СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СУММАРНОГО СОДЕРЖАНИЯ СЕРУСОДЕРЖАЩИХ СОЕДИНЕНИЙ В БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБЪЕКТАХ

Изобретение относится к области медицины и описывает способ количественного определения суммарного содержания серусодержащих соединений в сыворотке крови человека методом анодной вольтамперометрии.

Самыми распространенными методами для определения серусодержащих соединений являются хроматографические методы с разными способами детектирования.

Известен способ определения суммарного содержания серусодержащих соединений в сыворотке и плазме крови методом жидкостной хроматографии с электрохимическим детектированием при потенциале +0,75 В относительно хлорид-серебряного электрода, используя в качестве индикаторного угольно-пастовый электрод химически-модифицированный фталцианином кобальта при потенциале, предел обнаружения каждого из соединений находился на уровне 4 пмоль/л с минимальной пробоподготовкой (M.K. Halbert, R.P. Baldwin. Determination of cysteine and glutathione in plasma and blood by liquid chromatography with electrochemical detection using a chemically modified electrode containing cobalt phthalocyanine // Journal of Chromatography B: Biomedical Sciences and Applications. 1985. V. 345, p. 43-49).

Известен способ определения глутатиона в слюне человека методом гидрофильной хроматографии во взаимодействии с методом масс-спектрометрии, основанный на захвате глутатиона путем добавления N-этилмалеимида. Хроматографию проводили на колонке с диоксидом кремния (150 мм × 2,1 мм, 5 мкМ) с ацетонитрилом и формиатным буфером в качестве подвижной фазы при скорости потока 0,2 мл/мин. Калибровочная кривая линейна в диапазоне 0,1-100 мкМ (Y. Iwasaki, М. Hoshi, R. Ito, K. Saito and H. Nakazawa. Analysis of glutathione and glutathione disulfide in human saliva using hydrophilic interaction chromatography with mass spectrometry // Journal of Chromatography B, 2006, V. 839, №1-2, p. 74-79).

Несмотря на хорошую чувствительность и селективность определения серусодержащих соединений в биологических жидкостях организма человека и животных, перечисленные хроматографические методы имеют ряд недостатков: оборудование и растворители имеют высокую стоимость, для проведения специальной пробоподготовки требуются дорогостоящие реактивы.

Известен спектрофотометрический способ определения серусодержащих соединений, основанный на измерении общего содержания небелковых тиолов по восстановлению ими динитробензойной кислоты до тиобензойной при поглощении света 412 нм (Ellman G.L. Tissue sulfhydryl groups // Arch. Biochem. Biophys. 1959. V. 82, p. 70-81).

Недостатком способа является то, что он не позволяет проводить количественное определение суммарного содержания серусодержащих соединений с необходимой чувствительностью.

Известен спектрофотометрический способ определения серусодержащих соединений за счет образования окрашенного продукта с p-бензохиноном в области длин волн от 352 до 500 нм методом спектрофотометрии. Способ рекомендован для определения серусодержащих соединений в человеческой моче и в сыворотке крови (Dimas A.M., Zaia D.A.M., Kelly C.L., Ribas and Cassia T.B., Zaia K.C.I. Spectrophotometric determination of cysteine and/or carbocysteine in a mixture of amino acids, shampoo and pharmaceutical products using p-benzoquinone // Talanta. 1999. V. 50. №5. p. 1003-1010).

Недостатком способа является то, что, если раствор красителя замутнен или имеет нехарактерные для спектрофотометрического анализа включения, то анализ провести невозможно.

Известен способ определения глутатиона в красных кровяных тельцах человека методом капиллярного зонного электрофореза с амперометрическим детектированием на конце колонки с помощью микроэлектрода на основе амальгамы золота без предварительного концентрирования гемоглобина (Wenrui J., Wei L., Qiang X. Capillary zone electrophoresis with electrochemical detection for the determination of glutathione' in human red blood cells without preseperation of hemoglobin // J. Chrom. Sci. 2000. V. 38, №12, p. 545-549).

Недостатком способа является то, что определение возможно только при низких концентрациях гемолизата (0.5 об. %).

