Результат интеллектуальной деятельности: Способ приготовления геномных библиотек ограниченных выборок локусов из деградированной ДНК

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии, в частности к молекулярной биологии, и может быть использовано при проведении генетических исследований, требующих приготовления геномных библиотек ограниченных выборок локусов из деградированной ДНК, независимо от биологической принадлежности изучаемых геномов и независимо от изучаемых классов нуклеотидных последовательностей (например, регуляторных участков генов, повторяющихся элементов генома и т.д.), в том числе ретроспективных генетических исследований в области онкологии.

Из существующего уровня техники известен способ, в котором перечислены реактивы и методы, позволяющие приготовить геномную библиотеку с ограниченной выборкой локусов из бисульфитно-конвертированной геномной ДНК путем гибридизации образца с локус-специфическими зондами (WO 2015014759 А1, 05.02.2015).

Недостатками этого способа являются: длительность протокола; получение большого числа фрагментов, не относящихся к целевым локусам генома, вследствие неспецифической гибридизации фрагментов ДНК со сниженной, вследствие обработки бисульфитом натрия, информативностью нуклеотидных последовательностей.

Целевыми локусами генома (целевыми фрагментами ДНК) являются участки геномной ДНК, свойства которых должны быть изучены в соответствии с целью конкретного исследования.

Другой известный способ заключается в селективной амплификации целевых локусов высокомультиплексной ПЦР с использованием специфических праймеров (WO 2014018080 А1, 30.01.2014).

Недостатками этого способа являются: увеличение доли фрагментов, не относящихся к целевым локусам, с увеличением числа исследуемых локусов по причине образования неспецифических продуктов ПЦР; невозможность выявления химических модификаций нуклеотидов (например, метилирование ДНК).

Также известен способ, заключающийся в обработке образца геномной ДНК эндонуклеазой рестрикции со специфическим сайтом узнавания с последующей адаптер-опосредованной амплификацией полученных фрагментов с праймером со специфическим 3'-удлинителем (RU 2472859 С1, 20.01.2013).

Недостатками этого способа являются: высокие требования к качеству ДНК исследуемых образцов, что делает невозможным использование этого метода для проведения ретроспективных генетических исследований, так как ДНК из доступных образцов ткани, сохраненных в парафиновых блоках для гистологических исследований, сильно фрагментирована.

Известен способ, в котором при работе с ДНК из парафиновых блоков используют предварительный отбор фрагментов ДНК длиннее 500 п. н. (Н. Gu, С. Bock, et al. Genome-scale DNA methylation mapping of clinical samples at single-nucleotide resolution // 2010. Nat Methods, 7(2), 133-136).

Недостатками этого метода являются: наличие в получаемых библиотеках высокой доли фрагментов, не относящихся к исследуемой выборке локусов; низкий количественный выход библиотек. Применимость метода ограничена небольшой частью свежих парафиновых блоков, из которых возможно выделение ДНК фрагментов длиннее 500 п. н.

Также известен способ, в котором был применен метод секвенирования геномных библиотек ограниченных выборок локусов, конвертированных бисульфитом натрия для определения статуса метилирования отдельных CpG-пар в CpG-богатых районах генома человека. Данный способ включает следующие этапы: обработка геномной ДНК рестриктазой MspI, полное тупление концов фрагментов для предотвращения самолигирования фрагментов с получением липкого 3'-А конца, лигирование с адаптерами с липким 3'-Т концом, селекцию фрагментов по длине, обработку фрагментов бисульфитом натрия, амплификацию фрагментов библиотеки (Н. Gu, Z.D. Smith et al. Preparation of reduced representation bisulfite sequencing libraries for genome-scale DNA methylation profiling // 2011. Nat Protocols, 6(4), 468-481).

