgG4-антитела против LIGHT (лимфотоксин-подобный, проявляет индуцируемую экспрессию и конкурирует с гликопротеидом D HSV за HVEM, рецептор, экспрессируемый T-лимфоцитами), содержащего тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:7, и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:8;

b) примерно 10 мМ цитратный буфер; и

c) примерно 0,01% (масс./об.) полисорбата 20;

при этом pH препарата составляет примерно pH 5,5.

В альтернативном иллюстративном варианте осуществления изобретения изобретение относится к стабильному лиофилизованному препарату антитела, подходящему для внутривенного введения, при этом препарат содержит:

a) от примерно 5 до примерно 80 мг/мл, например, примерно 50 мг/мл, полностью человеческого IgG4-антитела против LIGHT (лимфотоксин-подобный, проявляет индуцируемую экспрессию и конкурирует с гликопротеидом D HSV за HVEM, рецептор, экспрессируемый T-лимфоцитами), содержащего тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:7, и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:8;

b) примерно 10 мМ цитратный буфер;

c) примерно 0,01% (масс./об.) полисорбата 20;

d) примерно 5% (масс./об.) сахарозы; и

e) примерно 1,5% (масс./об.) пролина;

при этом pH препарата составляет примерно pH 5,5.

В иллюстративном варианте осуществления изобретения изобретение относится к стабильному препарату антитела, содержащему:

a) примерно 20 мг/мл гуманизированного IgG4-антитела против CXCR5 (рецептор хемокина C-X-C типа 5), содержащего тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:25, и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:26;

b) примерно 10 мМ цитратный буфер;

c) примерно 0,02% полисорбата 20;

d) примерно 6% сахарозы; и

e) примерно 0,2% хлорида натрия;

при этом pH препарата составляет примерно pH 6,0.

В альтернативном иллюстративном варианте осуществления изобретения изобретение относится к стабильному препарату антитела, содержащему:

a) примерно 100 мг/мл гуманизированное IgG4-антитела против CXCR5 (рецептор хемокина C-X-C типа 5), содержащего тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:25, и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:26;

b) примерно 10 мМ цитратный буфер;

c) примерно 0,01% полисорбата 20;

d) примерно 4,5% сахарозы;

e) примерно 0,2% хлорида натрия; и

f) примерно 1% аргинина;

при этом pH препарата составляет примерно pH 6,0.

x. Стабильность

Препараты согласно изобретению являются стабильными при 5°C в течение, по меньшей мере, примерно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 месяцев или больше, и обычно, по меньшей мере, примерно 12, 18 или 24 месяцев или больше. В иллюстративных вариантах они являются стабильными при 5°C в течение, по меньшей мере, примерно 6 месяцев или больше. В других иллюстративных вариантах они являются стабильными при 5°C в течение, по меньшей мере, примерно 9 месяцев. В следующих иллюстративных вариантах они являются стабильными при 5°C в течение, по меньшей мере, примерно 1 года или больше, и обычно примерно 2 года.

C. Способы введения

В некоторых вариантах осуществления изобретения препараты подходят для введения парентерально, внутривенно, внутримышечно, интрадермально, подкожно или для комбинации указанных введений. Препараты согласно изобретению подходят для доставки различными способами.

В некоторых вариантах осуществления изобретения препарат вводят внутривенно. Например, препараты, содержащие 80 мг/мл связывающего IgG4-средства, такого как антитела, или меньше желательно вводить внутривенно. Таким образом, препараты обычно являются стерильными. Способы получения стерильных препаратов хорошо известны в данной области и включают, например, фильтрование через стерильные фильтрационные мембраны или автоклавирование ингредиентов препарата за исключением антител примерно при 120°C в течение примерно 30 минут. Например, изобретение относится к стабильному жидкому препарату антитела, подходящему для внутривенного введения, при этом препарат содержит: a) от примерно 5 до примерно 80 мг/мл, например, примерно 50 мг/мл, полностью человеческого IgG4-антитела против LIGHT (лимфотоксин-подобный, проявляет индуцируемую экспрессию и конкурирует с гликопротеидом D HSV за HVEM, рецептор, экспрессируемый T-лимфоцитами), содержащего тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:7, и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:8; b) примерно 10 мМ цитратный буфер; и c) примерно 0,01% (масс./об.) полисорбата 20; при этом pH препарата составляет примерно pH 5,5. Альтернативно, изобретение относится к стабильному препарату антитела, содержащему: a) примерно 20 мг/мл гуманизированного IgG4-антитела против CXCR5 (рецептор хемокина C-X-C типа 5), содержащего тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:25, и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:26; b) примерно 10 мМ цитратный буфер; c) примерно 0,02% полисорбата 20; d) примерно 6% сахарозы; и e) примерно 0,2% хлорида натрия; при этом pH препарата составляет примерно pH 6,0.

