Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ N2-МЕТИЛДЕЗОКСИГУАНОЗИНА

Изобретение относится к органической химии, а именно к способам метилирования дезоксигуанозина.

Сравнительно давно установлена тесная связь курения с развитием рака легкого. Однако сложный состав табачного дыма создает трудности в идентификации механизмов, которые запускают процесс канцерогенеза. В составе сигаретного дыма не менее 20 веществ, обладающих канцерогенным действием: полициклические ароматические соединения, нитрозоамины, альдегиды и др. [1,2]. Все они входят в список канцерогенов Международного агенства по изучению рака [3]. Так, например, формальдегид признан не только канцерогеном, но и генотоксичным агентом, способным образовывать аддукты ДНК. Недавние масс-спектрометрические исследования по сравнению уровня аддуктов ДНК формальдегида у курильщиков и некурящих показали, что уровень аддуктов ДНК формальдегида у курильщиков был выше, чем у некурящих, 179±205 фмоль/мкмоль и 15.5±33.8 фмоль/мкмоль дезоксиаденозин соответственно, что указывает на роль формальдегида в индицировании рака [4]. В исследовании Lu et al. [5] было показано, что метаболиты формальдегида образуют ДНК-аддукты, преимущественно связываясь с дезоксигуанозином и образуя нестабильный N2-гидроксиметил-дизоксигуанозин, который в присутствии цианборгидрида превращается в N2-метилдезоксигуанозин. Масс-спектрометрический анализ представляет широкие возможности для изучения данного процесса, однако для достоверной идентификации и квантификации необходимо использование стандартных веществ, с помощью которых можно формировать библиотеки и собственные базы данных.

К сожалению, в связи с низкой стабильностью N2-метилдезоксигуанозина возникает необходимость проведения синтеза непосредственно в лаборатории перед проведеним масс-спектрометрического анализа.

Известны различные способы синтеза N2-метилдезоксигуанозина, где каждый из методов имеет рад достоинств и недостатков. Так, например, известен способ синтеза меченого N2-([С¹³]метил)гуанозина для исследования при помощи ядерно-магнитного резонаса (ЯМР) [6]. Данный синтез включает открытие группы для введения С13-метиламиновой группировки. Для этого авторы статьи используют 29-деокси-6-О-(пентафлюрофенил)инозин и 29-деокси-6-О-[2-(4-нитрофенил)-этил]инозин как прекурсоры N-метилированных нуклеозидов. Также известна другая работа, которая несет в себе аналогичный алгоритм, отличаясь только типом меченого атома – ¹⁵N в эксоцикловой амино-позиции аденина, цитозина, гуанина или 2-аминопиридина олигонукледтидов [7].

Оба способа представляют собой трехстадийный синтез. На первой стадии (фиг. 1) из 3’,5’-бис-О-ацетил-2-дезоксигуанозина получают 2’-дезокси-N2-[2-(4-нитрофенил)этоксикарбомоил-O6-[2-(4-нитрофенил)этил]гуанозин. На фиг. 1 представлена схема получения 2’-дезокси-N2-[2-(4-нитрофенил)этоксикарбомоил-O6-[2-(4-нитрофенил)этил]гуанозина.

Данная стадия включает несколько ступеней: в первую очередь, реакцию субстрата, трифенилфосфина, 2-(4-нитрофенил)этанола в безводном диоксане в течение нескольких минут. Затем добавляется диэтилазодикарбоксилат (DEAD), после чего реакционная смесь перемешивается час при комнатной температуре. На второй ступени производят выпаривание раствора и добавляют к остатку безводный пиридин при 0°С. Далее следует длительная экстракция хлороформом и процедуры очистки продукта. Сообщается, что выход целевого продукта составил 66%.

На второй стадии (фиг. 2) получают 2-флюоропурин-O6-Npe-2'-деоксиинозин фторированием диазо-производного O6-Npe-dG, где Npe–(4-нитрофенил)этил. На фиг. 2 представлена схема получения 2-флюоропурин-O6-Npe-2'-деоксиинозина.