Недостатком данного способа является примененный для предотвращения самолигирования способ полного тупления концов фрагментов, вследствие чего применение этого метода нецелесообразно для приготовления библиотек из образцов деградированной ДНК. При таком способе тупления короткие фрагменты, исходно присутствующие в образце деградированной ДНК, не могут быть отделены от фрагментов, полученных обработкой эндонуклеазой рестрикции со специфическим сайтом узнавания на этапе селекции фрагментов по длине, и попадают в состав геномной библиотеки, формируя значительную фракцию нецелевых фрагментов (фигура 1).

Задачей изобретения является способ приготовления геномных библиотек ограниченных выборок локусов из деградированной ДНК, позволяющий уменьшить долю фрагментов ДНК, не относящихся к целевым участкам генома, что достигается формированием различия между концами целевых фрагментов и фрагментов, образованных в результате деградации ДНК, с использованием предлагаемых способов модификации концов фрагментов.

Поставленная задача решается способом, заключающимся в том, что проводят гидролиз геномной ДНК эндонуклеазой рестрикции, формирующей фрагменты с 5'-липким концом; частичное тупление концов полимеразной реакцией в присутствии неполного набора дезоксирибонуклеозидтрифосфатов, лигирование фрагментов с адаптерами с липким концом, комплементарным модифицированному липкому концу целевого фрагмента, отбор целевых фрагментов совместно селекцией по длине фрагментов и амплификацией с праймерами, комплементарными адаптерам.

Состав ограниченной выборки локусов определяется нуклеотидным составом сайта узнавания используемой для гидролиза ДНК эндонуклеазы рестрикции и отбором фрагментов по длине в соответствии с дизайном конкретного исследования. Максимальная длина фрагментов ДНК ограниченной выборки локусов определяется техническими возможностями технологии ее последующего анализа, например, максимальной допустимой методом секвенирования длиной фрагмента ДНК. Способ может применяться для изучения геномной ДНК любого вида организмов, при условии, что в ее последовательности встречаются сайты узнавания выбранной эндонуклеазы рестрикции, расположенные на расстоянии, не превышающем максимальной длины фрагментов ДНК, для которой доступен последующий анализ.

Гидролиз геномной ДНК может быть проведен чувствительной к химической модификации нуклеотидов эндонуклеазой рестрикции и ее нечувствительным к модификации изошизомером, формирующими различные липкие концы фрагментов.

При амплификации могут быть использованы праймеры, содержащие участок, комплементарный адаптерам, участок комплементарный остатку сайта узнавания эндонуклеазы рестрикции, участок специфического удлинителя длиной 1-4 нуклеотида на 3' конце праймера, для ограничения выборки локусов библиотеки.

Способ практически осуществляется следующим образом.

Этапы осуществления способа: (1) сайт-специфический гидролиз ДНК; (2) модификация концов фрагментов ДНК частичным туплением; (3) сайт-специфическое лигирование фрагментов ДНК с адаптерами; (4) отбор фрагментов ДНК по длине; (5) амплификация фрагментов ДНК.

Геномную ДНК обрабатывают эндонуклеазой рестрикции с сайтом узнавания, характерным для интересующего исследователя класса последовательностей генома, формирующей фрагменты с 5'-липким концом. В рестрикционную смесь с общим объемом 11,4 мкл добавляют 0,1-10 мкг нативной ДНК, 1,1 мкл соответствующего 10-кратного буфера и 20 единиц выбранной эндонуклеазы рестрикции. Смесь инкубируют при температуре, оптимальной для выбранного фермента в течение 16 часов.

Использование для гидролиза ДНК эндонуклеаз рестрикции, чувствительных к химическим модификациям нуклеотидов, и их нечувствительных к таким модификациям изошизомеров, позволяет выявить эпигенетические химические модификации нуклеотидов, по наличию либо отсутствию фрагментов геномных локусов в составе получаемых библиотек. В этом случае гидролиз ДНК проводят последовательно, сначала - эндонуклеазой рестрикции, чувствительной к химическим модификациям нуклеотидов, затем - ее нечувствительным к таким модификациям изошизомером.

