Штамм Bacillus pumilus и способ получения антибиотика амикумацина А с его применением

Настоящее изобретение относится к штамму - продуценту антибиотика амикумацина А и способу получения амикумацина А путем биосинтеза на основе использования этого штамма.

Предшествующий уровень техники

Антибиотик амикумацин А относится к гетероциклическим соединениям класса оксикумаринов (фиг. 1). Впервые он был описан в 1981 году в качестве биологически активного вещества природного происхождения, обладающего не только антибактериальной, но и противовоспалительной активностью, а также как средство лечения язвы желудка и снятия отеков (Itoh J. и др., 1981). Позднее было показано, что лечение язвы желудка связано с антибиотическим действием амикумацина А в отношении Helicobacter pilory - агента, вызывающего язву желудка (Pinchuk I.V. и др., 2001). В последние годы по мере распространения болезнетворных бактерий, устойчивых к антибиотикам, все актуальнее становится изыскание антибиотиков, эффективных в отношении таких бактерий, в частности широко распространенных штаммов метициллин-резистентного золотистого стафилококка (MRSA). В 2012 году было показано, что амикумацин А эффективен в отношении штаммов MRSA (Lama А., 2012). Другими свойствами амикумацина А являются противоопухолевая активность (US 5925671, WO 1996027594) и противовирусная активность, последняя была продемонстрирована в составе смесей лекарственных соединений (US 20080161324, US 200100009970). По механизму действия, заключающемуся в специфическом ингибировании функционирования рибосомы (Y.S. Polikanov и др., 2014), амикумацин А отличен от других антибиотиков, используемых в медицине, что подтверждает перспективность его дальнейшего изучения с целью применения в отношении тех форм болезнетворных бактерий, устойчивость к которым была выработана в отношении других антибиотиков.

Амикумацин А и его близкие аналоги образуются бациллами, выделенными из почвы и морских донных отложений, в основном Bacillus pumilus (Itoh J. и др., 1981, 1982; Berrue F. и др., 2009) и В. subtilis (Li Y. и др, 2012; Azumi М., 2008; Pinchuk I.V., 2001), а также неидентифицированными до вида представителями рода Bacillus (СА2214776). Наиболее подробное описание продуцента амикумацина А дано в первой публикации о данном антибиотике (Itoh J. и др., 1981), которая выбрана нами в качестве прототипа. В данной статье указан штамм В. pumilus, образующий смесь антибиотиков, из которых основным компонентом является амикумацин А. Содержание амикумацина А в культуральной жидкости, образованного в результате биосинтеза, составляет 65,6 мг/л.

Описание настоящего изобретения

Характеристика штамма-продуцента амикумацина А.

1. Родовое и видовое название штамма. Штамм был отнесен к виду Bacillus pumilus и депонирован 11 марта 2016 года во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) ФГУП ГосНИИГенетика, находящейся по адресу: Россия, Москва, 117545, 1-ый Дорожный проезд, 1. Заявляемому штамму Bacillus pumilus - продуценту амикумацина А присвоен номер ВКПМ: В-12548.

2. Происхождение штамма (источник выделения, родословная). Исходный штамм выделен из образца выщелоченного чернозема (Краснодарский край, Россия) и депонирован в Коллекции культур микроорганизмов Научно-исследовательского института по изысканию новых антибиотиков имени Г.Ф. Гаузе под номером ИНА 01087. После обнаружения у этого штамма антибиотика амикумацина А для повышения продуктивности проводили ступенчатую селекцию штамма ИНА 01087 без применения мутагенных факторов. Отбор клонов - продуцентов амикумацина А проводили по биологической активности в отношении тест-бактерии Staphylococcus aureus ИНА 00761 (MRSA). В результате четырех ступеней селекции из популяции данного штамма отобран наиболее продуктивный вариант ВКПМ: В-12548, сохраняющий свойства на протяжении трех лет и выдержавший более 20 пересевов. При глубинном культивировании на питательной среде, содержащей глюкозу (1%), пептон (0,5%), триптон (0,3%), NaCl (0,5%), водопроводную воду (97,7%), штамм ВКПМ: В-12548 образует 70-92 мкг/мл амикумацина А против активности 28-42 мкг/мл у исходного штамма ИНА 01087, полученной в равных условиях.

3. Гено- и хемотаксономические характеристики.

