Результат интеллектуальной деятельности: Способ прогнозирования осложненного течения острых респираторных инфекций у детей

Изобретение относится к медицине, в частности к микробиологии и инфекционным болезням, и может быть использовано для прогнозирования осложненного течения ОРИ у детей.

Актуальность проблемы острых респираторных инфекций (ОРИ) остаются важнейшей для здравоохранения ввиду их широкой распространенности среди детей, тяжести течения, особенно у детей первого года жизни, и частоты осложнений. Высокий уровень заболеваемости, обусловленный полиэтиологичностью ОРИ, неустойчивостью и исключительной типоспецифичностью, приводит к частому развитию осложнений и даже к летальному исходу при тяжелом их течении. Частые ОРИ патогенетически предрасполагают к развитию осложнений, наиболее частыми из которых являются отит, синусит, пневмония, обострение хронического бронхита/ХОБЛ или бронхиальной астмы.

В свете современных представлений, патогенетической осложненного течения ОРИ является снижение антиинфекционной резистентности слизистой верхних дыхательных путей на фоне дисбаланса клеточного и гуморального звеньев иммунитета. При этом роль инфекционных агентов, как факторов, способствующих развитию осложнений, достаточно велика. Из многочисленных микроорганизмов, колонизирующих ВПД, лишь некоторые, обладающие повышенной вирулентностью, способны при попадании в нижние отделы дыхательных путей вызывать воспалительные реакции. Этиологическим фактором развития осложненного течения ОРВИ в дыхательных путях у детей являются Streptococcus pneumoniae, Haemophylus influenzae, Streptococcus pyogenes, Staphylococcus aureus, Moraxella catarrhalis, возбудители рода Chlamydia и Mycoplasma, респираторные вирусы (респираторно-синтициальным пара- и аденовирусами, вирусом гриппа) в моно- или в ассоциации с вирусами из рода Herpes (герпесвирусами I и II типов, вирусами Эпштейна-Барр, цитомегаловирусами). Среди факторов, способствующих возникновению частых респираторных заболеваний, выделяют: анатомо-физиологические, особенности респираторного тракта, неблагоприятные анте-и постнатальное развитие ребенка, социальные условия жизни, особенности развития и функционирования иммунной системы.

Таким образом, частота распространения ОРИ среди детей, многообразие провоцирующих факторов и условий, рецидивирующее течение с осложнениями различной природы определяют необходимость разработки способа прогноза характера течения ОРИ у детей.

Анализ патентной и научно-медицинской литературы свидетельствует о существовании ряда способов прогнозирования осложнений ОРВИ у детей.

Способ прогнозирования течения воспалительного процесса в легких А.К. Абрамовской с соавт. (Авт. св. N1478123) основан на определении уровня циркулирующих иммунных комплексов у детей в сыворотке крови и постановке реакции непрямой иммунофлюоресценции с аутоштаммами бактерий, выделенных из мокроты больных. Существенным недостатком данного способа является то, что для выделения бактерий необходим длительный и трудоемкий этап, требующий использования большого числа реактивов, дорогостоящего оборудования, строгого соблюдения правил стерильности при работе.

Известен способ прогнозирования, предложенный Н. Левина с соавт. (Авт. св. N121567), в данном способе прогнозируют затяжное течение пневмонии по определению содержания в клетках крови свободной и связанной воды. Однако, предлагаемые показатели не отражают функциональное состояние иммунной системы, а сам тест требует использования специального оборудования, реактивов и не исключает влияния на исследуемые параметры диеты.

Таким образом, несмотря на высокую степень технологии и чувствительности, приведенные выше способы прогнозирования характера течения ОРИ не лишены существенных недостатков. Они не обладают точностью, отличаются трудоемкостью и длительностью проведения исследования, требуют дорогостоящего оборудования и препаратов.

Наиболее близким к предлагаемому способу является способ прогнозирования риска снижения уровня резистентности организма к острым респираторным заболеваниям у детей в возрасте 3-7 лет по индексу авидности секреторного иммуноглобулина А (Патент РФ №2445915). Суть способа заключается в том, что определяется индекс авидности секреторного иммуноглобулина А в слюне с использованием иммуноферментного аппарата путем деления значения концентрации секреторного иммуноглобулина А в пробе с мочевиной на значение концентрации секреторного иммуноглобулина А в пробе без мочевины и при значении индекса авидности менее 0,089 или более 0,27 прогнозируют риск снижения уровня резистентности организма к острым респираторным заболеваниям.

К недостаткам данного способа следует отнести его неудовлетворительную точность, так как оценка резистентности организма ребенка, основанная только на одном индексе авидности секреторного иммуноглобулина А, не отражает многообразия и тяжести клинико-функциональных особенностей заболевания. Кроме того, недостатком способа является низкая практически прогностическая значимость и громоздкость вычислений.