Возможны два альтернативных пути синтеза 2-флюоропурин-O6-Npe-2'-деоксиинозина, первый из которых заключается во введении 2’-дезокси-N2-[2-(4-нитрофенил)этоксикарбомоил-O6-[2-(4-нитрофенил)этил]гуанозина в реакцию с нитритом натрия и тетрафторборатом водорода в смеси воды и ацетона. Второй вариант предполагает использование третбутилнитрила в безводной среде и смеси пиридина с фтороводородной кислотой. Обе процедуры дают умеренные выходы, однако, по словам авторов, вариант с использованием воды давал незначительно более высокий выход целевого продукта: 35% против 20%.

На третьей стадии (фиг. 3) полученный продукт растворяют в 20%-м растворе метиламина, после чего полученный раствор оставляется на ночь при 60°С. На фиг. 3 представлена схема получения N2-метилдезоксигуанозина.

Далее производят упаривание до получения сухого остатка, растворение его в 5% метаноле и – после подготовительных процедур – выделяют продукт с помощью препаративной высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). После выделения соответствующей фракции и ее высушивании досуха выход продукта составил 40%. Данный способ позволяет получить чистый продукт с 40 % выходом. Однако данный метод обладает некоторыми недостатками – большое число промежуточных стадий при получении целевого продукта, а также невысокие выходы на каждой стадии. Также необходимо отметить, что при проведении второй стадии используются весьма токсичные и опасные для здоровья реагенты, как фтороводородная кислота, пиридин, фтороборная кислота.

Известен другой способ синтеза при помощи восстановительного аминирования дезоксигуанозина [8]. Реакция проводится с использованием 37 % раствора формальдегида и восстановителя – цианоборогидрида натрия. Основная суть метода получения целевого продукта сводится к тому, что готовится 1 мл 3.7% раствора формалина в 0.002 М ацетатном буфере, при pH 4.5. После этого в реакционную смесь добавляется дезоксигуанозин и восстановитель, и реакционная смесь перемешивается на протяжении ночи (фиг. 4). На фиг. 4 представлена схема процесса получения N2-метилдезоксигуанозина посредством восстановительного аминирования.

Целевой продукт также выделяется при помощи ВЭЖХ. Выход даного способа синтеза не высок – 15%. Кроме того, авторы данного способа не уточняют последовательности добавления реагентов в реакционную массу и время проведения реакции.

Изобретение представляет собой адаптацию и оптимизацию способа синтеза восстановительного аминирования дезоксигуанозина, так как если не учитывать невысокий выход реакции и образование неидентифицрованных побочных продуктов, то данный подход представляется перспективным и удобным способом получения N2-метилдезоксигуанозина – как стандарт в масс-спектрометрическом анализе. Его привлекательность, прежде всего, заключается в том, что он является «one-pot» синтезом и легко реализуется в условиях аналитической лаборатории.

Технической задачей настоящего изобретения является разработка одностадийного способа синтеза N2-метил-дезиксигаунозина из нетоксичных или низкотоксичных веществ с выходом не менее 25 %. Поставленная задача решается тем, что способ получения N2-метилдезоксигуанозина методом восстановительного аминирования формальдегида дезоксигуанозином отличается тем, что реакция проводится при перемешивании в течение 36 часов и температуре 25^оC в ацетатном буфере, при одновременном введении в реакционную смесь формальдегида, дезоксигуанозина, а также цианоборгидрида натрия в качестве восстановителя, при этом рН реакции поддерживают на уровне 5.74 при следующем соотношении компонентов:

Дезоксигуанозин: 0,24 % масс.

Цианоборгидрид натрия: 0,05 % масс.

37 % раствор формальдегида: 1,36 % масс.

0.2 mM раствор ацетатного буфера: 98,35 % масс.