В некоторых вариантах осуществления изобретения препарат вводят подкожно. Например, препараты, содержащие более 80 мг/мл связывающего IgG4-средства, такого как антитело, желательно вводить подкожно. В конкретном варианте желательно вводить субъектам подкожно стабильный жидкий препарат антитела, содержащий: a) примерно 150 мг/мл полностью человеческого IgG4-антитела против LIGHT (лимфотоксин-подобный, проявляет индуцируемую экспрессию и конкурирует с гликопротеидом D HSV за HVEM, рецептор, экспрессируемый T-лимфоцитами), содержащего тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:7, и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:8; b) примерно 10 мМ цитратный буфер; c) примерно 0,005% (масс./об.) полисорбата 20; d) примерно 4% (масс./об.) маннита; и при этом pH препарата составляет примерно pH 5,5. Альтернативно, изобретение относится к стабильному препарату антитела, содержащему: a) примерно 100 мг/мл гуманизированного IgG4-антитела против CXCR5 (рецептор хемокина C-X-C типа 5), содержащего тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:25, и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:26; b) примерно 10 мМ цитратный буфер; c) примерно 0,01% полисорбата 20; d) примерно 4,5% сахарозы; e) примерно 0,2% хлорида натрия; и f) примерно 1% аргинина; при этом pH препарата составляет примерно pH 6,0.

D. Дозы и дозированные формы

Эффективные дозы препаратов согласно изобретению варьируют в зависимости от многих разных факторов, включая способы введения, участок-мишень, физиологическое состояние субъекта, о того, является ли субъект человеком или животным, других вводимых лекарственных средств и от того, является ли лечение профилактическим или терапевтическим. Обычно субъектом является человек, но также можно лечить млекопитающих, отличных от человека. Может требоваться титрование доз лечения, чтобы оптимизировать безопасность и эффективность.

Препараты согласно изобретению можно вводить во многих случаях. Интервалы между отдельными дозами быть разными: введение может быть ежедневно, еженедельно, раз в две недели, ежемесячно или ежегодно. Интервалы также могут быть нерегулярными. В некоторых способах дозу корректируют, чтобы получить определенную концентрация в плазме связывающего средства, такого как антитело. Дозы и частота будут варьировать в зависимости от времени полужизни связывающего анти-LIGHT- или анти-CXCR5-средства, такого как антитело, в организме субъекта. В общем, человеческие антитела имеют более длительное время полужизни, затем следуют гуманизированные антитела, химерные антитела и антитела животных, отличных от человека.

В следующих вариантах изобретение относится к стандартной фармацевтической дозе, содержащей терапевтически эффективное количество препарата согласно изобретению для лечения одного или нескольких заболеваний у субъекта посредством введения дозированной формы субъекту. В некоторых вариантах субъектом является человек. Человек может быть взрослым или может быть ребенком. Термин «фармацевтическая стандартная дозированная форма» относится к физически дискретной единице, подходящей в качестве разовых доз для субъектов, подвергаемых лечению, при этом каждая единица содержит предварительно определяемое количество активного соединения, вычисляемое так, чтобы получить требуемый терапевтический/профилактический эффект, вместе с необходимым цитратным буфером и pH.

Стандартная дозированная форма может быть в виде емкости, содержащей препарат. Подходящие емкости включают без ограничения герметично закрытые ампулы, флаконы, бутылочки, шприцы и пробирки. Емкости могут быть сделаны из множества материалов, таких как стекло или пластмасса, и могут иметь стерильный доступ для проникновения (например, емкость может представлять собой флакон, имеющий пробку, прокалываемую иглой для подкожной инъекции). В некоторых вариантах емкость представляет собой флакон. Обычно емкость должна поддерживать стерильность и стабильность препарата.

В конкретных вариантах препараты упакованы во флаконы объемом 2 мл, которые изготавливают из прозрачного бесцветного стекла типа I и закрывают пробками (покрытый фторполимером бромбутил), герметизируемыми вальцуемыми колпачками с фланцем (полипропилен). В некоторых вариантах флаконы заполняют 1,2 мл препаратов так, чтобы флакон содержал избыточный объем примерно 0,2 мл на флакон и извлекаемый объем 1,0 мл. Например, то означает, что составляющее дозу количество анти-LIGHT-антитела (например, 150 мг/мл) будет содержаться в 1 мл раствора.