Известен вольтамперометрический способ определения микрограммовых количеств глутатиона, в котором используют стационарный платиновый электрод на фоне 0.05 моль/дм H₂SO₄, при этом аналитический сигнал окисления глутатиона наблюдается при потенциале +0.95 В, диапазон линейной зависимости находится в области от 9.15⋅0^-5 до 2.14⋅10^-3 моль/дм³. Нижняя граница определяемых содержаний составила 1.9⋅10^-5 моль/дм³ (Будников Г.К., Зиятдинова Г.К., Валитова Я.Р. Электрохимическое определение глутатиона // Журн. аналит. химии. 2004. Т. 59, №6, с. 645-648). Однако данный способ разработан только для модельных растворов.

Известен способ определения суммарного содержания антиоксидантов тиоловой природы в растительных объектах методом катодной вольтамперометрии (Патент РФ №2447444 от 12.10.2010), выбранный в качестве прототипа.

Сущность способа заключается в съемке катодных вольтамперограмм серусодержащих соединений с использованием стеклоуглеродного электрода при потенциале -0,4 В относительно насыщенного хлорид-серебряного электрода на фоне боратного буферного раствора с pH 9,18 при постоянно-токовой форме развертки потенциала со скоростью 0,05 В/с.

Однако, несмотря на все достоинства, данный способ реализуется только в присутствии внесения дополнительного компонента - ионов Cu²⁺, который может вносить погрешность в измерение точной концентрации серусодержащих соединений в биологических объектах. Также в процессе измерения дополнительно требуется деоксигенация раствора.

Задачей изобретения является разработка способа количественного определения суммарного содержания серусодержащих соединений в сыворотке крови человека для медицинских целей.

Способ определения суммарного содержания серусодержащих соединений в сыворотке крови человека, так же как в прототипе, включает пробоподготовку сыворотки крови и вольтамперометрическое определение суммарного содержания серусодержащих соединений на фоне боратного буферного раствора с pH 9,18.

Согласно изобретению анодную вольтамперометрию проводят с использованием индикаторного ртутно-пленочного электрода при дифференциально-импульсной форме развертки потенциала со скоростью 0,03 В/с в диапазоне потенциалов от -1,0 В до 0,05 В относительно насыщенного хлорид-серебряного электрода сравнения. Концентрацию суммарного содержания серусодержащих соединений в сыворотке крови человека от 1,0⋅10^-4 до 1,2⋅10^-3 моль/дм³ определяют по высоте пика анодного тока при потенциале -0,03 В методом градуировочного графика по стандартному раствору глутатиона.

На фиг. 1 представлены вольтамперограммы окисления стандартного раствора глутатиона от его концентрации в электрохимической ячейке (фоновая кривая в отсутствие (1) и присутствии стандартного раствора глутатиона 2⋅10^-4 моль/дм³ (2), 6⋅10^-4 моль/дм³ (3), 10⋅10^-4 моль/дм³ (4)).

На фиг. 2 представлена градуировочная зависимость тока окисления стандартного раствора глутатиона I, мкА, от его концентрации С, моль/дм³, в электрохимической ячейке с коэффициентом корреляции R, равным 0.999.

В таблице 1 представлены результаты определения суммарного содержания серусодержащих соединений в сыворотке крови здоровых людей и больных психическими расстройствами, а именно страдающими алкогольной зависимостью 2 степени.

Анализ проводят при следующих условиях: метод анодной вольтамперометрии при дифференциально-импульсной форме развертки потенциала в диапазоне от -1,0 В до 0,05 В со скоростью 0,03 В/с, трехэлектродная ячейка с индикаторным ртутно-пленочным электродом, насыщенным хлорид-серебряным электродом сравнения и насыщенным хлорид-серебряным вспомогательным электродом, боратный буферный раствор с pH 9,18 (натрий тетраборнокислый Na₂B₄O₇ с концентрацией 0.01 моль/дм) в качестве фонового раствора.

