Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ШТАММА Rhodococcus rhodochrous МЗЗ, ПРОДУЦИРУЮЩЕГО НИТРИЛГИДРАТАЗУ

Настоящее изобретение относится к биотехнологическому способу культивирования штамма Rhodococcus rhodochrous М33, продуцирующего нитрилгидратазу, и к среде культивирования, используемой в этом способе, для повышения выхода биомассы, проявляющей высокую нитрилгидратазную активность.

Развитие промышленных биотехнологических способов производства химических веществ приводит к большой заинтересованности в микроорганизмах со специальными ферментами, которые могут использоваться для выбранных биокаталитических реакций. Примером этого является способ биотехнологического производства, связанный с синтезом амидов, способ, который основан на способности некоторых микроорганизмов синтезировать нитрилгидратазу, фермент, который катализирует превращение нитритов органических кислот в соответствующие амиды. В этом отношении бактериальные штаммы, которые могут трансформировать акрилонитрил в акриламид, представляют исключительный интерес.

Способ культивирования соответствующих микроорганизмов играет важную роль в производстве каталитически активной биомассы или биокатализатора. Обычно два дополнительных приема применимы для повышения выхода ферментативной активности на единицу объема культурального бульона (общая активность в Ед/мл):

1. активация синтеза фермента (бактериальной) клеткой или, другими словами, повышение удельной ферментативной активности (Ед/мг сухой биомассы)

2. повышение выхода активных клеток (активной биомассы) на единицу объема культурального бульона.

В Британском Патенте 2087926 А и в цитированной в нем литературе описан, наряду с другими, способ культивирования штамма Corynebacterium N-774 (регистрационный номер FERM 4446 в Fermentation Research Institute). Штамм, который проявляет нитрилгидратазную активность, культивируется в питательной среде с минеральными веществами, содержащей водорастворимые соединения железа в концентрациях, как минимум 0,2 мг/л вместе с 1 мас.% казеинового гидролизата (казаминовые кислоты). Недостатками этого способа являются высокая стоимость казеиновых гидролизатов и полученная низкая нитрилгидратазная активность:

Специфическая активность = 53,3 Ед/мг, сухая биомасса = 5,66 мг/мл, общая активность = 301,7 Ед/мл.

Известно, что нитрилы и амиды органических кислот, в особенности пропионовой и изомасляной кислот, вызывают индукцию нитрилгидратазной активности. В этом отношении можно сделать вывод на основании данных Патента США № 4555487, что добавление таких веществ, которые известны в качестве фермент-индуцирующих агентов или индукторов, к культуральной среде штамма Pseudomonas chlororaphis В 23 (FERM BP-187) и штамма Pseudomonas sp. PS 1 (FERM BP-188), делает возможным получение биомассы (5,36 г/л сухой биомассы) с удельной активностью 62,65 Ед/мг и общей активностью 335,8 Ед/мл.

Недостатки, присущие этому способу, связаны с использованием дорогостоящих индукторов и полученной низкой нитрилгидратазной активностью клеток.

Культуральная среда, описанная в ЕР 0115781 для инкубации штамма Pseudomonas chlororaphis В 23 (FERM BP-187) и штамма Pseudomonas sp. PS 1 (FERM BP-188), содержит не только индукторы, описанные, например, в патенте США № 4555487, но также одну или более α-аминокислот в качестве повышающих ферментативную активность агентов. Например, α-аминокислоты, такие как дицистеин, цистеин, аланин, валин, метионин и др., используются в концентрациях в диапазоне от 0,1 до 10,0 г/л. Тем не менее, удельная активность биомассы, полученной этим путем, не превышала 105,7 Ед/мг и общая активность не превышала 428,1 Ед/мл.

Более высокая нитрилгидратазная активность была достигнута при инкубации штамма Rhodococcus rhodochrous М33, как это описано в Патенте Германии 4480132. Эта публикация свидетельствует о том, что при культивировании штамма в синтетической питательной среде, содержащей глюкозу (концентрация 5 г/л), вполне возможно получить клетки, проявляющие удельную активность вплоть до 200 Ед/мг и общую активность вплоть до 360 Ед/мл. Важным преимуществом предложенного способа является простота питательной среды, которая не содержит каких-либо дорогих компонентов. Впрочем, повышение концентрации глюкозы до 20 г/л приводило к повышению общей активности до значения, не превышающего 1368 Ед/мл.