В конкретном варианте препараты вторично упаковывают в емкость, такую как картонная коробка, которая защищает флаконы от света.

E. Способы лечения

Кроме того, в настоящем изобретении предлагаются способы лечения LIGHT-опосредованного заболевания или расстройства, при этом способы включают в себя введение субъекту препарата согласно изобретению. Изобретение, кроме того, относится к препарату согласно изобретению для применения в описанном в настоящей публикации способе лечения LIGHT-опосредованного заболевания или расстройства. В некоторых вариантах LIGHT-опосредованным заболевание является хроническое заболевание кишечника или воспалительное заболевание кишечника (IBD), такое как болезнь Крона (CD) или язвенный колит (UC). В других вариантах LIGHT-опосредованным заболеванием является болезнь «трансплантат против хозяина» (GVHD).

Также в настоящем изобретении предлагаются способы лечения CXCR5-опосредованного заболевания или расстройства, при этом способы включают в себя введение субъекту препарата согласно изобретению. Изобретение, кроме того, относится к препарату согласно изобретению для применения в описанном в настоящей публикации способе лечения CXCR-5-опосредованного заболевания или расстройства. В некоторых вариантах связывающее анти-CXCR5-средство используют для снижения признаков и симптомов, ингибирования прогрессирования структурного повреждения, индукции основного клинического ответа и предотвращения потери трудоспособными у взрослых пациентов с активным ревматоидным артритом (RA) от умеренной до тяжелой формы, у которых имел место неадекватный ответ на одно или несколько модифицирующих заболевание противоревматических лекарственных средств (DMARD), таких как метотрексат (MTX) или антагонисты TNFα. Связывающее анти-CXCR5-средство можно применять в сочетании с DMARD или анти-TNFα-агонистами.

В некоторых вариантах препараты согласно изобретению можно вводить в сочетании с одним или несколькими терапевтическими средствами (например, терапевтическими средствами, которые не являются препаратами согласно изобретению, которые вводят в настоящее время для профилактики, лечения, контролирования и/или ослабления LIGHT-опосредованного заболевания или CXCR5-опосредованного заболевания. Использование термина «в сочетании» не ограничивает порядок, в котором вводят терапевтические средства субъекту. Первое терапевтическое средство можно вводить до (например, за 1 минуту, 45 минут, 30 минут, 45 минут, 1 час, 2 часа, 4 часа, 6 часов, 12 часов, 24 часа, 48 часов, 72 часа, 96 часов, 1 неделю, 2 недели, 3 недели, 4 недели, 5 недель, 6 недель, 8 недель или 12 недель), одновременно или после (например, через 1 минуту, 45 минут, 30 минут, 45 минут, 1 час, 2 часа, 4 часа, 6 часов, 12 часов, 24 часа, 48 часов, 72 часа, 96 часов, 1 неделю, 2 недели, 3 недели, 4 недели, 5 недель, 6 недель, 8 недель или 12 недель) введения второго терапевтического средства субъекту, который имел, имеет или является чувствительным к LIGHT-опосредованному заболевание или CXCR5-опосредованному заболеванию. Можно вводить любое дополнительное терапевтическое средство в любом порядке с другими дополнительными терапевтическими средствами. Не ограничивающие примеры терапевтических средств, которые можно вводить в сочетании с антителом согласно изобретению, включают одобренные противовоспалительные средства, перечисленные в Фармакопеи США и/или настольном справочнике врача.

F. Наборы

Некоторые варианты осуществления изобретения включают набор, содержащий препарат согласно изобретению. Набор может дополнительно содержать одну или несколько емкостей, содержащих фармацевтически приемлемые эксципиенты, и включает в себя другие материалы, желательные с коммерческой точки зрения и с точки зрения потребителя, включая фильтры, иглы и шприцы. Вместе с наборами могут быть предоставлены инструкции, которые обычно вкладывают в коммерческие упаковки терапевтических, профилактических или диагностических продуктов, которые содержат информацию, например, о показаниях, применении, дозах, производстве, введении, противопоказаниях и/или предупреждениях, касающихся применения таких терапевтических, профилактических или диагностических продуктов. Набор также может быть снабжен ярлыком, который может представлять собой любой носитель данных (например, информационный листок, самоклеющуюся этикетку, чип, штамп или штрих-код), содержащий информацию. В некоторых вариантах инструкции и т.д., которые перечислены выше, могут находится внутри или на этикетке. Набор может дополнительно содержать устройство для введения препарата, и в частности, устройство, которое содержит препарат, т.е., предварительно заполняемое устройство, такое как без ограничения предварительно заполняемый шприц или предварительно заполняемый автоинжектор. Набор также может содержать емкость, содержащую препарат, т.е., предварительно заполняемую емкость, такую как предварительно заполняемый флакон, картридж, саше или ампулу.