Видовая генотаксономическая идентификация проведена по нуклеотидной последовательности гена 16S рРНК. Целевой ген амплифицировали методом полимеразной цепной реакции (ПЦР), секвенировали и сопоставляли полученную последовательность с аналогичными последовательностями типовых штаммов видов рода Bacillus, хранящихся в базах данных GenBank (www.ncbi.nlm.nih.gov) и Ribosomal Database Project (http://www.cme.msu.edu). Были проанализированы последовательность гена 16S рРНК длиной 1503 н.о. у исходного и прошедшего селекцию штаммов. Последовательности гена 16S рРНК длиной 1503 н.о. идентичны у исходного штамма и полученного из него штамма ВКПМ: В-12548. Со 100% достоверностью показано совпадение последовательности гена 16S рРНК исследуемых штаммов с аналогичными генными последовательностями типовых штаммов вида Bacillus pumilus из указанных баз данных, что подтверждает принадлежность заявляемого штамма ВКПМ: В-12548 виду Bacillus pumilus. Последовательность депонирована в GenBank под номером KF717600.

Штамм ВКПМ: В-12548 ауксотроф, растущий на минимальной синтетической среде. Он не требует для роста внесения аминокислот или биотина в отличие от некоторых других бацилл. Утилизирует сахарозу, глюкозу, фруктозу, практически не гидролизует крахмал.

4. Морфологическая, физиологическая (в том числе культуральная) характеристики. На плотной среде, содержащей глюкозу (1%), пептон (0,5%), триптон (0,3%), NaCl (0,5%), агар (2%), вода водопроводная (95,7%) при температуре 37°C штамм ВКПМ: В-12548 формирует круглые бежевые блестящие колонии с ровным краем, экзопигмент отсутствует. Морфологическое исследование показало, что клетки грамположительны, палочковидны, на вторые сутки культивирования на агаровой среде начинается формирование эндоспор, характерных для бактерий рода Bacillus, содержание которых на 11 сутки близко к 100%. Полученный штамм ВКПМ: В-12548 отличается от исходного штамма ИНА 01087 более крупным размером колоний при равной плотности высева на агаризованную среду, и несколько большим размером клеток (1,2×4,2 мкм против 1×3-4 мкм у исходного штамма ИНА 01087).

Штамм ВКПМ: В-12548 хорошо растет в диапазоне температур 28-45°C, формируя крупные колонии за 20 часов; слабый подрост в виде точечных плоских матовых колоний наблюдается при температуре 4-6°C за 3-5 суток; при температуре 60°C роста нет.

Штамм ВКПМ: В-12548 не растет на среде №2 Гаузе при температуре 37°C в анаэробных условиях: при высеве в пробирки в толщу агаровой среды с последующим нанесением сверху слоя вазелинового масла роста нет (срок наблюдения 7 суток).

5. Биотехнологическая характеристика (условия культивирования; название и свойства полезного вещества, продуцируемого штаммом; уровень активности (продуктивности)).

Было установлено, что исходный штамм ИНА 01087 и полученный из него заявляемый штамм ВКПМ: В-12548 образуют антибиотик амикумацин А (фиг. 2-1 и 2-2). Для обеспечения высокого уровня биосинтеза антибиотика амикумацина А штаммом В. pumilus ВКПМ: В-12548 разработана среда следующего состава (%): сахароза - 3-4, глюкоза - 0,1-0,2, дрожжевой экстракт - 0,3-0,5, К₂НРО₄ - 0,1-0,15, NaCl - 0,1-0,15, MgSO₄ - 0,1-0,15, (NH₄)₂SO₄ - 0,1-0,2, FeSO₄×7H₂O - 0,001, MnCl₂×4H₂O - 0,001, CaCO₃ - 0,2-0,5; вода водопроводная добавляется до общего объема 100% (от 94,148% до 95,998%); рН 7,2-7,6 (до стерилизации). Колбы объемом 750 мл со 100 мл среды засевают суспензией спор в количестве 10⁷ спор/колбу. Ферментирование проводят в условиях аэрирования на роторной качалке со скоростью вращения 220 об./мин при 28°C. Длительность ферментации составляет 40-42 часа.