Для модификации концов фрагментов, предотвращающей самолигирование фрагментов и формирующей отличие концов целевых фрагментов, от концов фрагментов, образовавшихся в результате деградации ДНК, продукты гидролиза обрабатывают 2,5 ед.а. мутантного рекомбинанта полимеразы I E. coli, лишенного 3'-5'-экзонуклеазной (корректорной) активности (фрагмент Кленова ехо-) в течение 30 мин при температуре 37°С, после чего необходимо инактивировать фермент инкубаций в течение 10 мин при 75°С. Частичное тупление в присутствии 0,5 мкл неполного набора дезоксирибонуклеотидтрифосфатов (каждого по 1 мМ) позволяет одновременно предотвратить самолигирование фрагментов и сформировать сайт-специфический конец у фрагментов, полученных гидролизом эндонуклеазой рестрикции, отличающийся от конца фрагментов, образовавшихся в результате деградации ДНК. При несовместимости буфера рестриктазы с буфером фрагмента Кленова ехо - необходимо провести очистку фрагментов ДНК, например, с помощью реактива Agencourt AMPure ХР (Beckman Coulter Inc.) по протоколу производителя, либо, в случае возможности, провести коррекцию буфера до необходимого молярного состава.

Сайт-специфическое лигирование фрагментов с адаптерами с липким концом, комплементарным липкому концу фрагмента, полученному при частичном туплении концов фрагментов, образованных эндонуклеазой рестрикции. Дизайн 5'-липкого конца адаптера необходимо проводить с учетом сайта узнавания эндонуклеазы рестрикции, используемой для приготовления библиотеки, и используемого способа тупления концов фрагментов. Пример такого дизайна показан на фигуре 2. К образцу добавляют по 0,8 мкл каждого из адаптеров 15 мкМ; 1,8 мкл dATP 10 мМ; 1,6 мкл лигазы 200000 CEU/мл. Так как буфер лигазы совместим с буфером фрагмента Кленова ехо-, то достаточно коррекции реакционного буфера добавлением 0,6 мкл десятикратного буфера лигазы. Адаптеры могут быть приготовлены отжигом из синтетических олигонуклеотидов, для чего эквимолярную смесь олигонуклеотидов нагревают до 95°С и остужают со скоростью 2°/мин. Если для предотвращения образования конкатемеров адаптеров применяли адаптеры, не кинированные на 5'-конце со стороны лигируемого 5'-липкого конца, то необходимо провести ник-трансляцию с использованием 1 ед.а. полимеразы с добавлением 1 мкл смеси всех дезоксирибонуклеотидов (dNTP) по 2,5 мМ каждого. Могут быть использованы адаптеры, совместимые с различными приборами для высокопроизводительного параллельного секвенирования фрагментов, например, Roche/454 Life Sciences, Applied Biosystems/SOLiD, Ion Torrent/Proton, Illumina, подходящей производительности по протоколу производителя. Настоящее изобретение не предъявляет требований к структуре основной части адаптера. Принципиальным является лишь дизайн 5'-липкого конца адаптера, который необходимо проводить с учетом сайта узнавания эндонуклеазы рестрикции, используемой для приготовления библиотеки, и используемого способа частичного тупления концов фрагментов. Пример такого дизайна показан на фигуре 2.

Отбор фрагментов библиотеки для сокращения выборки локусов можно проводить селекцией фрагментов по длине, например, в приборе PippinPrep (Sage Science, USA) по протоколу производителя, либо электрофорезом фрагментов библиотеки в 2%-агарозном геле, в присутствии в соседних дорожках маркера молекулярной массы фрагментов. Область геля, содержащую фрагменты библиотеки интересующей исследователя длины, вырезают одноразовым скальпелем, после чего проводят выделение фрагментов из геля, например, с помощью набора реагентов для извлечения ДНК из агарозного геля GeneJET Gel Extraction Kit (ThermoFisher scientific). Перед электрофорезом в геле образец очищают от ДНК-связывающих белков и после электрофореза образец очищают от электрофоретического буфера, например, с помощью реактива Agencourt AMPure ХР (Beckman Coulter Inc.) по протоколу производителя.