G. Сочетание разных вариантов

В контексте настоящего изобретения любой из описанных в настоящей публикации вариантов можно сочетать с одним или несколькими другими описанными в настоящей публикации вариантами, если ясно не указано обратное. В частности, любое из описанных в настоящей публикации связывающих средств и антител и описанных в настоящей публикации препаратов можно применять в сочетании с любым из наборов, предварительно заполняемых устройств или предварительно заполняемых емкостей или можно применять в способах лечения или медицинских применениях, которые описаны в настоящей публикации в связи с соответствующим антителом (например, стабильные препараты, содержащие анти-LIGHT-антитела или анти-CXCR5-антитела можно сочетать с любым из описанных в настоящей публикации наборов, емкостей или устройств). Любое из описанных в настоящей публикации связывающих средств, специфично связывающих антиген (например, связывающее средство, специфично связывающее LIGHT, или связывающее средство, специфично связывающее CXCR5), также можно применять в любом из способов лечения, которые описаны в настоящей публикации в связи с соответствующими антителами (т.е. анти-LIGHT или анти-CXCR5) и наоборот.

ПРИМЕРЫ

Чтобы помочь проиллюстрировать изобретение, предлагаются следующие примеры. Примеры никоим образом не предназначены для ограничения объема изобретения. В общем, при практическом осуществлении настоящего изобретения используют, если не указано иное, обычные способы приготовления фармацевтических препаратов, химии, молекулярной биологии, методику рекомбинации ДНК, иммунологии, такие методики получения антител, и стандартные способы получения полипептидов, которые описаны, например, в Sambrook, Fritsch and Maniatis, Molecular Cloning: Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); Antibody Engineering Protocols (Methods in Molecular Biology), volume 51, Ed.: Paul S., Humana Press (1996); Antibody Engineering: A Practical Approach (Practical Approach Series, 169), Eds.: McCafferty J. et al., Humana Press (1996); Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow and Lane, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1999); and Current Protocols in Molecular Biology, Eds. Ausubel et al., John Wiley & Sons (1992).

Анти-LIGHT

Полностью человеческое IgG4-антитело против LIGHT, содержащее тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:7, и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:8 («лидирующее LIGHT-антитело»), использовали в примерах 1-9, чтобы определить оптимальные условия приготовления препаратов.

МАТЕРИАЛЫ

Партия лекарственной субстанции

Лидирующее антитело, приготовленное в фосфатно-солевом буфере (PBS) в концентрации 5,5 мг/мл и при pH 7,3 («исходный препарат», «PBS-препарат» или «эталонная партия»), использовали в следующих примерах.

Эксципиенты

В таблице 1 показаны эксципиенты, которые использовали в следующих примерах и которые были выбраны в соответствии с их приемлемостью/пригодностью для применения в случае парентеральных продуктов.

СПОСОБЫ

Следующие способы использовали для производства экспериментальных препаратов и препаратов согласно изобретению, содержащих лучшее LIGHT-антитело.

Приготовление и состав буферов

Все буферы готовили при перемешивании, чтобы растворить соответствующие эксципиенты. pH корректировали, используя 0,1 М HCl или 0,1 М NaOH. Общая концентрация всех буферов составляла 10 мМ.

Приготовление и состав маточных растворов эксципиентов

Все маточные растворы готовили при перемешивании, чтобы растворить эксципиенты. Концентрация приводили в виде массы/массу (масс./масс.).

Стерильная фильтрация образцов

Все образцы, растворы, буферы и т.д. стерильно фильтровали (0,22 мкм), используя мембрану Sartopore-2. Образцы фильтровали в стерилизованные бутылки или флаконы и закрывали в асептических условиях в боксах, чтобы предотвратить микробиологическую контаминацию.