Выделение, очистка и определение содержания амикумацина А в культуральной жидкости. По завершении ферментации фильтрат культуральной жидкости, содержащей антибиотик амикумацин А, наносят на сорбент Amberlite XAD-2 (фирма Aldrich, США) и элюируют смесью н-бутанол-ацетон-вода (1:1:1). Полученные элюаты упаривают в вакууме досуха при 37°C. Дальнейшую очистку амикумацина А проводят на колонке размером 14×180 мм, заполненной силикагелем Kieselgel 60 (Merck, США). Антибиотики элюируют системой растворителей хлороформ-метанол (7:3). Полученные фракции анализируют методом UV-VIS-спектрофотометрии на приборе Thermo Scientific™ NanoDrop 2000 (США) и методом диффузии в агар для выявления антимикробного действия в отношении тест-бактерии S. aureus ИНА 00761 (MRSA). Окончательную очистку и степень чистоты амикумацина А осуществляют с помощью обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ОФ-ВЭЖХ), используя систему Agilent 1200 (фирма Agilent Technologies, США) на колонке Luna C₁₈(2) 100А размером 250×4,60 мм (фирма Phenomenex, США). Детектирование проводят при длине волны 240 нм для выделяемого антибиотика амикумацина А. Элюирование проводят системой 80% водный ацетонитрил с добавлением 0,1% трифторуксусной кислоты (ТФУ) в режиме линейного градиента, повышая содержание ацетонитрила от 15 до 75% при скорости потока 1 мл/мин. Раствор амикумацина А лиофилизируют, взвешивают и хранят в сухом виде в темноте при -70°C. Структуру амикумацина А подтверждают методом ESI MS.

Продуктивность штамма Bacillus pumilus ВКПМ: В-12548. Продуктивность штамма означает содержание амикумацина А в единице объема культуральной жидкости, образовавшегося в результате биосинтеза при культивировании штамма В. pumilus ВКПМ: В-12548. В результате ферментации на разработанной питательной среде продуктивность штамма В. pumilus ВКПМ: В-12548 составляет от 80 до 110 мкг/мл, что на 21,8-67,6% превышает уровень биосинтеза штамма-прототипа.

Определение антимикробного спектра и минимальной подавляющей концентрации (МПК) амикумацина А. В качестве стандарта используют выделенный и очищенный с помощью ВЭЖХ до чистоты более 99% амикумацин А. Из табл. 1 следует, что амикумацин эффективен в отношении грамположительных бактерий, а именно штаммов S. aureus, независимо от наличия или отсутствия метициллинрезистентности, Micrococcus luteus NCTC 8340, Leuconostoc mesenteroides ВКПМ B-4177, но неэффективен в отношении трех тест-культур рода Bacillus, грамотрицательных бактерий и грибов.

Далее настоящее изобретение поясняется примерами, которые служат его иллюстрацией и не ограничивают области охвата настоящего изобретения, изложенной в формуле изобретения.

Пример 1

В 8 колб Эрленмейера объемом 750 мл вносят по 100 мл среды следующего состава (%): сахароза - 4, глюкоза - 0,1, дрожжевой экстракт - 0,5, К₂НРО₄ - 0,1, NaCl - 0,1, MgSO₄ - 0,1, (NH₄)₂SO₄ - 0,2, FeSO₄×7H₂O - 0,001, MnCl₂×4H₂O - 0,001, CaCO₃ - 0,2, вода водопроводная - 94,7, pH 7,3, и стерилизуют 30 мин в автоклаве при давлении в одну избыточную атмосферу. После стерилизации величина рН составляет 7,4.

Со скошенного агара со штаммом ВКПМ: В-12548 в возрасте 14 суток стерильной водой делают смыв спор. С помощью камеры Горяева определяют титр спор, он составляет 1,2×10⁸. В каждую из 8 колб вносят по 0,08 мл споровой суспензии, в результате нагрузка посевного материала составляет 10⁷ спор/колбу или 10⁵ спор/мл среды. Колбы помещают на роторную качалку со скоростью вращения 220 об/мин при температуре 28°C.

Через 42 ч культуральную жидкость из 8 колб объединяют, общий объем культуральной жидкости составляет 0,74 л. Клетки из культуральной жидкости осаждают центрифугированием на центрифуге Rotina 420R (фирма Hettich, Германия), к полученной надосадочной жидкости для сорбции антибиотика амикумацина А добавляют 75 мл сорбента Amberlite XAD-2 и выдерживают 20 ч при комнатной температуре. С сорбента антибиотик элюируют 100 мл смеси н-бутанол-ацетон-вода (1:1:1). Элюат упаривают досуха при 37°C. Сухой остаток вносят в колонку размером 14×180 мм, заполненную силикагелем Kieselgel 60 (фирма Merck, США). Для элюирования амикумацина А в колонку вносят 40 мл системы хлороформ-метанол (7:3). Полученный элюат объемом 40 мл упаривают до 2 мл. В полученном концентрате определяют процентное содержание амикумацина А с помощью ОФ-ВЭЖХ в системе Agilent1200 (фирма Agilent Technologies, США) на колонке Luna C₁₈(2) 100А размером 250x4,60 мм (фирма Phenomenex, США). Детектирование осуществляют при длине волны 240 нм. Элюирование проводят системой 80% водный ацетонитрил с добавлением 0,1% трифторуксусной кислоты (ТФУ) в режиме линейного градиента, повышая содержание ацетонитрила от 15 до 75% при скорости потока 1 мл/мин. Концентрат упаривают, лиофилизируют и взвешивают: вес сухого концентрата составляет 90,6 мг, из которых 80% составляет амикумацин А (фиг. 2-2). Продуктивность штамма Bacillus pumilus ВКПМ: В-12548 определяют по формуле:

П=(К×АмА)/(100%×V)=(90,6×80)/(100×0,74)=97,9 мг/л,

где:

П - продуктивность (мг/л);

К - вес сухого концентрата (мг);

АмА - содержание амикумацина А в концентрате (%);

V - объем культуральной жидкости (л).

