Результат интеллектуальной деятельности: Способ прогнозирования рисков развития осложнений пневмонии

Предлагаемое изобретение относится к области медицины, а именно к пульмонологии, и может быть использовано в клинической лабораторной практике для определения активности системы нейтрофилов при пневмонии для прогнозирования степени тяжести развития рисков при пневмонии и улучшения тактики ведения больного.

Внебольничная пневмония (ВП) относится к важнейшим респираторным заболеваниям вследствие высокой распространенности в общей популяции, клинической гетерогенности и вариабельности тяжести течения. Как в США, так и в странах Европы ВП является наиболее частой причиной летальных исходов, обусловленных инфекционными причинами. Показано, что пневмония встречается у 5-10 человек на 1 тыс. взрослого населения (Woodhead M. Pneumonia. In: Palange P., Simonds A.K., eds ERS Handbook: Respiratory medicine. Sheffield: 2013. 199-202). Если эти данные экстраполировать на Россию, то можно утверждать, что пневмонию ежегодно переносят более 1,5 млн человек взрослого населения страны. В лечебных стационарах РФ летальность от пневмонии составила около 40 тыс. случаев. Острота проблемы в здравоохранении России подчеркивается и данными медицинской статистики: при суммировании и сопоставлении показателей и результатов международных эпидемиологических исследований установлено, что диагноз пневмония своевременно не был установлен у 1 миллиона человек, а смертность от тяжелых форм пневмонии достигла 10% (Чучалин А.Г. Пневмония: актуальная проблема медицины XXI века. Пульмонология. 2015; №2: 133-142). В связи с этим актуальность проблемы количественной оценки тяжести состояния больных ВП возрастает. В течение последних лет в медицинской литературе активно обсуждается вопрос о необходимости объективной оценки тяжести состояния и прогноза. Всеми авторами признается, что своевременная, быстрая и объективная оценка тяжести состояния больного с пневмонией - необходимый инструмент для принятия решения о тактике ведения больного, оптимальном месте проведения терапии. При внебольничной пневмонии крайне важно оценить тяжесть состояния больных на ранних сроках госпитализации с целью выделения пациентов, требующих проведения неотложной интенсивной терапии.

Аналоги данного способа по определению степени тяжести и риска развития осложнений при внебольничной пневмонии (ВП) основываются на использовании разнообразных критериев и шкал, из которых наиболее распространенными в настоящее время являются индекс тяжести пневмонии (PSI) или шкала PORT (Pneumonia Outcomes Research Team), а также шкалы CURB-65, APACHE. Так к примеру, PSI / шкала PORT содержит 20 клинических, лабораторных и рентгенологических признаков ВП. Класс риска определяют путем стратификации больного в группе тяжести. Для этого используют сложную 2-ступенчатую систему подсчета баллов, основанную на анализе значимых с точки зрения прогноза демографических, клинико-лабораторных и рентгенологических признаков. Однако имеются ограничения шкалы, а именно: 1) трудоемкость (требуется использование ряда биохимических параметров, которые рутинно определяют не во всех лечебно-профилактических учреждениях), 2) отсутствие учета социальных факторов и ряда значимых сопутствующих заболеваний, например наличие сочетанной патологии и иммунных нарушений.

CURB-65 - это наиболее простой подход оценки риска неблагоприятного исхода при ВП, при использовании которого выполняют анализ клинических параметров пациента. Эта шкала так же имеет ряд ограничений: не учитывают важные показатели, такие как уровень насыщения кислородом артериальной крови, декомпенсации сопутствующей патологии, невысокая информативность при определении прогноза у пациентов пожилого возраста.

За ближайший аналог принят способ (Procalcitonin, C-reactive protein and APACHE II score for risk evaluation in patients with severe pneumonia / R. Brunkhorst [et al.] // Clinical Microbiology and Infection. - 2002. - Vol. 8 (2). - P. 93-100), который предполагает использовать шкалу APACHE II, включающую: оценку физиологических показателей (температура тела, артериальное давление, частота дыхательных движений, количество лейкоцитов в общем анализе крови, лейкоцитарную формулу, уровень гематокрита, уровень креатинина в биохимическом анализе крови, рН артериальной крови, парциальное напряжение кислорода в артериальной крови и т.д.), а также оценку возраста и наличие хронических заболеваний у пациента. Шкалу составляют к концу первых суток госпитализации, во внимание принимают худшие во время наблюдения показатели физиологических параметров.

Недостатками шкалы APACHE II являются значительная затрата времени (до 24 часов и более), что недопустимо в отношении пациентов с ВП. Кроме того, все шкалы предусматривают многостадийность и связанный с этим "каскад" ошибок, нарастающий по мере увеличения числа исследуемых показателей, потребность в сравнительно дорогостоящем оборудовании, значительные затраты времени, а, как следствие - задержку начала терапии при подсчете лейкоцитарной формулы из расчета 400 клеток на один мазок периферической крови, неоднозначность получаемых результатов.

