ФИКСАТОР ПРОБ ДЛЯ ЦИТОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ

Предлагаемое изобретение относится к области медицины, а именно к цитологии, и может быть использовано при гистологических, онкологических, гематологических, патологоанатомических исследованиях.

В исследовательских и клинических медицинских лабораториях большинство цитологических и иммуноцитохимических исследований требует проведения фиксации биоматериала, для чего применяют фиксаторы, благодаря их использованию становится возможным изучение тонкого строения клеток и длительное хранение изучаемого материала.

Морфология любой клетки крови или костного мозга для цитологических и иммуноцитохимических исследований микропрепаратов зависит, прежде всего, от качества фиксации препарата. Для фиксации мазков крови, костного мозга, цитологических препаратов используют метанол, абсолютный этанол, жидкость Никифорова (смесь равных частей спирта и эфира), метаноловый раствор эозина-метиленового синего по Май-Грюнвальду, метаноловый раствор эозина-метиленового синего типа Лейшмана, фиксатор-краситель Райта (Справочник по клиническим лабораторным методам исследования / Под ред. Е.А. Кост, - 2-е изд. - М.: Медицина, 1975. - 393 с.; Тодоров Й. Клинические лабораторные исследования в педиатрии. Изд. Медицина, София, 1963. - 874 с., Bancroft's Theory and Practice of Histological Techniques: Expert Consult: Online and Print, 2002. - 768 с.). Каждый из перечисленных фиксаторов имеет определенные недостатки: высокую специфичность фиксации, значительную токсичность, пожароопасность, высокую стоимость и низкую доступность. Ближайшим аналогом предлагаемого фиксатора является метанол.

Основными недостатками метанола являются: высокая токсичность, пожароопасность, оборот метанола строго контролируется государством, для его приобретения требуется лицензия, значительные расходы на его хранение, что повышает затраты и снижает потребительскую привлекательность метанола (Типовая отраслевая инструкция о порядке получения, перевозки, хранения, отпуска и применения метанола ИБТВ 2-001-82. Стр. 2-5).

Задачи: создание фиксирующей жидкости (фиксатора), не имеющей в своем составе метанола, этанола и других веществ, оборот которых контролируется государством, не являющейся высокотоксичной, недорогой, не требующей больших затрат на хранение и использование, при этом не уступающей в фиксирующих способностях метанолу.

Фиксатор проб для цитологических исследований, состоящий из смеси, об. %:

ХЧ изопропиловый спирт - 88

ЧДА диметилсульфоксид - 2

ЧДА глицерин – 10.

Техническим результатом изобретения является уменьшение времени фиксации, за счет того, что в состав фиксатора включен диметилсульфоксид - он облегчает поступление изопропанола в клетку и увеличивает скорость фиксации; расширение спектра исследований на фиксированных материалах, уменьшение затрат на покупку реагентов, повышение безопасности при работе с реагентами, повышение доступности компонентов входящих в состав фиксирующей жидкости, высокая сохранность клеток, т.к. у изопропанола имеется большое преимущество - он в сравнении с метанолом и этанолом, в меньшей степени повреждает антигены клетки. Данный эффект потенцируется глицерином, что позволяет расширить спектр проводимых иммуноцитохимических реакций при использовании предлагаемого фиксатора.

Основными компонентами фиксатора являются: изопропиловый спирт, диметилсульфоксид, глицерин.

Изопропиловый спирт обладает свойствами вторичных спиртов жирного ряда. Химическая формула (рациональная) изопропилового спирта: CH₃СН(ОН)СН₃. Это бесцветная жидкость с характерным спиртовым запахом, более резким по сравнению с этанолом (по этому признаку их можно отличить), t - плавления - 89,5°C, t - кипения +82,4°C, плотность 0,7851 г/см³ (при 20°C), t - вспышки 11,7°C.

Диметилсульфоксид (ДМСО) - вязкая бесцветная жидкость с характерным запахом. Химическая формула (рациональная) диметилсульфоксида: (CH₃)₂SО. ДМСО является важным биполярным апротонным растворителем. Благодаря своей сильной растворяющей и проникающей способности ДМСО часто используют как растворитель в химических и медико-биологических исследованиях.

Глицерин - бесцветная, вязкая, очень гигроскопичная жидкость. Химическая формула (рациональная) глицерина: CH₃CH₅(OH)₃. Химические свойства глицерина типичны для многоатомных спиртов. Для приготовления фиксирующей жидкости необходимо развести реагенты: изопропанол, диметилсульфоксид и глицерин. Так как основным фиксирующим свойством обладает изопропанол, то его концентрация в растворе преобладает над другими реагентами и равна 88%. Концентрация диметилсульфоксида равна 2%, а глицерина составляет 10%. В необходимом количестве вначале смешивают изопропанол и диметилсульфоксид, последним добавляют глицерин. Жидкость хранят при комнатной температуре продолжительное время без существенной потери ее свойств.

Для фиксации клеток крови в качестве доказательства использовали кровь белых лабораторных крыс. Взятие крови проводили из кончика хвоста животного. После нанесения крови на предметные стекла создавали мазок крови. Проводили фиксацию подсушенных на воздухе мазков клеток в охлажденном до +4°C растворе фиксатора в течение 30 секунд, проводили отмывку от фиксатора в охлажденном до +4°C 0,9% растворе натрия хлорида в течение 1 минуты, далее 5 секунд в 0,9% растворе натрия хлорида при комнатной температуре и окунали в дистиллированную воду. Готовые мазки могут храниться довольно продолжительное время, от 1 до 3 лет, в зависимости от условий хранения.

После фиксации клеток, для подтверждения качества фиксации проводили окраску мазков крови методом Романовского-Гимзе. Полученные микропрепараты фотографировали с помощью окулярной камеры «Levenhuk 230» (США) на микроскопе Микромед-6 (Россия). Фотографии представлены ниже (см. Приложение).

Способ исследования мазков апробирован на 100 крысах в течение 3 лет. При этом задачи, поставленные в данном изобретении, решены с достоверностью p<0.05. На зафиксированных мазках предлагаемым фиксатором после окраски показано нормальное строение клеток крови крыс. Обнаруживались эритроциты и различные лейкоциты.

Апробация фиксатора проведена на мазках крови, полученных от 10 здоровых добровольцев в течение 1 года. При этом задачи, поставленные в данном изобретении, решены с достоверностью p<0.05.

Для приготовления 100 мл фиксатора взяли 88 мл ХЧ изопропилового спирта, 2 мл ЧДА диметилсульфоксида, 10 мл ЧДА глицерина. Разместили в емкость с притертой пробкой и путем взбалтывания получили готовую смесь - фиксатор для цитологических исследований.

У крысы, белой самки, массой 205 грамм, из кончика хвоста была взята капля крови. Далее шлифованным стеклом наносили небольшое количество крови на предметное стекло и получали, размазывая кровь по стеклу, мазок крови. Подсушивали мазок. Потом окунали в раствор фиксатора, охлажденного до +4°C на 30 секунд, затем проводили отмывку от фиксатора в охлажденном до +4°C 0,9% растворе натрия хлорида в течение 1 минуты, погружали на 5 секунд в 0,9% раствор натрия хлорида при комнатной температуре и споласкивали в дистиллированной воде.

Готовые мазки после подсыхания окрашивали методом Романовского-Гимзе и перед отправкой в архив заключали готовые препараты в полистирол.

Результат приведен на фиг. 1 и фиг. 2 (приложение) - мазки крови при увеличении в 100 раз. При микроскопическом исследовании мазка крови наблюдали эритроциты (1) и различные лейкоциты (2).