Результат интеллектуальной деятельности: L-Лизин-продуцирующая коринеформная бактерия с инактивированным геном ltbR и способ получения L-лизина с использованием этой бактерии

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к способу получения L-лизина с помощью ферментационного процесса с использованием модифицированной коринеформной бактерии, содержащей инактивированный ген ltbR, кодирующий транскрипционный регулятор.

Незаменимую аминокислоту L-лизин, широко используемую в качестве кормовой добавки для животноводства и птицеводства, традиционно получают ферментацией сахаров с помощью коринеформных бактерий, таких как Corynebacterium glutamicum (US 3687810, US 3929571), Brevibacterium sp. (US 3687810, US 3929571, RU 2034921), а также кишечной палочки Escherichia coli (RU 2347807). Современные штаммы, используемые для промышленного производства L-лизина, содержат комплекс изменений (мутаций) в геноме, обеспечивающих сверхпродукцию L-лизина при росте на средах с сахарами. Для получения штаммов-продуцентов L-лизина используют различные селекционные и генетические подходы, включая мутагенез, амплификацию отдельных или нескольких генов (J. Becker, et al, 2005), усиление активности отдельных генов (М. Ikeda, et al, 2012) или инактивацию генов (С. Riedel, et al, 2001) и направленное конструирование штаммов с помощью методов генной и метаболической инженерии (J. Becker, et al, 2011).

Несмотря на большое количество известных методов создания штаммов-продуцентов L-лизина, сохраняется потребность в разработке новых подходов для усовершенствования существующих способов синтеза L-лизина коринеформными бактериями.

Задачами настоящего изобретения являются создание с помощью новых методов штаммов с повышенным уровнем синтеза L-лизина, принадлежащих к роду Corynebacterium или роду Brevibacterium, и разработка способа получения L-лизина с использованием этих штаммов.

Задачи решены путем:

- получения L-лизин-продуцирующей бактерии, содержащей инактивированный ген ltbR и принадлежащей к роду Corynebacterium или роду Brevibacterium;

- разработки способа получения L-лизина, включающего культивирование заявляемой бактерии в подходящих условиях и выделение указанной L-аминокислоты из культуральной жидкости.

Задачи настоящего изобретения решены благодаря обнаружению того факта, что штаммы Corynebacterium или Brevibacterium с инактивированным геном ltbR (вследствие делеции части гена) обладают более высокой продуктивностью по L-лизину.

В соответствие с настоящим описанием изобретения в качестве бактерии может быть использована коринеформная бактерия, продуцирующая L-лизин, при этом бактерия модифицирована таким образом, что содержит инактивированный ген ltbR, в том числе, за счет утраты (делеции) части гена.

Термин «коринеформная бактерия» обозначает бактерии рода Corynebacterium и бактерии роду Brevibacterium, часть которых в настоящее время классифицируют как бактерии рода Corynebacterium (W. Liebl, et al, 1991.)

В качестве примеров коринеформной бактерии можно привести, но не ограничиться этим, штаммы Corynebacterium glutamicum DSM1412 (депонирован в немецкой коллекции типовых культур), Corynebacterium glutamicum ВКПМ В-12773, Brevibacterium flavum ВКПМ В-10945 и его производный Brevibacterium flavum ВКПМ - В12771, депонированные во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов, ВКПМ.

Термин «бактерия, способная продуцировать L-лизин» означает бактерию, способную накапливать L-лизин в культуральной среде в больших количествах по сравнению с природным или родительскими штаммами Corynebacterium glutamicum DSM1412, Corynebacterium glutamicum ВКПМ B-12773 или Brevibacterium flavum ВКПМ В-10945 и его производным Brevibacterium flavum ВКПМ В- В12771.

Термин «бактерия с инактивированным геном ltbR» означает, что бактерия модифицирована таким образом, что нуклеотидная последовательность гена ltbR из Brevibacterium flavum ВКПМ В-10945 (SEQ ID NO: 1) может содержать любые из известных мутаций (делеции, вставки, стоп-кодоны или мутации со сдвигом рамки считывания), которые приводят к инактивации функции гена, в том числе, делеция части гена.

Нуклеотидные последовательности гена в различных видах и штаммах коринеформных бактерий могут незначительно отличаться, поэтому нуклеотидная последовательность гена ltbR не ограничивается нуклеотидной последовательностью гена, приведенного в SEQ ID NO: 1, она может включать гены, гомологичные (не менее 95%) нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 1.

Направленное введение мутаций, включая делеции, приводящие к инактивации гена ltbR в хромосоме, может быть осуществлено с помощью известных методов генной инженерии, в частности метода замещения, основанного на гомологичной рекомбинации (Schafer A. et al, 1994).