С целью устранения вышеуказанных недостатков авторы предлагают принципиально новый способ прогнозирования осложненного течения ОРИ у детей путем одновременного определения нескольких показателей, интегрально характеризующих антиинфекционную резистентность слизистой носо-ротоглотки.

Технический результат способа прогнозирования осложненного течения ОРИ у детей заключается в повышении точности и экспрессности.

Этот результат достигается тем, что используя анализ браш-биоптата, авторы предлагают что в браш-биоптате слизистой носо-ротоглотки определять местный неспецифический секреторный иммуноглобулин А, колонизационную активность: индекса инфицирования (ИИ), индекса адгезии, степени деструкции эпителиоцитов, одновременно в надосадочной жидкости определяют уровень внеклеточного фосфатидилхолина и по снижению уровня местного неспецифического иммуноглобулина А в пределах 4-16lg, индекса инфицирования 50-100%, индекса адгезии клеточных эпителиоцитов 100-500 м.кл, деструкции эпителиоцитов - 20-50%, уровня внеклеточного фосфатидилхолина 0,001-0,01 мг/мл прогнозируют осложненное течение острых респираторных инфекций у детей.

Для повышения точности и получения достаточно информативного материала авторы впервые предлагают исследовать браш-биоптат из носо-ротоглотки - экологической ниши, в которой наиболее четко отражены токсические и деструктивные изменения эпителиальной ткани при ОРИ. Авторы обнаружили, что только при однократном отборе возможно получить информативный материал для изучения состояния эпителиоцитов (степени их деструкции), определения колонизационной активности этиологически значимого микроорганизма S.pneumoniae на основе изучения ИИ, ИА, ФА ПМЯЛ и ФИ-показателей, отражающих этиологическую значимость пневмококка в развитии осложненного течения ОРИ у детей. Кроме того, повышение точности предлагаемого способа достигается количественной оценкой перечисленных показателей. Адгезия является определяющим этапом в развитии инфекционного процесса, а ее ингибирование - непременным условием предотвращения дальнейшего развития болезни на раннем ее этапе. Так, в браш-биоптате слизистой носо-ротоглотки определяют местный неспецифический секреторный иммуноглобулин А, колонизационную активность ИИ, ИА, степень деструкции эпителиоцитов и одновременно в надосадочной жидкости уровень фосфатидилхолина и по снижению уровня местного неспецифического SIgA в пределах 4-16lg, уровню индекса инфицирования (ИИ) 50-100%, индекса адгезии (ИА) клеточных эпителиоцитов 100-500 м.кл, деструкции эпителиоцитов 20-50%, л, уровня внеклеточного фосфатидилхолина 0,001-0,01 мг/мл прогнозируют осложненное течение ОРИ у детей.

Авторы впервые обнаружили, что при оценке комплекса показателей прогноза осложненного течения ОРИ у детей необходимо оценка уровня адгезивной активности и уровня фосфатидилхолина (лецитина) мембран клеток «хозяина» (на модели клеток фарингеального эпителия). Авторами разработаны следующие количественные оценки: при адгезивной активности штаммов с АА среднее число клеток пневмококка, адгезированных на одном эпителиоците (из 100-50 сосчитанных эпителиоцитов) ниже 20 уровень лецитина оценивался как низкий, при АА от 20 до 50 как средний и АА более 50 - как высокий. Высокий уровень лецитина коррелировал с высоким уровнем АА у штаммов (r=0,75), обусловивших инвазивные формы пневмококковой инфекции. И наоборот, низкие показатели адгезивной активности штаммов пневмококка, обусловивших бактерионосительство и неинвазивные формы, коррелировали с низким уровнем лецитина (r=0,8).

Авторами обнаружено, что в комплексной оценке для прогноза характера осложненного течения ОРИ у детей необходимым показателем является определение местного неспецифического секреторного иммуноглобулина класса А в браш-биоптате. При легком лечении заболевания ОРИ регистрируется уровень Ig класса А в пределах нормы 4,7±0,2 lg (N-СГТ 5 lg). Тогда как при среднетяжелом - тяжелом течении ОРИ уровень местного неспецифического SIg А в слизистой носо-ротоглотке значительно снижен и составляет 16±0,3 lg.

Важным преимуществом данного исследования является неинвазивный характер отбора материала для исследования, что особенно важно в детской практике. Простота отбора материала щадящими одноразовыми зондами «Юнона» (щеточка с тампоном) позволяет в течение всего периода наблюдения проводить исследования в динамике заболевания.