Амплификацию библиотеки с праймерами, комплементарными адаптерам, проводят в условиях, оптимальных для праймеров, комплементарных используемым адаптерам в зависимости от платформы, выбранной для клонального секвенирования фрагментов библиотеки по протоколу производителя. При использовании праймеров, содержащих участок, комплементарный адаптерам, участок комплементарный остатку сайта узнавания эндонуклеазы рестрикции и участок специфического удлинителя длиной 1-4 нуклеотида на 3' конце праймера возможно сокращение размера получаемой геномной библиотеки. Сочетание сайта узнавания эндонуклеазы рестрикции и специфического удлинителя праймера позволяет проводить отбор геномных локусов для формирования библиотеки фрагментов, принадлежащих различным классам последовательностей генома, например CpG-островкам, семействам повторов и др.

В процессе амплификации могут участвовать только фрагменты, дотированные с обеих сторон адаптерами, что возможно только в том случае, если фрагмент с обеих сторон имел концы, соответствующие концам, образуемым туплением 5'-липкого конца, полученного обработкой геномной ДНК выбранной эндонуклеазой рестрикции. Таким образом, происходит отбор целевых фрагментов библиотеки, так как фрагменты ДНК, образовавшиеся в результате деградации ДНК, с очень малой вероятностью могут иметь подходящие для лигирования адаптеров концы.

На фигуре 1 показаны различия содержания в приготавливаемой геномной библиотеке нецелевых фрагментов при приготовлении геномных библиотек с использованием: высокомолекулярной ДНК; фрагментированной ДНК по ранее предложенным протоколам; фрагментированной ДНК, в соответствии с настоящим изобретением. Толстыми линиями обозначены целевые локусы генома, тонкими линиями - нецелевые локусы генома, включение которых в состав библиотеки нежелательно. Адаптеры обозначены толстыми серыми линиями. Концы фрагментов, образованные в результате гидролиза ДНК эндонуклеазой рестрикции, обозначены уголками. Концы фрагментов, образованные в результате деградации ДНК, свободны. Концы фрагментов, подготовленные к лигированию с адаптерами, обозначены полуокружностями. В случае приготовления геномной библиотеки из фрагментированной ДНК по ранее предложенным протоколам, ПЦР с праймерами, комплементарными адаптерам, приводит к образованию значительного количества нецелевых элементов геномной библиотеки.

На фигуре 2 показан пример сайт-специфического лигирования адаптеров с 5'-липким концов фрагментов, частично тупленным в присутствии неполного набора дезоксирибонуклеотидтрифосфатов: в результате гидролиза геномной ДНК эндонуклеазой рестрикции (в примере рассмотрен сайт узнавания рестриктазы Ah1I) образуются фрагменты с 5'-липким палиндромным концом; в результате частичного тупления концов фрагментов для предотвращения самолигирования фрагментов библиотеки и адаптеров (полимеразной реакцией с неполным набором дезоксирибонуклеотидтрифосфатов, в примере, dCTP и dTTP) образуются фрагменты с 5'-липким непалиндромным концом, соответствующим части сайта узнавания эндонуклеазы рестрикции; проводится лигирование с адаптером, имеющим 5'-липкий конец, комплементарный полученному 5'-липкому концу фрагмента.

Определяющими отличительными признаками предлагаемого способа, по сравнению с аналогами, являются одновременно: высокая селективность в отношении целевых фрагментов, небольшое время приготовления геномных библиотек, возможность работы с образцами деградированной ДНК, например, из парафиновых блоков.