Способ, отвечающий промышленным требованиям, описан в Европейском Патенте 0362829 для культивирования штамма Rhodococcus rhodochrous J1 (FERM BP-1478). В питательной среде, которая содержит недорогой индуктор (мочевина (концентрация 15 г/л) и соединения двухвалентного кобальта), предложенный способ культивирования делает возможным получить клетки, проявляющие удельную активность 578 Ед/мг. Для повышения выхода клеток (выхода биомассы) в питательную среду добавляются пептон и дрожжевой экстракт. Тем не менее, достигнутая общая активность не превышает 2480 Ед/мл, потому что выход биомассы всего лишь 4,3 г/л. Масштабирование процесса культивирования до производственных условий повышало выход клеток до 28 г/л, что сопровождалось снижением удельной нитрилгидратазной активности до 76 Ед/мг и уменьшением общей активности до 2100 Ед/мл (Yamada H., Kobayashi M., "Nitrile hydratase and Application to Industrial Production of Acrylamide", Biosci. Biotech. Biochem., 60(9), 1391-1400, 1996).

В литературе описан другой способ культивирования штамма Rhodococcus rhodochrous М33 (Kim B-Y., Kim J-C., Lee H-H., Hyun H-H., "Fed-batch Fermentation for Production of Nitrile Hydratase by Rhodococcus rhodochrous М33", Biotechnol. Bioprocess Eng., 6: 11-17, 2001). Этод способ включает в себя ферментацию с подпиткой, с ограничением глюкозы в 5-литровом ферментере на полностью синтетической культуральной среде, состоящей из KH₂PO₄, K₂HPO₄, FeSO₄x7H₂O, EDTA-2Na, MgSO₄x7H₂O, NaCl, CoCl₂x6H₂O, мочевины и глюкозы. Путем постоянного регулирования подачи раствора глюкозы концентрации 40% и трех периодических добавок CoCl₂x6H₂O (0,01 г/л) к раствору глюкозы были достигнуты выход клеток 24 г/л и удельная нитрилгидратазная активность 120 Ед/мг. Тем не менее, общая активность, достигнутая после относительно длительного времени ферментации, приблизительно 115 часов, не превышала 2880 Ед/мл.

Таким образом, все еще существует потребность в биотехнологических способах культивирования штаммов, проявляющих нитрилгидратазную активность, которые обеспечивают возможность повышения промышленного выхода биомассы, проявляющей высокую нитрилгидратазную активность.

Таким образом, целью настоящего изобретения является предоставление такого способа.

Неожиданно было найдено, что способ культивирования Rhodococcus rhodochrous, продуцирующего нитрилгидратазу, например, штамма М33, который депонирован под номером DSM 14230 в DSMZ, Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH), Marschroder Weg 1b, D-38124 Brunswick, Germany, становится объектом изобретения, когда культивирование осуществляется с использованием культуральной среды на основе от 12 до 60 мМ фосфатного буфера, соответствующего потребностям клеток в фосфоре и поддерживающего рН в интервале от 5,5 до 9,0 в процессе культивирования и к которому дозируется уксусная кислота в качестве нового источника углерода после потребления предусмотренной в начальной стадии глюкозы.

В соответствии с данным изобретением применяется культуральная среда, которая соответствует потребностям клеток в фосфоре и делает возможным поддержание рН в интервале от 5,5 до 9,0 в процессе культивирования. Предпочтительно, такая культуральная среда содержит кукурузный экстракт в качестве дополнительного ростового фактора.