Продуктивность штамма Bacillus pumilus ВКПМ: В-12548 в данном примере составляет 97,9 мг/л.

Литература

Патент US5925671 A «Administering to mammals an isocoumarin compound from fermentation of microorganisms like bacillus», дата публикации 20 июля 1999 года.

Патент WO 1996027594 A1 «Antitumour isocoumarins», дата публикации 12 сентября 1996 года.

Патент US 20080161324 A1 «Screening for effective drug combinations; single stranded RNA, flaviviridae and/or hepatic viruses; reducing side effects», дата публикации 3 июля 2008 года.

Патент US 200100009970 A1 «Compositions and methods for treatment of viral diseases», дата публикации 3 июля 2008 года.

Патент СА 2214776 «Antitumour isocoumarins», дата публикации 3 июля 2008 года.

Azumi М., Ogawa К., Fujita Т., Takeshita М., Yoshida R., Furumai Т., Igarashi Y. Bacilosarcins A and B, novel bioactive isocoumarins with unusual heterocyclic cores from the marine-derived bacterium Bacillus subtilis. Tetrahedron. 2008; 64:6420-6425.

Berrue F., Ibrahim A., Boland P., Kerr R.G. Newly isolated marine Bacillus pumilus (SP21): A source of novel lipoamides and other antimicrobial agents. Pure Appl. Chem. 2009; 81:1027-1031.

Hashimoto M., Taguchi Т., Nishida S., Ueno K., Koizumi K., Aburada M., Ichinose K. Isolation of 8_-Phosphate Ester Derivatives of Amicoumacins: Structure-activity Relationship of Hydroxy Amino Acid Moiety. J. Antibiot. 2007. 60(12): 752-756.

Itoh J, Omoto S, , Nishizawa N, Miyado S, Yuda Y, Shibata U, Inouye S. Amicoumacin-A, a new antibiotic with strong antiinflammatory and antiulcer activity. J Antibiot. 1981. 34:611-613.

Itoh J, , Omoto S, Miyado S, Yuda Y, Shibata U, Inouye S. Isolation, Physicochemical properties and biological activities of amicoumacins produced by Bacillus pumilus. Agric Biol Chem. 1982.46: 1255-1259.

Itoh J, Omoto S, Nishizawa N, Kodama Y, Inouye S. Chemical structures of amicoumacins produced by Bacillus pumilus. Agric Biol Chem. 1982. 46: 2659-2665.

Lama A., , Chon Т., Wiersma A.M., Sit C.S., Vederas

J.C., Hecker M., Nakano M.M. Response of Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus to Amicoumacin A. PLoS One, 2012, Volume 7, Issue 3: e34037. Published online Mar 30, 2012. doi: 10.1371/journal.pone.0034037.

Li Y, Xu Y, Liu L, Han Z, Lai P Y, Guo X, Zhang X, Lin W, Qian P Y. Five New Amicoumacins Isolated from a Marine-Derived Bacterium Bacillus subtilisMar Drugs. Feb 2012; 10(2): 319-328. Published online Feb 3, 2012. doi: 10.3390/md10020319.

Pinchuk I.V., Bressollier P., Verneuil В., Fenet В., Sorokulova I.B., , Uidaci M.C. In vitro anti-Helicobacter pylori activity of the probiotic strain Bacillus subtilis 3 is due to secretion of antibiotics. Antimicrob Agents Chemother. 2001; 45(11):3156-3161. doi: 10.1128/AAC.45.11.3156-3161.2001

Polikanov Y.S, Osterman I.A., Szal Т., Tashlitsky V.N., Serebryakova M.V., Kusochek P., Bulkley D., Malanicheva I.A., Efimenko T.A., Efremenkova O.V., Konevega A.L., Shaw K.J., Bogdanov A.A., Rodnina M.V., Dontsova O.A., Mankin A.S., Steitz Т., Sergiev P.V. Amicoumacin A inhibits translation by stabilizing mRNA interaction with the ribosome. Molecular Cell, 2014, V. 56, p. 1-10.