Тестирование с использованием механического стресса

Механический стресс со скоростью встряхивания 350/минуту в течение 2,5 часа при комнатной температуре осуществляли, используя горизонтальный лабораторный встряхиватель с расстоянием 26 мм (инкубатор-встряхиватель из Buhler Company). Флаконы 2R наполняли 1 мл раствора, при этом свободное пространство составляло примерно 2,5 мл. Тестирование с использованием механического стресса планировали и осуществляли во время первого предварительного исследования компонентов для производства препарата и во время соответствующих исследований для выбора поверхностно-активного вещества.

Тестирование с использованием термического стресса

Термический стресс использовали в качестве стресс-теста во время всех стадий программы предварительного исследования компонентов-кандидатов. Образцы хранили при +40°C в течение либо 24, либо 7 суток, в зависимости от исследования.

Аналитические способы при заполнении и последующей обработке препаратов

Следующие аналитические способы использовали при заполнении и последующей обработке препаратов в следующих примерах.

Внешний вид

Внешний вид растворов антител проверяли визуально и дополнительно документировали, фотографируя цифровой камерой.

pH

Все измерения pH осуществляли, используя pH-метр с микроэлектродом.

Концентрация с использованием УФ

Концентрации белка во всех растворах антител измеряли против буфера, используя NanoDrop ND1000. Концентрации белка близкие или ниже 5 мг/мл разбавляли 1:3, тогда как белки в более высоких концентрациях, около 20 мг/мл, разбавляли 1:20 и измеряли оптическую плотность при 215 нм и 280 нм.

Динамическое светорассеяние (DLS)

Гидродинамический диаметр молекулы измеряли, используя лазерное светорассеяние. Образцы стерильно фильтровали перед аналитическим исследованием, если наблюдали мутность, таким образом, можно было выявлять только растворимые агрегаты.

Дифференциальная сканирующая калориметрия (DSC)

Аликвоты большинства образцов предварительных препаратов исследовали с помощью DSC, используя VPCapillary DSC из Microcal, и сканировали на устройстве с автоматическим отбором проб, используя параметры 90°C/час и время фильтра 2 секунды. Образцы объемом 400 мкл помещали в 96-луночные планшеты и анализировали в отношении температуры разворачивания Tm.

Осмолярность

Осмолярность измеряли, используя автоматический осмометр Knaur.

Плотность

Плотность препаратов измеряли, используя вискозиметр с падающим шариком DMA4500 Anton Paar.

Аналитические способы в биоаналитике FF

Следующие аналитические способы использовали в биоаналитике при заполнении и последующих процедурах в следующих экспериментах.

Эксклюзионная хроматография по размеру (SEC)

Агрегаты, а также продукты распада лидирующего антитела количественно оценивали, используя эксклюзионную ГЖ-хроматографию по размеру. Тестирование осуществляли, используя изократическую ВЭЖХ и колонку SUPERDEX 200 10/300.

SDS-ПААГ в восстанавливающих и не восстанавливающих условиях

Электрофорез в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (SDS-ПААГ) использовали для анализа целостности молекул (например, полумолекул) и чистоты. Такой электрофоретический анализ осуществляли, используя 4-12% градиентные гели в восстанавливающих и не восстанавливающих условиях. Белки визуализировали окрашиванием Кумасси после электрофоретического разделения.

Обмен слабыми катионами (WCX)

Слабокатионообменную хроматографию использовали для исследования гетерогенности заряда антитела. Представляли процентное содержание основных, нейтральных и кислых форм. Тест осуществляли, используя прерывистую высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ) и колонку ProPac WCX 10.

Твердофазный иммуноферментный анализ с использованием антигена (антиген-ELISA)

Антиген-ELISA осуществляли для того, чтобы определить функциональность антитела. Связывающие свойства по отношению к нативному белку LIGHT оценивали в сравнении с современным стандартом антитела. Такую эффективность выражали в виде относительного показателя EC50.

Изоэлектрическое фокусирование (IEF)

Осуществляли IEF. Изоэлектрическая картина была специфичной для лидирующего антитела и служила в качестве идентификационного теста. Распад можно было наблюдать на основании другой картины зарядов.

Хранение

Все буферные растворы, растворы эксципиентов и образцы хранили при 5°C (±3°C), если не указано иное.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ВСЕХ ПРИГОТОВЛЕННЫХ И ПРОАНАЛИЗИРОВАННЫХ ПРЕПАРАТОВ

В таблице 2, приведенной ниже, показано сводная характеристика всех препаратов, приготовленных и проанализированных в следующих примерах. Каждый из препаратов содержал лидирующее LIGHT-антитело в указанной концентрации.