В способе данного изобретения особенно предпочтительным является использование кукурузного экстракта в качестве дополнительного ростового фактора в культуральной среде, путем добавления его в форме, например, кукурузного сиропа в концентрации, например, от 1 до 10 г/л. В качестве кукурузного экстракта может быть любая жидкость при замочке кукурузы, которая содержит компоненты кукурузных зерен, которые перешли в раствор в концентрированной форме в результате стандартного процесса замачивания. В соответствии с данным изобретением предпочтительно использовать жидкости от замачивания кукурузы, поставляемые под наименованием Cerestar 15840 фирмой Cerestar Deutschland GmbH, Krefeld.

Культуральная среда (сокращенно обозначаемая в дальнейшем в данном документе как SI), которая может применяться в способе данного изобретения, предпочтительно имеет следующий состав (в г/л):

a) 7,9 г/л Na₂HPO₄x12H₂O

b) 1,8 г/л KH₂PO₄

c) от 0,02 до 0,04 г/л CoCl₂x6H₂O

d) 1,0 г/л MgSO₄x7H₂O

e) от 0 до 10 г/л кукурузного экстракта

f) от 20 до 90 г/л глюкозы

g) от 4 до 20 г/л мочевины.

В частности, применяется такая культуральная питательная среда, к которой добавлен кукурузный экстракт в концентрации от 1 до 10 г/л, предпочтительно, от 2 до 8 г/л и еще более предпочтительно, от 2 до 6 г/л. Наиболее предпочтительным является применение в культуральной питательной среде кукурузного экстракта в концентрации 4 г/л.

Основой культуральной питательной среды является 12-60 мМ фосфатный буфер, соответствующий потребностям клеток в фосфоре и обеспечивающий уверенность, что может быть поддержано значение рН в интервале от 5,5 до 9,0 в процессе культивирования; глюкоза и уксусная кислота используются в качестве источника углерода, и уксусная кислота используется в качестве нового дополнительного источника углерода помимо глюкозы.

Особо предпочтительным в способе данного изобретения является использование 35,3 мМ фосфатного буфера.

В успешном варианте культуральная среда содержит от 20 до 90 г/л, предпочтительно от 20 до 60 г/л и более предпочтительно от 20 до 40 г/л глюкозы в качестве источника углерода, особенно при культивировании во встряхиваемых колбах. Помимо глюкозы уксусная кислота может использоваться в качестве источника углерода, источник углерода предпочтительно добавлять по двухэтапной схеме, особенно при культивировании в ферментерах в лабораторном или промышленном масштабе.

Первая стадия процесса характеризуется инициацией и интенсификацией клеточного роста Rhodococcus rhodochrous М33 на основе первого источника углерода, исходно присутствующего в среде, предпочтительно 20 г/л глюкозы. Ферментация, сопровождающаяся потреблением глюкозы, продолжается на второй стадии, которая известна как процесс с подпиткой, в котором в качестве источника углерода используется уксусная кислота. Не столь дорогостоящая уксусная кислота может заменить пригодную для культивирования глюкозу, и вышеупомянутая уксусная кислота обеспечивает высокую удельную нитрилгидратазную активность и высокую общую активность.

Уксусная кислота может быть успешно альтернативно добавлена в форме ее водорастворимых солей, при этом ацетат натрия является особенно предпочтительным в качестве водорастворимой соли уксусной кислоты. В одном из примеров осуществления изобретения в соответствии с изобретением может использоваться водорастворимая соль уксусной кислоты дозированно после потребления глюкозы, в этом случае предпочтительный для применения ацетат натрия может добавляться в подпитывающей концентрации от 1 до 4 г/л. Добавление ацетата натрия с подпитывающей концентрацией 3 г/л является особенно предпочтительным.

В другом примере осуществления способа изобретения водорастворимая соль уксусной кислоты, предпочтительно ацетат натрия, присутствует в исходной загрузке. После того как рН возрастет до 7,5-8,5, уксусная кислота дозируется в виде водного раствора с концентрацией от 20 до 50%, предпочтительно 30%. Успешным является дозирование водного раствора уксусной кислоты в питательную среду с постоянным значением рН от 7,5 до 8,5, предпочтительно при рН 7,9.

Кроме того, способ этого изобретения может осуществляться посредством дозирования добавляемых компонентов, предпочтительно CoCl₂x6H₂O и мочевины, в определенное время и в подходящих концентрациях в процессе ферментации, при этом кобальт действует как кофактор и мочевина действует как индуктор.