Сущность метода заключается в том, что у пациента производят отбор браш-биоптата слизистой носо-ротоглотки с помощью одноразового зонда «Юнона» (щеточка с тампоном), наносят одновременно, последовательно на 2 предметных стекла (1 стекло - для микроскопии, 2 - для определения уровня местного неспецифического SIgA). Мазки с нанесенным биоматериалом высушивают на воздухе, фиксируют в ацетоне (t +4°С) (20 мин). После фиксации в ацетоне 1-е предметное стекло заливают раствором краски Романовского-Гимзе в количестве 5-8 капель, выдерживают 30 мин, затем добавляют двойное количество капель нейтральной дистиллированной воды, нагретой до 50-60°С (3-5 мин), далее смывают краску струей нейтральной дистиллированной воды, просушивают фильтровальной бумагой. Проводят микроскопию в световом микроскопе «Scope. А1» (Германия) первого мазка в два этапа: на первом этапе оценивали показатели, характеризующие морфофункциональное состояние слизистой и антиинфекционную резистентность. Устанавливали степень нарушения микробиоценоза слизистой носо-ротоглотки на основе определения индекса адгезии (ИА) - среднее количество микробных клеток на одном участвующем в адгезивном процессе эпителиоците, индекса инфицирования (ИИ) - процент эпителиоцитов с адгезированными клетками микроорганизма, фагоцитарную активность (ФА) - процент активных фагоцитов из общего числа поли- и мононуклеаров (50 или 100), фагоцитарный индекс (ФИ) - среднее число микробных клеток, поглощенных одним активным фагоцитом. На втором этапе первого стекла определяли адгезивную активность S. pneumonia (АА - среднее число клеток пневмококка, адгезированных на одном эпителиоците, из 50-100 сосчитанных эпителиоцитов). Ниже 20 уровень лецитина оценивали как низкий, при АА от 20 до 50 как средний и АА более 50 - как высокий. Второе стекло с нанесенным, высушенным и фиксированным в ацетоне (t°+4°C) биоматериалом из носо-ротоглотки использовалось для определения уровня неспецифического местного секреторного иммуноглобулина А на основе реакции непрямой иммунофлюоресценции (РНИФ) с использованием люминесцирующих моноспецифических диагностических антител против иммуноглобулина А человека (НИИЭМ им. Гамалеи АМН РФ) в модификации метода Быценко Д.С. (2000 г.).

Таким образом, авторами впервые предложен способ прогнозирования осложненного течения ОРИ у детей, который позволяет получить предварительный прогноз уже через 2-2,5 часа после взятия браш-биоптата у больного на анализ, основываясь на результатах микроскопии и реакции непрямой иммунофлюоресценции (РНИФ), причем предложенный способ может быть использован в практике любой бактериологической лаборатории.

Методика успешно апробирована на 113 пациентах и подтверждена клиническими примерами.

Клинический пример №1

Ребенок 1 год 1 мес

Пол М

Диагноз направления: часто болеющий ребенок, обследование

Диагноз уточненный основной: В00.8. Другие формы герпетических инфекций.

Исследуемый материал: цитобактериоскопическое и бактериологическое исследование браш-мазка слизистой носо-ротоглотки на патогенную и условно патогенную микрофлору, изучение морфофункционального состояния слизистой носо-ротоглотки с оценкой уровня местного неспецифического секреторного иммуноглобулина А.

Микроструктура слизистой носо-ротоглотки

Резидентная микрофлора представлена сапрофитными нейссериями и зеленящими стрептококками (Streptococcus viridians) - 10³; Streptococcus pneumonia 10⁵

Декомпенсированная форма микробиоты слизистой носо-ротоглотки III степени.

Морфофункциональное состояние слизистой носо-ротоглотки:

Эпителиоциты: с деструкцией ядра - 20%, нити фибрина 2+.

ИИ (индекс инфицирования, % - процент эпителиоцитов, колонизированных этиологически значимыми микроорганизмами - высоковирулентным штаммом пневмококка - 50%.

ИА (индекс адгезии, среднее количество клеток пневмококка, адгезированных на 1-ом эпителиоците) - 40-50 микробных клеток.

Клеточные элементы крови, регистрируемые на слизистой носо-ротоглотки (среднее количество клеток в поле зрения):

- полиморфозно-ядерные лейкоциты (ПМЯЛ) - 25-30 кл. в поле зрения

- лимфоциты 3-6 кл. в поле зрения

- эозинофилы - 2-3 кл. в поле зрения

- другие - атипичные мононуклеары 2-3 кл в поле зрения, атипичные эпителиоциты («совиный глаз») - 2-3 кл. в поле зрения

Состояние фагоцитоза: ФА - фагоцитарная активность (количество клеток крови в % с фагоцитарной активностью по отношению к клеткам пневмококка) - 25-30%.