Использование заявляемых условий позволяет добиться высокого выхода продукта, а также селективности процесса. Во избежание протекания побочной реакции восстановления формальдегида цианоборгидридом натрия, дезоксигуанозин и восстановитель добавлялись в реакционную смесь одновременно. При этом известно [9], что при pH ~6 преимущественно протекает восстановление иминов. При восстановительном аминировании [9] равновесие на стадии образовании имина сильно смещено влево. Таким образом, для улучшения выхода продукта необходимо было добиться смещения равновесия в сторону образования продуктов реакции, что и было сделано при использовании избытка формальдегида.

ПРИМЕР 1

Реакция проводилась с использованием 37 % раствора формальдегида и восстановителя – цианоборогидрида натрия. К 2 мл 0.2 mM раствора ацетатного буфера (pH 5.74) добавляется 25 мкл 37 % раствора формальдегида. После этого в реакционную смесь одновременно добавляется 4.5 мг дезоксигуанозиа и 1 мг цианоборгидрида натрия, затем реакционная смесь перемешивается при 25^оC на протяжении 36 часов.

Целевой продукт выделяется при помощи полупрепаративного ВЭЖХ при следующих условиях:

Колонка: Kromasil 100 C-18 5µm 250×20 mm MZ Analysintechnik.

Скорость потока: 3 мл/мин.

Элюирование: градиентное А - вода, В – ацетонитрил, при начальном соотношении элюентов 100% А - 0% В.

Программа элюирования: 0 - 22 минуты увеличение доли элюента В от 0 до 30%, к 25 минуте возвращение к 100% элюента А, далее уравновешивание колонки в течение 7 минут 100% элюентом А.

Выход целевого продукта составил 26 %. Идентификацию проводили с помощью масс-спектрометрического анализа в режиме положительной электрораспылительной ионизации (+ЭРИ). Масс-спектр N2-метилдезоксигуанозина представлен на фиг. 5, квантификацию проводили из данных, полученных методом ВЭЖХ и масс-спектрометрии, нормализацией.

Список использованных источников

1. Hoffmann D., Hoffmann I. The changing cigarette, 1950-1995. J Toxicol Environ Health 1997;50:307-64.

2. Hoffmann D., Hecht S.S. Advances in tobacco carcinogenesis. In: Cooper CS, Grover PL, editors. Handbook of experimental pharmacology. Vol 94/I. Heidelberg (Germany): Springer-Verlag; 1990, p. 63-102.

3. IACR, 2002.

4. M. Wang, G. Cheng, S. Balbo, S.G. Carmella, P.W. Villalta, S.S. Hecht. Cancer Res., 69 (2009), pp. 7170–7174.

5. James A. Swenberg, Benjamin C. Moeller, Kun Lu, Julia E. Rager, Rebecca Fry and Thomas B. Starr. Formaldehyde Carcinogenicity Research: 30 Years and Counting for Mode of Action, Epidemiology and Cancer Risk Assessment. Toxicol Pathol. 2013 February ; 41(2): 181–189.

6. M. Hofmann, M. Acedo, P. Fagan, D. Wemmer, R. E. and A. R. Díaz. Synthesis of oligodeoxynucleotides containing 6-N-([13C]methyl)adenine and 2-N-([13C]methyl)guanine. J. Chem. Soc., Perkin Trans., 1, 1997.

7. M. Acedo, C. Fabrega, A. Aviho, M. Goodman, P. Fagan, D. Wemmer and R. Eritja. A simple method for N-15 labelling of exocyclic amino groups in synthetic oligodeoxynucleotides. Nucleic Acids Res., 1994, 22, 2982.

8. M. Yasui, S. Matsui, M. Ihara, Y.R.S. Laxmi, S. Shibutani and T. Matsuda. Translesional synthesis on a DNA template containing N2-methyl-deoxyguanosine catalised by the Klenow fragment of Escherichia coli DNA polymerize I. Nucleic Acids Res., 2001, Vol. 29, No. 9.

9. R.F. Borch, M.D. Bernstein and H.D. Durst. The Cyanohydridoborate Anion as a Selective Reducing Agent. J. Am. Chem. Soc., 93, 2897 (1971).