ПРИМЕР 1 - Характеристика препарата в фосфатно-солевом буфере (PBS) и ассоциированных с ним недостатков

В данном примере характеризовали эталонную партию. Как указано в разделе «Материалы» выше, эталонная партия содержит лидирующее LIGHT-антитело, приготовленное в фосфатно-солевом буфере (PBS) в концентрации 5,5 мг/мл и при pH 7,3, и полученное в растворах для исследованиях Vitry (BioSCP).

Изоэлектрическое фокусирование (IEF) использовали для определения изоэлектрической точки (pI) лидирующего антитела. pI лидирующего LIGHT-антитела было вычислено теоретически и равно 6,28, и затем измеряли изоэлектрическим фокусированием в денатурированном состоянии, используя стандартные способы, известные в данной области. Как показано на фиг. 1, главные полосы показывают, что pI лидирующего LIGHT-антитела составляет 6,8-7,2.

SDS-ПААГ использовали для идентификации молекулярной массы мономера антитела, потенциальных агрегатов или присутствия полумолекул. На фиг. 2 показан SDS-ПААГ-гель, в котором сравнивали разные серии эталонной партии в восстанавливающих и не восстанавливающих условиях. ELISA использовали для определения антигенсвязывающей активности лидирующего LIGHT-антитела. На фиг. 3 показан график ELISA, который использовали для определения антигенсвязывающей активности первой и второй серий эталонной партии.

SEC использовали для определения присутствия агрегатов, а также продуктов распада первой серии эталонной партии. Как показано на фиг. 4, эксклюзионная хроматография по размеру выявила высокомолекулярные белки (HMWP), например, ди/олигомеры (RRT0.8) или агрегаты, и низкомолекулярные белки (LMWP) или продукты распада. Первая серия эталонной партии имела чистоту 97% по содержанию мономера.

WCX использовали для исследования гетерогенности заряда первой серии эталонной партии. Как показано на фиг. 5 происходило перераспределение кислых, нейтральных и основных изоформ во время исследований стабильности. Первая серия эталонной партии имела распределение кислых/нейтральных/основных изоформ 42,3/55,6/1,9%.

DSC использовали для анализа температуры разворачивания Tm первой серии эталонной партии. Как показано на фиг. 6 три домена антитела разворачивались при 68°C, 75°C и 78°C.

DLS использовали для определения гидродинамического диаметра мономера антитела и потенциальных растворимых агрегатов. Как показано на фиг. 7 и 8, определен гидродинамический диаметр, составляющий примерно 10 нм, но агрегаты в PBS не наблюдали. Однако агрегаты не наблюдали и в цитратном буфере (фиг.10).

ПРИМЕР 2 - Разработка забуференных цитратом препаратов и ассоциированные с ними преимущества

Исходный буфер, фосфатно-солевой буфер (PBS) с pH 7,3, был в отношении pH очень близок к изоэлектрической точке (pI) лидирующего антитела (смотрите пример 1). Кроме того, в исходном препарате наблюдали агрегаты; полумолекулы; продукты распада; низкомолекулярные белки (LMWP); высокомолекулярные белки (HMWP); и перераспределения кислых, основных и нейтральных изоформ антитела (смотрите пример 1). Таким образом, существовала потребность в улучшенном препарате, который не имеет таких недостатков.

Тестировали препараты лидирующего LIGHT-антитела (полностью человеческого IgG4-антитела против LIGHT, содержащего тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:7, и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:8), содержащие 10 мМ цитратный буфер с pH 5, 5,5 и 6, с полисорбатом 20 или без него. В таблице 3 показаны результаты анализа первой серии эталонной партии и различных экспериментальных препаратов лидирующего LIGHT-антитела, приготовленных в цитрате с pH 5,0 и 5,5 и 6,0, с полисорбатом 20 или без него. Агрегаты были обнаружены при измерениях с использованием динамического светорассеяния (DLS) в случае эталонной партии, но не обнаружены во всех других тестированных препаратах. Tm, которую измеряли с использованием дифференциальной сканирующей калориметрии (мкDSC), показала, что чем выше pH, тем более высокую термодинамическую стабильность можно предполагать. Но в случае высококонцентрированных препаратов антител pH нужно выбирать ниже pI антитела.

Как показано в таблице 4, данные эксклюзионной хроматографии по размеру (SEC) показали значимо сниженное количество высокомолекулярных белков (HMWP) в случае лидирующего LIGHT-антитела в цитратном буфере по сравнению с эталонной партией (фосфатный буфер с pH 7,3). Напротив, не смогли выявить различий при использовании SDS-ПААГ (таблица 5).