С помощью ПЦР получают мутантный ген ltbR и бактерию для ее модификации трансформируют фрагментом ДНК, содержащим мутантный ген. Затем исходный ген на хромосоме замещают мутантным геном с помощью гомологичной рекомбинации и полученный штамм отбирают. Замещение гена с использованием гомологичной рекомбинации может быть проведено с использованием плазмиды, не способной к автономному поддержанию в клетке хозяина.

Способ в общем виде согласно настоящему изобретению.

Способом, согласно настоящему изобретению, является получение L-лизина, включающее стадии выращивания L-лизин-продуцирующей коринеформной бактерии с инактивированным геном ltbR в питательной среде с целью продукции и накопления L-лизина в питательной среде и выделения L-лизина из культуральной жидкости.

В качестве питательной среды для культивирования используют минеральную среду, включающую фосфаты натрия или калия, соли магния, а при необходимости соли марганца и железа и содержащую в качестве источника углерода глюкозу или глюкозные сиропы или сахарозу, в качестве источника азота - аммонийные соли или мочевину, а также необходимые для роста аминокислоты и витамины. В качестве компонентов, ускоряющих рост бактерий, дополнительно добавляют кукурузный экстракт или гидролизаты глютена или сои. Культивирование бактерий проводят при 24-42°C, преимущественно при 30-32°C, и pH среды в интервале 6,0-8,5, преимущественно в интервале 6,8-7,2.

Культивирование бактерий осуществляют в пробирках, колбах или специальных реакторах при аэробных условиях.

Примеры осуществления настоящего изобретения

Пример 1. Конструирование штамма Corynebacterium glutamicum ВКПМ В-12772, содержащего инактивированный ген ltbR.

Штамм Corynebacterium glutamicum ВКПМ В-12772 был сконструирован на основе штамма Corynebacterium glutamicum DSM1412 В-12773, производного штамма Corynebacterium glutamicum DSM1412, имеющего мутацию в гене lysC^Tre311Ser, путем замены нативного гена ltbR (SEQ ID NO: 1) мутантной копией гена (SEQ ID NO: 2). Для этого с помощью ПЦР была получена мутантная копия гена ltbR с делецией между 223 и 480 нуклеотидами в центральной части, которая была вставлена в плазмиду pIKA, полученную путем клонирования на векторе pUC19 ("Thermo scientific"), гена sacB из B. subtilis 168 (NC_000964, Accession Number X02730) и гена Km^R. Так как плазмида pIKA-ΔltbR не способна автономно поддерживаться в клетках Corynebacterium glutamicum, то после введения плазмиды с помощью электропорации в клетки С. glutamicum В-12773 были отобраны клоны, в хромосоме которых в результате двух циклов гомологичной рекомбинации происходило замещение нативного гена ltbR мутантной копией гена ΔltbR. Наличие замены в гене ltbR подтверждали с помощью ПЦР анализа и секвенирования. Полученный штамм Corynebacterium glutamicum с инактивированным геномом ΔltbR депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов ГосНИИгенетика как Corynebacterium glutamicum ВКПМ В-12772.

Пример 2. Конструирование штамма Brevibacterium flavum ВКПМ В-12774, содержащего инактивированный ген ltbR.

Штамм Brevibacterium flavum ВКПМ В-12774 был сконструирован на основе штамма Brevibacterium, flavum 90 ВКПМ В-10945 путем замены нативного гена ltbR (SEQ ID NO: 1) мутантной копией гена (SEQ ID NO: 2). Конструирование мутантной копии гена и замену нативного гена мутантной копией гена проводили как описано в Примере 1. Наличие замены в гене ltbR подтверждали с помощью ПЦР анализа и секвенирования. Полученный штамм с инактивированным геном ΔltbR депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов ГосНИИгенетика как Brevibacterium flavum ВКПМ В-12774.

Пример 3. Конструирование штамма Brevibacterium flavum ВКПМ В-12770, содержащего инактивированный ген ltbR.

Штамм Brevibacterium flavum ВКПМ В-12770 был сконструирован на основе штамма Brevibacterium flavum ВКПМ В-12771 мутанта штамма Brevibacterium flavum 90 ВКПМ В-10945. Штамм Brevibacterium flavum ВКПМ B-12771 является прототрофом по лейцину, не способен использовать ацетат в качестве единственного источника углерода, устойчив к дезоксиглюкозе, обладает повышенной активностью аспартаткиназы, диаминопимелатдегидрогеназы, пируваткарбоксилазы, диаминопимелатдекарбоксилазы, дигидропиколинатредуктазы, транскетолазы, фруктозо-1,6-дифосфатазы, обладает пониженной активностью изоцитратдегидрогеназы и UDP-N-ацетилмурамилтрипептидсинтазы.