В частности, от 4 до 20 г/л мочевины и от 0,02 до 0,04 г/л CoCl₂ x 6H₂O дозированно добавляются к культуральной среде для индукции нитрилгидратазы. Предпочтительным является присутствие мочевины в качестве индуктора в исходной загрузке питательной среды, предпочтительно, в концентрации 4 г/л, и остаток дозируется в предпочтительной концентрации в питающей среде 6 г/л после расходования первоначально предоставленной глюкозы.

В соответствии с изобретением добавление CoCl₂x6H₂O в качестве кофактора может осуществляться посредством смешивания CoCl₂x6H₂O, предпочтительно с концентрацией в питающей среде 0,01 г/л с питательной средой в начале экспотенциальной фазы роста на основе глюкозы в качестве источника углерода и затем после расходования глюкозы посредством дополнительного дозированного добавления предпочтительно с подающейся смесью в концентрации 0,03 г/л.

Было неожиданно найдено, что время ферментации может быть сокращено в случае, если способ изобретения осуществляется с дозированным добавлением CoCl₂x6H₂O, предпочтительно с концентрацией в питающей среде 0,01 г/л с момента начала экспотенциальной фазы роста.

Культивирование штамма по способу изобретения осуществляется во встряхиваемых колбах (встряхиваемые культуры) и в лабораторных или промышленных ферментерах в температурном интервале от 25 до 30°С в течение времени культивирования от 48 до 170 часов. В предпочтительном варианте осуществления способа изобретения подача кислорода в процессе культивирования, особенно в промышленных ферментерах, контролируется таким образом, чтобы относительное парциальное давление О₂ было более 30%, предпочтительно ≥50%.

Преимущества способа этого изобретения для культивирования штамма Rhodococcus rhodochrous М33, продуцирующего нитрилгидратазу, заключаются в том, что использование культуральной среды этого изобретения, особенно, если кукурузный экстракт применяется как дополнительный фактор роста, дает возможность продуцирования не только больших количеств биомассы, содержащей нитрилгидратазу (выход вплоть до 39,5 г/л сухой биомассы), но также еще и в том, что биомасса проявляет высокую специфическую нитрилгидратазную активность (вплоть до 315 Ед/мг), в то же время может достигаться общая нитрилгидратазная активность 7169 Ед/мл, как это можно заключить из нижеприведенных примеров.

В противоположность известному способу культивирования штаммов, продуцирующих нитрилгидратазу, настоящий способ в соответствии с этим изобретением характеризуется использованием культуральной среды, основанной на фосфатном буфере 12-60 мМ, который удовлетворяет потребности клеток в фосфоре и поддерживает рН в интервале от 5,5 до 9,0 в процессе культивирования, и путем дозированного добавления уксусной кислоты в качестве нового источника углерода после расходования первоначально предоставленного количества глюкозы. Кроме того, кукурузный экстракт в жидкости от замочки кукурузы может использоваться в качестве дополнительного ростового фактора. Более того, преимуществами являются то, что имеется возможность замены глюкозы, которая может применяться для культивирования, не слишком дорогой уксусной кислотой, и таким образом при использовании способа изобретения обеспечивается высокая удельная нитрилгидратазная активность и высокая общая активность.

Стандартный тест для измерения нитрилгидратазной активности

1 мл раствора акрилонитрила с концентрацией 2% в 10 мМ фосфатном буфере (рН 7,5) смешивается с 1 мл суспензии клеток М33, полученной предварительным центрифугированием культурального бульона, промывкой и последующим ресуспендированием клеток в 10 мМ фосфатном буфере (рН 7,5). Суспензия содержит от 0,08 до 0,16 мг клеток (сухой массы). Реакция протекает 5 минут, после чего реакция останавливается добавлением 20 мл концентрированной HCl. Концентрация образовавшегося акриламида определяется газовой хроматографией или фотометрией.