ФИ - фагоцитарный индекс (среднее количество поглощенных клеток микроорганизма на 1 фагоцит) - 3-5 м.кл./фагоцит, незавершенный фагоцитоз.

Уровень местного неспецифического иммунитета:

SIgA - уровень местного неспецифического секреторного иммуноглобулина А в реакции непрямой иммунофлюоресценции (в lg) - 1,8 lg.

Уровень фосфатидилхолина (лецитина) >50, высокий уровень лецитина обуславливал инвазивные формы пневмококковой инфекции.

Заключение: С помощью предложенного способа неинвазивным методом выявлено наличие деструктивных процессов в ядрах эпителиоцитов, атипичных мононуклеаров, высокой колонизационной активности Streptococcus pneumonia и фагоцитарной активности по отношению к нему, низкого уровня иммуноглобулина класса А в слизистой носо-ротоглотки (1,8 lg) и уровня фосфатидилхолина (лецитина) >50, декомпенсированной формы нарушений микробиоты слизистой носо-ротоглотки.

Прогнозировалось осложненное течение ОРИ. Ребенок наблюдался в течение года. ОРЗ 7 раз. Прогноз подтвердился.

Клинический пример №2

Ребенок 2 года 6 мес

Пол М

Диагноз направления: часто болеющий ребенок, обследование.

Диагноз уточненный основной: В00.8. Другие формы герпетических инфекций.

Исследуемый материал: цитобактериоскопическое и бактериологическое исследование браш-мазка слизистой носо-ротоглотки на патогенную и условно патогенную микрофлору, изучение морфофункционального состояния слизистой носо-ротоглотки с оценкой уровня местного неспецифического секреторного иммуноглобулина А.

Микроструктура слизистой носо-ротоглотки:

Резидентная микрофлора представлена сапрофитными нейссериями и зеленящими стрептококками (Streptococcus viridians) - 10³; Streptococcus pneumonia 10^5; S. aureus 10⁴

Декомпенсированная форма микробиоты слизистой носо-ротоглотки III степени.

Морфофункциональное состояние слизистой носо-ротоглотки:

Эпителиоциты: с деструкцией цитоплазмы и ядра - 25%, нити фибрина 3+.

ИИ (индекс инфицирования, % - процент эпителиоцитов, колонизированных этиологически значимыми микроорганизмами - S. pneumonia 10^5; S. aureus 10⁴ - 55%.

ИА (индекс адгезии, среднее количество клеток пневмококка, адгезированных на 1-ом эпителиоците) - 35-45 микробных клеток Streptococcus pneumonia и S. aureus на поверхности эпителиоцита.

Клеточные элементы крови, регистрируемые на слизистой носо-ротоглотки (среднее количество клеток в поле зрения):

- полиморфзно-ядерные лейкоциты (ПМЯЛ) - 35-45 кл. в поле зрения

- лимфоциты 4-6 кл. в поле зрения

- эозинофилы - 1-2 кл. в поле зрения

- другие - атипичные мононуклеары 2-3 кл. в поле зрения, атипичные эпителиоциты («совиный глаз»)- 2-3 кл. в поле зрения

Состояние фагоцитоза: ФА - фагоцитарная активность (количество клеток крови в % с фагоцитарной активностью по отношению к клеткам Streptococcus pneumonia и^; S. aureus - 30%.

ФИ - фагоцитарный индекс (среднее количество поглощенных клеток микроорганизма на 1 фагоцит) - 6-5 м.кл./фагоцит, незавершенный фагоцитоз.

Уровень местного неспецифического иммунитета:

SIgA - уровень местного неспецифического секреторного иммуноглобулина А в реакции непрямой иммунофлюоресценции (в lg) - 2,1 lg.

Уровень фосфатидилхолина (лецитина) 45, средний уровень лецитина обусловливал инвазивные формы пневмококковой инфекции.

Заключение: С помощью предложенного способа неинвазивным методом выявлено, наличие деструктивных процессов в ядрах эпителиоцитов, атипичных мононуклеаров, высокой колонизационной активности Streptococcus pneumonia, S. aureus и фагоцитарной активности по отношению к ним, низкого уровня иммуноглобулина класса А в слизистой носо-ротоглотке и уровня фосфатидилхолина (лецитина) - 45, декомпенсированной формы нарушений микробиоты слизистой носо-ротоглотки.

Прогнозировалось осложненное течение ОРИ. Ребенок наблюдался в течение года. ОРЗ 5 раз. Прогноз подтвердился.

Способ прогнозирования осложненного течения ОРИ у детей позволяет получить предварительный прогноз уже через 2-2,5 часа после взятия браш-биоптата у больного на анализ, основываясь на результатах микроскопии и реакции непрямой иммунофлюоресценции (РНИФ). Способ может быть использован в практике любой бактериологической лаборатории.