Задачами способа являются: максимально упростить и объективизировать способ риска развития и уровня осложнений при пневмонии, сделав ее доступной для любой лаборатории и клиники, сохранив при этом полную репрезентативность получаемых результатов.

Сущность изобретения заключается в том, что измеряют в мазке периферической крови в поляризационном поле площадь анизотропии окрашенных толуидиновым синим (рН-5,0) в ядре клеток нейтрофильных гранулоцитов и по проценту площади анизотропии в локализующейся в ядре определяют биологическую активность нейтрофильных гранулоцитов. При этом значении от 2,25 и более усл. ед. определяют низкий риск развития возможных осложнений, при уровне анизотропии ядер лейкоцитов, равным 2,24-1,50 усл. ед., определяют средний риск; при уровне анизотропии ядер лейкоцитов 1,40-0,75 усл. ед. определяют высокий риск осложнений при пневмонии, а при значении анизотропии ядер лейкоцитов 0,74-0 усл. ед. - крайне высокий риск развития осложнений в течение пневмонии. Технический результат способа позволяет значительно сократить (до нескольких часов) время прогнозирования рисков развития осложнений при пневмонии, что очень важно при условии назначения терапии при пневмонии. Так же данный способ выгодно отличается от аналогов и ближайшего аналога отсутствием учета нескольких физиологических показателей, необходимых для оценки и прогноза пневмонии. А так же способ менее трудоемкий, не требующий дорогостоящего оборудования, специальной дополнительной квалификации медицинского персонала.

Способ апробирован в поликлинике и условиях коечного стационара на 80 больных и осуществляется следующим образом. Мазки клеток периферической крови подсушивают на воздухе, фиксируют смесью этанол/ацетон в соотношении 1:1, подвергают гидролизу в 5 N HCL при 20°С и обработке солянокислым гидроксиламином, приготовленным по Р. Лилли (Патологическая техника и практическая гистохимия, - М., 1969), при температуре 37°С в течение 3 часов. Обработанные таким образом мазки окрашивают 0,05% раствором толуидинового синего при рН-5,0, приготовленного на 0,001 М цитратном буфере. Время окраски составляет 20 минут. Окрашенные препараты коротко отмывают нитратным буфером, высушивают на воздухе и исследуют под микроскопом "МП-8" при "скрещенном" анализаторе и поляризаторе. Полученную в поляризационном поле анизотропию фотографируют в строго стандартизированных условиях на пленку типа РФ-3 и ФН-100, на полученных фотографиях измеряют площадь, занятую анизотропным материалом в ядрах нейтрофильных гранулоцитов, используя для этого морфометрический метод равноудаленных точек (Ташке К. "Введение в количественную цитогистологическую морфологию". Из-во Академии Социалистической республики Румыния. - 1976, с. 207). Для снижения процента погрешности учету подвергают как зоны микрофотографии, имеющие признаки анизотропии, так и зоны, которые этим эффектом не обладают. Для массовых исследований в клинических условиях используют хорошо известный полуколичественный метод Астальди и Верга (Astaldi G., Verga L. The glycogen content of the cells of lymphatic leukaemia // Acta Haemat., 1957. - Vol. 17. - P. 911-928), адаптированного для изучения ядер. Все ядра разделяют по степени анизотропии на 4 группы, каждой из которых присваивают определенную величину анизотропии, от 0 - полное ее отсутствие до 3 - анизотропно все ядро. В дальнейшем расчет анизотропии проводят по известной формуле:

где СЦК - средний цитохимический коэффициент или величина анизотропии;

а, b, с, d - количество клеток с разной величиной анизотропии;

0, 1, 2, 3 - условная степень анизотропии, соответствующая площади, занимаемой анизотропным материалом.

При этом:

0 - анизотропный материал занимает от 0 до 24% площади ядра сегментоядерного нейтрофильного гранулоцита.

1 - анизотропный материал занимает от 25 до 50% площади ядра сегментоядерного нейтрофильного гранулоцита.

2 - анизотропный материал занимает от 51 до 75% площади ядра сегментоядерного нейтрофильного гранулоцита.

3 - анизотропный материал занимает от 76 до 100% площади ядра сегментоядерного нейтрофильного гранулоцита.

Величины СЦК могут приобретать значения от 0 (полное отсутствие анизотропии) до 3 (максимальная анизотропия). Величина биологической активности сегментоядерных, нейтрофильных гранулоцитов (БАСНГ) обратно пропорциональна величине анизотропии, БАСНГ отражает показатель активности нейтрофилов (ПАН), отсюда - ПАН=3-СЦК.

При ПАН от 3 до 2,25 усл. ед. (площадь, занимаемая анизотропным материалом, 0-24%) определяют очень высокую биологическую активность системы нейтрофильных гранулоцитов и соответственно очень высокие резервные возможности организма.

При ПАН от 2,24 до 1,5 усл. ед. (площадь, занимаемая анизотропным материалом. 25-50%) определяют высокую биологическую активность системы нейтрофильных гранулоцитов и соответственно высокие резервные возможности организма.

