Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ КРИОПРОТЕКЦИИ СВОБОДНОПЛАВАЮЩИХ СРЕЗОВ МОЗГА ДЛЯ ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКОГО ИССЛЕДОВАНИЯ

Изобретение относится к медицине и биологии, а конкретно к способам заключения и хранения гистологических препаратов. Может быть использовано в нейробиологии для длительного хранения срезов мозга при низкой температуре и последующего иммуногистохимического исследования.

Существуют различные способы криопротекции срезов мозга. Общим для них является помещение срезов мозга в раствор, содержащий компоненты, предотвращающие замерзание раствора и ткани при пониженной температуре [1].

Наиболее близким (прототипом) является метод криопротекции, предложенный R. E. Watson с соавторами [2], который состоит в помещении свободноплавающих срезов мозга в раствор, содержащий 4 различных компонента: фосфатно-солевой буфер (содержащий соли NaCl, Na₂HPO₄ и NaH₂PO₄), сахарозу, поливинилпирролидон и этиленгликоль.

Задачей изобретения является создание более экономичного способа криопротекции срезов мозга и менее трудоемкого процесса его приготовления за счёт уменьшения числа компонентов криопротектирующего раствора.

Поставленная задача решается использованием в качестве криопротектора раствора, содержащего всего два компонента: фосфатно-солевой буфер (содержащий соли NaCl, Na₂HPO₄ и NaH₂PO₄) и глицерин в объемном соотношении 50:50.

Способ состоит в помещении предварительно зафиксированных в 4% формальдегиде срезов мозга в 50% раствор глицерина в фосфатно-солевом буфере, выдерживании в течение часа при комнатной температуре и последующем помещении раствора вместе со срезами на хранение при температуре ниже -20°С.

Принципиально новым в предлагаемом изобретении является то, что раствор для криопротекции срезов мозга содержит только два компонента: фосфатно-солевой буфер и нейтральный для гистохимических препаратов глицерин. Использование раствора глицерина на основе фосфатно-солевого буфера в качестве средства криопротекции срезов мозга не описано в доступной литературе. Совокупность признаков явным образом не вытекает для специалиста из уровня техники.

Предложенный метод криопротекции срезов мозга можно использовать в иммуногистохимических исследованиях нервной ткани мозга.

Пример

Для хранения срезов мозга 500 мл раствора, содержащего 86 г NaCl, 25 г Na₂HPO₄x12H₂O и 4,7 г NaH₂PO₄x2H₂O, смешали с 500 мл глицерина. Эксперимент проводился на 10 образцах мозга мыши, зафиксированных в 4% формальдегиде. Из каждого образца было получено по 15 коронарных двадцатимикронных (20 мкм) срезов обонятельной луковицы, которые были помещены в фосфатно-солевой буфер. Срезы от первых 5 образцов были сразу окрашены иммуногистохимически на белок даблкортин (DCX) – широко использующийся в нейробиологии маркер нейрогенеза.

Срезы от других 5 образцов были переведены в криопротектирующий раствор глицерина на основе фосфатно-солевого буфера и через час помещены в этом растворе на хранение при температуре ниже -20°С. После 4 месяцев хранения эти срезы были вновь переведены в фосфатно-солевой буфер и затем окрашены иммуногистохимически на белок даблкортин (DCX).

Тщательная оценка иммуногистохимических препаратов срезов мозга второй серии не позволила обнаружить повреждения, вызванные замораживанием, размораживанием и хранением.

На фиг. 1 представлены результаты иммуногистохимического окрашивания срезов мозга на белок даблкортин (маркер нейрогенеза). Синее: хроматин клеток, помеченный DAPI. Зелёное: белок даблкортин в молодых нейронах, помеченный антителом, связанным с красителем Alexa Flour 488. А – срез мозга, окрашенный до криопротекции и хранения. Б – срез мозга, окрашенный после криопротекции и хранения.

Статистический анализ результатов окрашивания на даблкортин (фиг. 2) показал отсутствие значимых различий между двумя сериями (P<0.05). Следовательно, замораживание, размораживание и хранение не привели к значимому разрушению или денатурации белка в срезах мозга.

Это говорит о том, что хранение срезов мозга в растворе 50% раствора глицерина на основе фосфатно-солевого буфера NaCl, Na₂HPO₄ и NaH₂PO₄ достаточно для криопротекции срезов мозга.

Таким образом, предложен более экономичный и менее трудоемкий способ криопротекции свободноплавающих срезов мозга, предназначенных для хранения при низкой температуре и последующего иммуногистохимического исследования.

Литература

1. Hoffman, G.E., Le, W.W., 2004. Just cool it! Cryoprotectant anti-freeze in immunocytochemistry and in situ hybridization. Peptides 25, 425-431.

2. Watson RE, Wiegand SJ, Clough RW, Hoffman GE. Use of cryoprotectant to maintain longterm peptide immunoreactivity and tissue morphology. J Peptides 1986; 7:155–9.