Конструирование мутантной копии гена и замену нативного гена мутантной копией гена проводили как описано в Примере 1. Наличие замены в гене ltbR подтверждали с помощью ПЦР анализа и секвенирования. Полученный штамм с инактивированным геном ΔltbR депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов ГосНИИгенетика как Brevibacterium flavum ВКПМ В-12770.

Пример 4. Продукция L-лизина полученными штаммами

Оценку проводят в пробирочных тестах. Для этого 0,3 мл культуры каждого из сконструированных штаммов, предварительно выращенных в течение 22 ч с перемешиванием (240 об/мин) при 30°C, вносят в пробирки с 3 мл среды следующего состава (мас. %): глюкоза - 10,0, хлорид аммония - 2,5, фосфат калия однозамещенный - 0,1, сульфат магния семиводный - 0,1, мел - 2,5, биотин - 0,00001, тиамин - 0,00002, с добавлением кислотного гидролизата пшеничного глютена* 50,0 мл/л, вода - остальное. *Гидролизат пшеничного глютена получают путем гидролиза пшеничного глютена серной кислотой согласно известным способам гидролиза различного сырья с целью получения источника ростовых факторов при микробиологическом производстве аминокислот (Биотехнология и биоинженерия, Рига, 1978). Перед внесением в среду гидролизат нейтрализуют концентрированным аммиаком. В качестве штаммов сравнения используют родительские штаммы Corynebacterium glutamicum DSM1412 В-12773, Brevibacterium flavum ВКПМ В-10945 и Brevibacterium flavum ВКПМ В-12771.

Пробирки с культурами инкубируют в течение 36 ч с перемешиванием (250 об/мин) при 30°C и затем в культуральной жидкости определяют содержание L-лизина методом тонкослойной хроматографии. Результаты представлены в таблице.

Из результатов, представленных в таблице, следует, что штамм Corynebacterium glutamicum ВКПМ - В-12772, содержащий инактивированный ген ltbR, продуцирует в 2 раза больше L-лизина, чем родительский штамм. Штамм Brevibacterium flavum ВКПМ В-12770, содержащий мутантный ген ltbR, продуцирует на 14% больше L-лизина, чем родительский штамм. Продукция L-лизина в штамме Brevibacterium flavum ВКПМ В-12774 повышена не более чем на 2%.

Из результатов, представленных в таблице, следует, что различные штаммы коринеформных бактерий, содержащие инактивированный ген ltbR (Corynebacterium glutamicum ВКПМ - В-12772, Brevibacterium flavum ВКПМ В-12770, Brevibacterium flavum ВКПМ В-12774), обеспечивают увеличение продукции L-лизина до двухратного по сравнению с контрольными штаммами. При этом эффект, который оказывает инактивированный ген ltbR, снижается с ростом продуктивности родительских штаммов.

Список источников информации

1. US 3687810.

2. US 3929571.

3. US 3687810.

4. US 3929571.

5. RU 2034921.

6. RU 2347807.

7. Becker, J., Klopprogge, C., Zelder, O., Heinzle, E., and Wittmann, C. / Amplified Expression of Fructose 1,6-Bisphosphatase in Corynebacterium glutamicum Increases In Vivo Flux through the Pentose Phosphate Pathway and Lysine Production on Different Carbon Sources. // Applied and Environmental Microbiology. (2005). V. 71 (12). - P. 8587-8596.

8. M. Ikeda. / Sugar transport systems in Corynebacterium glutamicum: features and applications to strain development. // Appl Microbiol Biotechnol (2012) 96: 1191-1200.

9. Riedel C., Rittmann D., Dangel P. et al. / Characterization of phosphoenolpyruvate carboxykinase gene from Corynebacterium glutamicum and significance of the enzyme for growth and amino acid production. // J. Mol. Microbiol. Biotechnol. (2001) 3, 573-583.

10. Becker, J., Zelder, O., Hafner, S., Schroder, H., and Wittmann C. / From zero to hero - Design-based systems metabolic engineering of Corynebacterium glutamicum for L-lysine production. // Metabolic Engineering. (2011). V. 13. P. 159-168.

11. W. Liebl, M. Ehrmann, W. Ludwig and K.H. Schleifer. / Transfer of Brevibacterium divaricatum DSM 20297, Brevibacterium flavum DSM 20411, Brevibacterium lacfofermentum DSM 20412 and DSM 1412, and Corynebacterium lilium DSM 20137 to Corynebacterium glutamicum and Their Distinction by rRNA Gene Restriction Patterns // International Journal of Systematic Bacteriology (1991). - V. 41. - P. 255-260.

12. A., Tauch A., W., Kalinowski J., Thierbach G., and A. / Small mobilizable multi-purpose cloning vectors derived from the E. coli plasmids pK18 and pK19: selection of defined deletions in the chromosome of Corynebacterium glutamicum.” // Gene. - (1994). - V. 145. P. 69-73.

13. Биотехнология и биоинженерия, Рига, 1978.