Нитрилгидратазная активность приводится в нижеследующих единицах:

• удельная активность - в Молях акриламида/мин х мг сухой биомассы = [Ед/мг]

• общая активность - в Молях акриламида/мин х мл культурального бульона = [Ед/мл]

Изобретение иллюстрируется посредством нижеследующих примеров:

Пример 1

Встряхиваемые колбы (250 мл), содержащие 50 мл культуральной среды "SI" (состав в г/л: 7,9 Na₂HPO₄x12H₂O; 1,8 KH₂PO₄; 0,02 CoCl₂x6H₂O; 1,0 MgSO₄x7H₂O; 2,0 кукурузного экстракта; рН 7,2±0.2) и содержащее глюкозу (50 г/л) и мочевину (от 4 до 20 г/л), инокулировались 1 мл инокулята Rhodococcus rhodochrous М33. Инокулят инкубировался в течение 24 часов в той же среде. Культивирование осуществлялось во встряхиваемом инкубаторе при 180 об/мин (вращательное движение) при 30°С в течение 96 часов. Определялись выход биомассы и нитрилгидратазная активность клеток. Результаты представлены в Таблице 1.

Пример 2

Встряхиваемые колбы (250 мл), содержащие 50 мл культуральной среды "S1" (состав в г/л: 7,9 Na₂HPO₄x 12H₂O; 1,8 KH₂PO₄; 0,02 CoCl₂x6H₂O; 1,0 MgSO₄x7H₂O; 16,0 мочевины; рН 7,2±0,2) и содержащее глюкозу (50 г/л) и кукурузный экстракт (от 0 до 10 г/л), инокулировались 1 мл инокулята Rhodococcus rhodochrous М33. Инокулят инкубировался в течение 24 часов в той же среде. Культивирование осуществлялось во встряхиваемом инкубаторе при 180 об/мин (вращательное движение) при 30°С в течение 96 часов. Определялись выход биомассы и нитрилгидратазная активность клеток. Результаты представлены в Таблице 2.

Из вышеупомянутых данных очевидно, что добавление кукурузного экстракта приводит к повышению удельной и общей нитрилгидратазной активностей. Оптимальная концентрация кукурузного экстракта была 4 г/л.

Пример 3

Встряхиваемые колбы (250 мл), содержащие 50 мл культуральной среды "SI" (состав в г/л: 7,9 Na₂HPO₄x12H₂O; 1,8 KH₂PO₄; 0,02 CoCl₂x6H₂O; 1,0 MgSO₄x7H₂O; 16,0 мочевины; 4,0 г кукурузного экстракта; рН 7,2±0,2), содержали глюкозу в концентрации от 20 до 90 г/л. Инокуляция и инкубация колб осуществлялась как в Примере 1. Измеренные выход биомассы и нитрилгидратазная активность клеток суммированы в Таблице 3.

Как можно видеть из таблицы 3, выход клеточной массы и общая нитрилгидратазная активность повышается пропорционально повышению концентрации глюкозы в культуральной среде. Это происходит в результате того, что все компоненты культуральной среды присутствуют в неограничивающих концентрациях.

Пример 4

Трехлитровый лабораторный ферментер, содержащий 1,5 л питательной среды "SI" (состав в г/л: 7,9 Na₂HPO₄x12H₂O; 1,8 KH₂PO₄; 0,01 CoCl₂x6H₂O; 1,0 MgSO₄x7H₂O; 16,0 мочевины; 4,0 г кукурузного экстракта; рН 7,2±0,2) и содержащий 5 г/л глюкозы, инокулировался 100 мл инокулята Rhodococcus rhodochrous М33. Инокулят инкубировался в течение 24 часов в той же среде.

Условия культивирования:

• температура 30°С

• скорость перемешивания 560 об/мин

• скорость аэрации 1,5 объем/объем/мин.

После 18 часов ферментации дозированно добавлялись 1,5 г/л глюкозы каждые 2 часа до тех пор, пока конечная концентрация не достигла 40 г/л. В результате показано, что полученные 16,4 г/л сухой биомассы проявляют удельную активность 215 Ед/мг. Общая активность была 3526 Ед/мл.

Пример 5

Трехлитровый лабораторный ферментер, содержащий 1,5 л питательной среды "SI" (состав в г/л: 7,9 Na₂HPO₄x12H₂O; 1,8 KH₂PO₄; 0,01 CoCl₂x6H₂O; 1,0 MgSO₄x7H₂O; 16,0 мочевины; 4,0 г кукурузного экстракта; рН 7,2±0,2) и содержащий 20 г/л глюкозы, инокулировался как в Примере 4. Условия культивирования также были как в Примере 4. После ферментации в течение периода времени от 24 до 36 часов и расходования всей глюкозы дозированно добавлялись 6 г/л мочевины, 3 г/л ацетата натрия и 0,03 г/л CoCl₂x6H₂O. После повышения рН питательной среды дозированно добавлялась уксусная кислота с концентрацией 30% (питательная добавка). При этих условиях было найдено, что 19,6 г/л сухой биомассы, произведенные за 72 часа, проявляют удельную активность 315 Ед/мг. Общая активность была 6174 Ед/мл.

Пример 6

Пятнадцатилитровый лабораторный ферментер, содержащий 7,0 л питательной среды "SI" (состав в г/л: 7,9 Na₂HPO₄x12H₂O; 1,8 KH₂PO₄; 1,0 MgSO₄x7H₂O; 4,0 мочевины; 4,0 г кукурузного экстракта; рН 7,2±0,2) и содержащий 20 г/л глюкозы, инокулировался 4% (об./об.) инокулята Rhodococcus rhodochrous М33. Инокулят инкубировался в течение 24 часов как встряхиваемая культура в среде такого же состава.

Условия культивирования:

• температура от 29 до 30°С

• скорость аэрации 0,5 объем/объем/мин

• внешнее давление 0,3 бар

• относительное парциальное давление О₂ ≥50% контролируется при скорости перемешивания)

• скорость перемешивания от 300 до 600 об/мин.

После ферментации в течение 12 часов (начало экспотенциальной фазы роста) дозированно добавлялся 0,01 г/л CoCl₂x6H₂O. После ферментации в течение периода времени от 21 до 23 часов и потребления всей глюкозы были дозированно добавлены 6 г/л мочевины, 3 г/л ацетата натрия и 0,03 г/л CoCl₂x6H₂O. После того как рН культурального бульона возрос до 7,9, новый источник углерода в виде уксусной кислоты (30%) был дозированно добавлен, что сопровождалось установлением значения рН питающей среды 7,9. При этих условиях была возможность получить в течение только 66,5 ч 19,9 г/л сухой биомассы, проявляющей удельную активность 294 Ед/мг. Общая активность была 5851 Ед/мл.

Благодаря тому что CoCl₂x6H₂O не добавлялся к питательной среде до начала экспотенциальной фазы роста, стало возможным уменьшить время ферментации в сравнении с Примером 5.

Пример 7

Промышленный ферментер, имеющий емкость 15 м³ и содержащий 10 м³ культуральной среды "SI" (состав в г/л: 3,48 H₃PO₄; 0,74 КОН; NaOH для доведения рН до 6,9; 0,01 CoCl₂x6H₂O; 1,0 MgSO₄x7H₂O; 4,0 мочевины; 4,0 г кукурузного экстракта; рН 7,2±0,2), содержащий 20 г/л глюкозы инокулировался 5% (об./об.) инокулята Rhodococcus rhodochrous М33. Инкубация инокулята была предварительно завершена за 24 часа в пре-ферментере, опять же с использованием среды "SI".

Условия культивирования:

• температура от 28 до 30°С

• скорость перемешивания от 160 до 165 об/мин

• скорость аэрации 0,5 объем/объем/мин.

После периода времени от 24 до 36 часов и потребления всей глюкозы были дозированно добавлены к питательной среде 6 г/л мочевины, 3 г/л ацетата натрия и 0,03 г/л CoCl₂x6H₂O. Дозирование уксусной кислоты было аналогичным тому, как это описано в Примере 6. После 72 ч ферментации было найдено, что произведено 18,8 г/л сухой биомассы, проявляющей удельную активность 290 Ед/мг. Общая активность была 5452 Ед/мл.