При ПАН 1,4 от 0,75 усл. ед. (площадь, занимаемая анизотропным материалом, 51-75%) определяют умеренную биологическую активность системы нейтрофильных гранулоцитов и соответственно умеренные резервные возможности организма.

При ПАН от 0,74 до 0 усл. ед. (площадь, занимаемая анизотропным материалом, 76-100%) определяют низкую биологическую активность системы нейтрофильных гранулоцитов и соответственно низкие резервные возможности организма.

Пример №1. У больного внебольничной пневмонией Г., из подушечки четвертого пальца левой руки, по общепринятой методике, была получена капля периферической крови, из которой на обезжиренном предметном стекле был приготовлен мазок крови. Данный мазок крови был подсушен на воздухе при комнатной температуре, а затем подвергнут фиксации смесью этанол/ацетон в соотношении 1:1. Время фиксации составило 15 минут. После фиксации мазок крови был подвергнут обработке 5N HCl при 20°С для гидролиза ядерной ДНК нейтрофильных гранулоцитов. Время гидролиза составляло 40 минут. После обработки соляной кислотой мазок крови был обработан солянокислым гидроксиламином, приготовленным по Р. Лилли (1969) для блокады открывшихся после обработки соляной кислотой альдегидных групп ДНК ядер нейтрофильных гранулоцитов. Продолжительность данной обработки составила 3 часа при 37°С. Обработанный таким образом мазок крови был окрашен 0,05% раствором толуидинового синего при рН-5,0. После окраски мазок подвергли короткой промывке, а затем высушили. Приготовленный таким образом мазок крови больного Г. исследовали в поляризационном поле на микроскопе МП-8 при "скрещенном" анализаторе и поляризаторе. Во время исследования проводили полуколичественное измерение площади, занимаемой анизотропным материалом в ядрах нейтрофильных гранулоцитов. Было измерено 100 клеток. Средняя площадь, занимаемая анизотропным материалом в ядрах нейтрофильных гранулоцитов, составила 14,5%, что соответствовало СЦК=0,43 и уровню ПАН=2,54 усл. ед. Это свидетельствовало о высоком уровне активности системы нейтрофильных гранулоцитов и высоких резервных возможностях организма в целом. В целом госпитальный этап лечения пациента протекал гладко смены антибактериальной терапии не потребовалось, гнойно-септических осложнений не наблюдалось. Больной выздоровел в течение 2 недель.

Пример №2. У пациента с внебольничной двусторонней полисегментарной пневмонией М. площадь ядра, занимаемая анизотропным материалом, составляла в среднем 64,7%, что соответствовало уровню ПАН 1,16 усл. ед. Это свидетельствовало об умеренном уровне активности системы нейтрофильных гранулоцитов и пониженных резервных возможностях организма в целом. Госпитальный этап лечения протекал удовлетворительно, гнойно-септических заболеваний не наблюдалось, однако срок госпитализации и длительность применения антибактериальных препаратов, а, как следствие, стоимость лечения и реабилитации был значительно (на 29%) больше, чем в примере №1. В результате больной выздоровел к 17 суткам наблюдения.

Пример №3. У пациента с внебольничной пневмонией Ж. площадь, занимаемая анизотропным материалом в ядрах нейтрофильных гранулоцитов, составила в среднем 80%, что соответствовало уровню ПАН 0,45 усл. ед. Это свидетельствовало о низком уровне активности системы нейтрофильных гранулоцитов и пониженных резервных возможностях организма в целом. В ходе дообследования пациента, при посеве мокроты выявлена полирезистентная к антибактериальным препаратам бактериальная флора (P. aeroginosa), что потребовало назначения комбинированной терапии антибактериальными препаратами резерва (меропенем). Реабилитация носила затяжной характер. Для полного клинико-рентгенологического разрешения пневмонии потребовалось более 3-х недель.

Пример №4. У пациента с внебольничной пневмонией В. площадь, занимаемая анизотропным материалом в ядрах нейтрофильных гранулоцитов, составила в среднем 94%, что соответствовало уровню ПАН 0,18 усл. ед. Это свидетельствовало о крайне низком уровне активности системы нейтрофильных гранулоцитов и незначительных резервных возможностях организма в целом. Проводилась антибактериальная терапия в полном объеме согласно стандартам оказания медицинской помощи пациентам с заболеваниями органов дыхания на территории РФ. В дальнейшем при выполнении КТ органов грудной клетки выявлена деструкция легочной ткани и наличие левостороннего плеврита. Стационарный этап лечения протекал в условиях развившейся эмпиемы плевры, потребовавшей перевод пациента в отделение интенсивной терапии, дополнительной санации плевральной полости, выполнения диагностической фибробронхоскопии и прологнации антибактериальной терапии. Реабилитация данного пациента носила затяжной характер. Однако благодаря своевременно принятым мерам больной выздоровел и выписан из стационара в удовлетворительном состоянии более чем через 1 месяц.