Для количественного определения суммарного содержания серусодержащих соединений в сыворотке крови человека в качестве стандартного серусодержащего вещества используют стандартный раствор глутатиона. Аналитический сигнал окисления глутатиона при анодной развертке потенциала регистрируют в диапазоне потенциалов от -0,2 В до 0,05 В (фиг. 1). Определение концентрации суммарного содержания серусодержащих соединений в сыворотке крови проводят по высоте пика анодного тока при потенциале -0,03 В методом градуировочного графика по стандартному раствору глутатиона. Градуировочная зависимость является линейной в области определяемых концентраций суммарного содержания серусодержащих соединений в сыворотке крови человека, которая составляет от 1,0⋅10^-4 до 1,2⋅10^-3 моль/дм³ (фиг. 2).

Количество суммарного содержания серусодержащих соединений в сыворотке здоровых людей варьируется в пределах (2,8±0,02) 10^-4 моль/дм³.

Пример. Для определения суммарного содержания серусодержащих соединений в сыворотке крови здоровых людей и больных психическими расстройствами первоначально отбирали кровь из локтевой вены.

Донорами «контрольной» группы являлись 50 здоровых людей в возрасте до 40 лет мужского пола (без видимых патологий). Группа «патология» включала 50 пациентов мужского пола в возрасте от 23 до 42 лет с психическим расстройством (диагноз: синдром алкогольной зависимости 2 степени).

У пациентов с диагнозом алкоголизма для отслеживания изменений состояния в динамике забор крови проводили двукратно с интервалом в 10 дней. У здоровых добровольцев забор крови проводили однократно.

Венозную кровь, полученную без антикоагулянтов, помещали в центрифужную стеклянную пробирку и отстаивали при комнатной температуре в течение 30 минут до полного образования сгустка. По окончании образования сгустка с помощью тонкой стеклянной палочки проводили отделение столбика сгустка от стенок пробирки. Сыворотку сливали в другую пробирку, которую подвергали центрифугированию в настольной лабораторной центрифуге в течение 10 минут при скорости вращения 2000 об/мин. После центрифугирования образцов произвели отбор сыворотки в пробирки Эппендорфа и маркировали образцы. Центрифугат отбирали в объеме 1,0-1,5 см для дальнейшего исследования.

В электрохимическую ячейку вносили раствор фонового электролита (10 см). В качестве фонового электролита использовали боратный буферный раствор с pH 9,18 (натрий тетраборнокислый Na₂B₄O₇ с концентрацией 0.01 моль/дм). Трехэлектродная ячейка состоит из индикаторного ртутно-пленочного электрода, насыщенного хлорид-серебряного электрода сравнения и насыщенного хлорид-серебряного вспомогательного электрода. Электроды опускали в раствор фонового электролита и подключали к вольтамперометрическому анализатору (ТА-2, ООО Томьаналит, Томск). Использовали постоянно-токовый режим анодной вольтамперометрии, скорость развертки потенциала 0,03 В/с, рабочий диапазон потенциалов от -1.0 В до 0.05 В, время перемешивания раствора 10 с, время успокоения 20 с. Регистрировали фоновую анодную вольтамперограмму, отсутствие посторонних пиков свидетельствует о чистоте фона.

Затем в электрохимическую ячейку с раствором фонового электролита вносили аликвоту (0,5 см³) сыворотки крови и снимали вольтамперограмму при тех же условиях. Регистрировали анодный пик в диапазоне потенциалов от -0,2 В до 0.05 В. Концентрацию суммарного содержания серусодержащих соединений в сыворотке крови определяли методом градуировочного графика по стандартному раствору глутатиона по высоте пика анодного тока при потенциале -0,03 В.

Количество суммарного содержания серусодержащих соединений в сыворотке здоровых людей варьируется в пределах (2,8±0,02) 10^-4 моль/дм³, что ниже, чем у больных психическими расстройствами (таблица 1).

Предложенный способ определения суммарного содержания серусодержащих соединений в сыворотке крови человека отличается простотой, не требует больших трудозатрат, значительного количества реактивов. Оценка суммарного содержания серусодержащих соединений, используя метод градуировочного графика, отличается высокой селективностью и чувствительностью определения.

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СУММАРНОГО СОДЕРЖАНИЯ СЕРУСОДЕРЖАЩИХ СОЕДИНЕНИЙ В СЫВОРОТКЕ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА